高分辨溶解(HRM)分析
高分辨率熔解曲线分析(HRM)及其在植物种质资源鉴定中的应用
摘要 ： 饱和 荧光染料 、 未标记探 针 与 实时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ结合产 生 的
关键词 ： 高分辨率 熔解 曲线分析 ； 种 质鉴定 ； Ｓ Ｓ Ｒ；Ｓ Ｎ Ｐ
中图分类号 ： Ｓ３ ３ ０ 文献标志码 ： Ａ
文章编号 ： １ ０ ０ １ — ４ ７ ０ ５ （ ２ ０ １ ３ ） １ ０ － ０ ０ ５ ７ － ０ ４
高分 辨 率 熔 解 曲线 分 析 （ Ｈｉ ｇ ｈ Ｒ ｅ ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｍｅ ｌ ｔ ｉ ｎ ｇ Ｃ ｕ ｒ ｖ ｅ Ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ， Ｈ Ｒ Ｍ） 是在实时荧光定量 Ｐ Ｃ Ｒ基 础 上 发展起 来 的一 项新 技术 。 目前 ， Ｈ Ｒ Ｍ 分 析 的应 用 领域
因型 。
多态 ） 分析 、 突变扫 描 、 甲基 化 分析 、 基 因分 型 、 序列 匹
配等研究 ， 近年来 已成 为生命科 学研究 中的热点技 术 … 。在植 物种 质 资源 研 究 中 ， 高 分 辨 率熔 解 曲 线分
析 的应 用 已经 逐步 开展 ， 主要 用 于植 物遗 传 图谱 构建 、 基 因定 位 与标 记辅 助 选 择 、 突 变 检 测 及 种 质 鉴 定 等研
究 Ｊ 。本文对高分辨率熔解 曲线 分析的原理 、 特点及 其在植物种质资源鉴定 中的应用进行综述 ， 并 对该技 术在种质资源鉴定 中的应用前景进行展望。
高分辨率熔解 曲线分析 （ Ｈ Ｒ Ｍ） 技术 的成 功主要 取决 于 ２个方 面 的 因素 ： 饱 和 荧 光染 料 和 高 分 辨率 的 检测 仪器 ２ ’ 。荧 光染 料包 括 非 饱 和荧 光 染 料 和饱 和
HRM高分辨率熔解曲线分析技术--百替生物
TM值：当前温度下50%的双链解链为单链
HRM
RealTime PCR
பைடு நூலகம்
HRM与RealTime PCR的异同点：
需要加入荧光染料
检测获取荧光信号
•采用的染料类型不同（Sybr和LC）
•荧光信号检测时机不同
•分辨率不同
•数据处理方式不同
饱和染料有效避免了检测荧光信号中的假阳性
新的饱和染料降低了传统染料对PCR反应的抑制作用
HRM在甲基化中的应用
甲基化是蛋白质和核酸的一种重要修饰，对调节基 因表达，癌症、老年痴呆等许多疾病相关，因此检测甲 基化在医学领域中具有重要作用。 利用亚硫酸氢盐将未甲基化的DNA中的胞嘧啶转换 成尿嘧啶之后，处理过的DNA产物将比甲基化的DNA 产物的TM值要低，通过HRM可以将二者区分开来。
位于第六号染色体的短臂6P21.31区，长3600KB，根据功 能和产物结构的不同分成3组：经典HLA基因、免疫功能相关 基因和免疫无关基因。其中经典HLA基因与输血和移植急性排 斥反应密切关联。
在器官移植中，通过检测样本的HLA，以便了解样本组织与 宿主是否相容。利用HRM技术，直接观察溶解曲线，可以迅速 的找到最匹配的器官组织，为挽救患者的生命争取宝贵的时间。
1.整体操作方法简单，检测灵敏度高，可检测出单个碱基的改 变，检测效率高，5-10分钟即可完成对96/384孔板的检测。
2.从PCR到检测荧光信号，整个过程在同一个管中进行，最大
程度的避免了污染。 3.无需事先知道突变位点，无需设计探针，大大简化实验设计 时间和研究成本。
HRM在医学领域中应用：
1)疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的扫描，新突 变的发现 2) HRM在序列配对中的应用。
high resolution melting analysis -回复
high resolution melting analysis -回复高分辨融解分析高分辨融解分析（High Resolution Melting Analysis，简称HRM）是一种快速、灵敏和高通量的核酸序列变异检测技术。
它通过监测核酸序列的熔解曲线形态改变来检测样品中的序列变异。
HRM技术在基因组学研究、遗传学研究以及临床诊断中被广泛应用。
在HRM分析中，样品中的核酸序列首先通过PCR扩增生成多份复制品。
然后，通过升高温度使PCR产物的双链结构断裂，使其变成两个单链结构。
当温度降低时，单链结构会重新组装成双链结构。
在该过程中，不同的核酸序列拥有不同的熔解温度和熔解曲线形状。
为了实现高分辨度融解分析，需要使用专用的荧光染料，能与DNA结合，并且在细微温度变化下发出荧光信号。
常用的荧光染料包括SYBR Green 和Laser Dye。
这些荧光染料的特点是其荧光信号与温度呈现不同的强度和形态。
通过监测这些信号的变化，可以确定PCR产物的融解曲线。
在进行HRM分析之前，首先需要选择合适的引物，以确保特异性扩增。
引物的设计需要避免引物间的相互作用，以及避免引物结合到非特异序列上。
此外，也需要考虑到引物的长度、GC含量和熔解温度。
在进行HRM分析实验时，首先需要对样品中的DNA进行提取和纯化。
然后，通过PCR扩增特定的片段。
扩增反应通常包含引物、DNA模板、核酸酶和聚合酶。
PCR反应温度通常包括一个初始的变性步骤（通常在95C），以打开DNA双链结构，然后是一系列的循环步骤，包括变性、退火和扩增。
在退火步骤中，引物结合到目标DNA上，确定扩增目标。
扩增反应完成后，通过升高温度来实现PCR产物的熔解。
温度升高时，单链DNA会分离并形成两个单链DNA。
熔解过程中，荧光染料的荧光信号会随着温度的增加而增强。
通过监测荧光信号的强度和形态，可以得到PCR产物的熔解曲线。
接下来可以通过HRM分析软件来分析和解释熔解曲线。
hrm高分辨率溶解曲线实验流程
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高分辨率溶解度分析法(HRM)
Why all the excitement?
• Lower cost alternative to TaqMan • Can be performed with relatively low cost equipment • Multiple applications possible • Particularly suited to certain situations:
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Primer design DNA preparation Assay Optimisation Troubleshooting
Overview of HRM Applications
• SNP Genotyping
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Use HRM to identify known variants Confirm results with real-time TaqMan assays
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HRM for Routine Genotyping
• Cautions:
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New HRM assays should always be validated to the comparable TaqMan assay before being used. HRM has a much higher design and amplification failure rate and requires more repeated samples to be run. HRM assays are more costly to develop and optimize compared to off the shelf TaqMan assays. HRM genotyping assays should always use known controls for all genotypes. The genotype of each control should be confirmed by TaqMan assay or DNA sequencing . Any uncertain/equivocal results should be confirmed by TaqMan assay or DNA sequencing.
高分辨率熔解HRM简介
高分辨率熔解HRM简介早在上世纪六十年代，双链DNA的熔解靠吸光度监测，数微克的DNA样品以每分钟0.1-1.0℃的速度缓缓加热，待直至数小时后完成熔解。
随后出现的利用荧光检测互补双链DNA是一个更灵敏的方法，这种方法需要先进行PCR富集DNA产物，它的流行得益于1997年问世的实时定量PCR仪Light- Cycler®。
毛细管进样和小样品体积保证了良好的温控效果，使得熔解速率大大加速到每秒钟0.1-1.0℃。
高分辨率熔解分析High Resolution Melting (HRM)于2003年发明，是一项近年来备受关注的创新的技术，实现了通过研究PCR产物依赖于序列的熔解温度而对PCR产物进行鉴定。
可用于检测样品中存在的双链DNA的单核苷酸多态性（SNPs）基因变异（Mutation）、多态性（Polymorphisms）和表观遗传学（Epigenetic）差异。
HRM分析技术的神奇之处在于它是基于对核酸双链高温熔解行为的实时监测，仅仅是在普通荧光PCR之后加一步闭管的熔解步骤，操作简便，样品可随着其本身的序列、长度、GC 含量及双链互补程度不同而被区分开。
因此，甚至是单个碱基如SNPs也可轻易被鉴定出。
原则上来说，HRM分析技术的发展得益于三项技术上的进步：1. 1. 发现了新一代的对DNA无抑制作用的饱和染料（如LC Green Plus，Resolight等）；2. 2. 高度精密的荧光监控光学系统的问世；3. 3. 发明了能够对熔解状况进行细致分析的新算法。
高分辨率熔解分析最重要的应用是基因扫描，相比传统基因分型技术，HRM具有许多优势：1. 1. 省钱—相比较测序和Taqman® SNP分型技术，HRM更适合于大规模基因分型项目；2. 2. 快速—能够在更短时间内精确分型；3. 3. 简单—易上手操作，可在高分辨率的荧光PCR仪上方便实现。
由于突变导致的突变样本熔解曲线相对于参考样本的变化是可以明显识别出来的。
高分辨熔解曲线(HRM)
高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM) 分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。
它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。
HRM 原理HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。
同许多荧光PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。
如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。
随着高精度PCR 仪（LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000）和饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。
HRM 特点由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。
基于这种检测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规PCR 基础上增加一个饱和染料。
所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。
high resolution melting analysis -回复
high resolution melting analysis -回复什么是高分辨融解分析（High Resolution Melting Analysis, HRM）？高分辨融解分析（High Resolution Melting Analysis, HRM）是一种基于DNA的分析技术，用于检测DNA中的序列差异，如突变、多态性等。
它是一种快速、灵敏且经济高效的方法，通常用于基因突变筛查、SNP检测、基因分型等应用。
HRM利用DNA的特性，通过热反应中DNA双链解旋和再结合过程中的温度变化，来测定样品中的DNA序列。
这个过程涉及到将DNA样品在逐渐升高的温度下加热，随后监测染料的强度变化。
在整个过程中，DNA 会在特定融点温度下解旋形成单链DNA，再在高温下结合成双链DNA。
在温度梯度中，样品中的DNA序列相异点（突变、多态性等）会导致其在特定温度下有所不同的解旋和结合行为，从而导致曲线的形态和位置产生变化。
HRM的原理和步骤是什么？在HRM的实验中，需要进行一系列样品预处理、PCR扩增和融解分析。
首先，需要从样品中提取DNA，并对DNA进行质量和浓度的测定。
合适的DNA浓度对于反应的准确性和可靠性至关重要。
其次，进行PCR扩增反应。
在PCR反应中，根据待测序列的特点，选择适当的引物对DNA进行扩增，以增加待测序列（突变、SNP等）的相对丰度。
PCR反应中的温度梯度逐渐升高，使DNA经历一系列变性和重结合过程。
然后，在PCR扩增结束后，立即开始融解分析阶段。
在这个阶段，通过逐渐升高的温度，从低到高，融解PCR产物中的DNA双链结构。
同时，使用特定染料（通常是SYBR Green）来标记DNA，在特定温度下监测染料的荧光强度变化。
根据不同样本的DNA序列差异，特定的融点曲线形态和位置将发生变化。
通过分析融点曲线的形状、峰的位置和强度，可以判断样品中的DNA序列是否存在突变等差异。
HRM的优点和应用领域是什么?HRM具有以下几个优点：1. 高灵敏度和特异性：HRM可以检测到DNA序列中极小的差异，并能够区分相同长度但不同序列的DNA。
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HR-1
HR-1仪器是美国Idaho公司采用精确温度控制 技术，并结合高速的数据采集技术，配合使用 高分辨的饱和LC Green荧光染料，使该仪器 具有较高的灵敏度和特异性。分析时不消耗被 测PCR产物样品，分析结束后PCR产物可用 于下游的分析，如测序等。
HR-1特点：
• 升温速率： 0.01 ℃ -1 ℃ / 秒 • 数据采集密度： 100 个数据 / ℃ • 使用 LC Green 荧光染料 • 反应体系 5-20ul • 分析时间： 40-45 样品 / 小时（基于 0.3 ℃ / 秒升温速率）
2、HLA(人类白细胞抗原 ) 基因组配型 器官移植的 HLA 配型、同胞之间 HLA 基因 型确定，如快速确定 HLA 高度多态性位点的 类型，及非亲源关系个体间异源造血干细胞移 植前的 HLA 基因型确认 。
3 、等位基因频率分析 4 、物种鉴定、品种鉴定 1 ） 微生物品种、物种快速鉴定。 2 ） 动植物品种鉴定。 5 、甲基化研究 1 甲基化位点的筛查。 2 甲基化程度分析。 用 HRM 方法检测启动子区域内的甲基化，可检测低达 0.1% 的甲基化程度；并根据已知甲基化程度的标准曲线对未知 样品的甲基化百分比进行测定。 HRM 是一种高灵敏度的甲基化 检测方法，并且其高度的重复性和低成本将对肿瘤的研究和临床 应用有很大帮助。
6 ．法医学鉴定、亲子鉴定。 检测单核苷酸多态性 SNP 鉴定，插入 / 缺 失多态性 DIP 鉴定等 将 HRM 用于法医学 SNP 、 DIP 鉴定，协 助犯罪鉴定，亲子鉴定。相对于传统鉴定方法， HRM 是一种简单、便宜、高通量的二等位基 因分子标记鉴定的方法
HRM 的应用领域
1 、基因的突变扫描：检测杂合子 SNP 、区段 / 碱基缺 失、前后重复、杂合子缺失。 相关研究方向： 1 ） 样本中特定突变位点（ SNP ）的筛查，包括一 个片段中多个位点的复合杂合突变的Genotyping。 2 ） 疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的 扫描，新突变的发现。 3 ） 遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。 4 ） 植物抗逆性，突变与性状关联性的研究。 5 ） 动植物品质相关多态性位点的研究等。
但是当时这种熔解分析只能区分在片段大小 和GC含量上差别较显著的DNA序列，比如检 查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其他 非特异性的扩增。如果要区分SNP，分辨率还 不够。
饱和染料和非饱和染料
非饱和染料 对PCR有抑制作用，在实验中的使用浓度 很低，远未将DNA双螺旋结构中的小沟饱和。 这样，DNA双链高温变性时，单链部分的荧光 染料分子发生重排，荧光染料分子重新结合到 双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化， 因此出现假阴性，特异性下降
双链DNA的熔解分析可追溯到上世纪六十年代， 当时是通过紫外吸收来监测的。分析需要几微 克的DNA，而样品以0.1-1.0°C/分钟的速率 缓慢加热，常常要花上几个小时才能完成。后 来，LightCycler定量PCR仪的出现，让荧光熔 解分析变得流行。样品量因毛细管而缩减至纳 克级，且熔解速率更快，达0.1-1.0°C/秒，这 样熔解时间缩短至几分钟。当时使用的染料是 SYBR® Green I。
饱和染料 对PCR没有影响，高浓度的染料饱和了DNA 双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就 不会发生重排，这样熔解曲线才有了更高的分 辨率。目前市场上的饱和染料主要有LC Green、LC Green Plus、SYTO 9等几种
HRM分析仪
目前市场上有多个厂家提供HRM分析的仪器，包 括Idaho Technology、Corbett（QIAGEN）、Roche 等，有些是专供HRM的仪器，有些则是附带HRM功 能的定量PCR仪 HRM的发明者—美国犹他大学医学院的Wittwer 实验室曾评估了市场上多台仪器在基因分型和突变扫 描上的性能。他们发现，对于大部分仪器的准确基因 分型来说，主要限制在于平板上的空间温度差异（Tm 的标准偏差为0.020-0.264°C）。其它差异如数据密 度、信噪比和熔解速率，也会影响杂合体的扫描。经 过比较发现，空气加热型仪器以及样品温度单独控制 的仪器有着更低的Tm标准偏差（0.018-0.065），而 加热块型仪器则在0.092-0.274。
第二课 高分辨溶解（HRM）分析
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高分辨率熔解（High-resolution melting，简 称HRM）分析是一门新兴的技术。它仅仅通 过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR 片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、 序列配对和基因分型等多个方面
一、原理
PCR扩增产物的熔解曲线完全取决于DNA碱基序 列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA 链的解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏 度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。 HRM分析采用高精密仪器，在拥有饱和染料和高 分辨率仪器之后，对 PCR的扩增子进行加热，温度从 50°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐 解链，在到达熔解温度（Tm）时，DNA链分开，荧 光强度迅速降低。在HRM分析的初期，荧光强度很高， 随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下 降了。HRM仪器通过照相机，记录下荧光变化的整个 过程。通过对数据的作图，就生成了熔解曲线。
Байду номын сангаас
双链DNA的熔解分析可追溯到上世纪六十年代， 当时是通过紫外吸收来监测的。分析需要几微 克的DNA，而样品以0.1-1.0°C/分钟的速率 缓慢加热，常常要花上几个小时才能完成。后 来，LightCycler定量PCR仪的出现，让荧光熔 解分析变得流行。样品量因毛细管而缩减至纳 克级，且熔解速率更快，达0.1-1.0°C/秒，这 样熔解时间缩短至几分钟。当时使用的染料是 SYBR® Green I。