高分辨溶解曲线突变检测
高分辨熔解曲线
高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。
它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。
HRM 原理HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。
同许多荧光 PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。
如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。
随着高精度PCR 仪（LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000）和饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。
HRM 特点由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。
基于这种检测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规 PCR 基础上增加一个饱和染料。
所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。
应用高分辨熔解曲线分析技术检测β-地中海贫血基因突变
ｔ ｈ ａ ｌ ａ ｓ ｓ ｅ ｍｉ ａ ｇ ｅ ｎ ｅ ｍｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｔｈ ｅ ＨＲＭ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｗａ ｓ ｕ ｓ ｅ ｄ ｔ ｏ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｆ ｉ ｖ ｅ ｋ ｉ ｎ ｄ ｓ ｏ ｆ ｃ ｏ ｍｍｏ ｎ ８ 一 ｔ ｈ ａ ｌ ａ ｓ ｓ ｅ ｍｉ ａ ｍｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ（ 一 ２ ８，
王晶晶， 许朝旭， 彭 红 波
（ 广 州 市 番 禺 区 何 贤 纪 念 医 院检 验 科 ， 广 东广 州 ５ １ １ ４ ０ ０ ）
摘 要 ： 目的 探 讨 高 分辨 熔解 曲线 （ ＨＲＭ） 分析 技 术检 测 Ｂ 一 地 中海 贫 血 基 因突 变 的 可 行 性 。 方 法 应 用 ＨＲ Ｍ 法检 测广 东
Ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｈ ｉ ｇ ｈ ｒ ｅ ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ ｍｅ ｌ ｔ ｉ ｎ ｇ ｃ ｕ ｒ ｖ ｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｉ ｑ ｕ ｅ ｉ ｎ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｐ ＿ ｔ ｈ ａ ｌ ａ ｓ ｓ ｅ ｍｉ ａ ｇ ｅ ｎ ｅ ｍｕ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ
ＨＲ Ｍ 法能 准确 检 测 广 东省 ５种 常见 的 ０ 一 地 中海 贫 血 突 变 ， 具有简
便、 快速 、 灵敏度高等优点 ， 有 望 成 为 临床 筛查 Ｂ 一 地 中海 贫 血 突 变 的 新 方 法 。 关键词 ： Ｂ 一 地 中海 贫 血 ； 基 因突变； 高 分 辨 溶 解 曲 线
高分辨率溶解曲线分析
高分辨率溶解曲线分析概述高分辨率溶解曲线分析是一种广泛应用于生物学领域的分析技术，特别适用于检测基因表达、基因多态性、SNP位点以及DNA结构等。
该技术通过对双链DNA在不同温度下的解离曲线进行测定和分析，可以用来定量评估样品中特定序列的数量和质量。
原理高分辨率溶解曲线分析的原理基于PCR扩增反应后的DNA解离动力学。
在PCR扩增过程中，双链DNA会在高温下解开成两条单链DNA。
随后，在降温过程中，两条单链DNA会重新结合形成双链DNA。
在这个过程中，如果样品中存在特定的序列差异（如基因多态性或SNP位点），它们的解离和结合过程会发生略微的差异，这些差异可以通过溶解曲线分析来检测和分析。
溶解曲线分析一般通过添加DNA染料（如SYBR Green）来实现，该染料可与DNA结合并发出荧光信号。
在PCR扩增反应后，样品中的DNA会逐渐增加，溶解荧光信号也会随之增强。
在降温过程中，不同的PCR产物的解离过程会导致荧光信号发生变化。
通过监测溶解曲线上的荧光信号强度，可以得到不同PCR产物的解离温度，进而从中推断样品中的目标序列的数量和质量。
实验步骤高分辨率溶解曲线分析通常包含以下几个步骤：1.PCR扩增反应：根据需要扩增的目标序列设计引物，并进行PCR扩增反应。
PCR反应体系中添加SYBR Green或其他DNA染料。
2.热变性：PCR扩增反应后，将样品在高温下进行变性，通常为95°C。
3.降温：将样品温度降低到特定的温度范围，通常为60-95°C，并持续监测荧光信号的强度。
4.溶解曲线分析：根据荧光信号强度和温度的变化关系，绘制溶解曲线图。
通过比较样品中特定序列的解离温度，可以评估目标序列的数量和质量。
5.数据分析：根据溶解曲线图，可以使用特定的软件或算法对数据进行定量分析。
常见的分析方法包括计算解离温度、判断PCR产物的品质以及定量评估样品中的目标序列含量。
应用高分辨率溶解曲线分析在生物学研究中有广泛的应用。
高分辨率熔解曲线及其在分子诊断中的应用
二 、 Ｒ 在分子 诊 断 中的应用 Ｈ Ｍ Ｈ Ｍ 能够 在 没有 标 记 荧 光 探 针 的情 况 下 分 Ｒ 析单个 碱 基 的变 化 。假 如 扩 增 子 包 含 有 一 Ｓ Ｐ Ｎ 位点 Ａ＞Ｃ， 可 能 出现的 双链结 构 为 ２条纯 合双 则 链（ ／ Ａ Ａ和 Ｃ Ｃ） ２条 杂化双 链 （ ／ ／ 和 Ａ Ｔ和 Ｃ Ｇ） ／ ，
结 合 如要 达到饱 和 ， 必须 高浓度 加入 ， 过高 浓度 但
会 抑制 Ｐ Ｒ反 应 ， Ｃ 而饱 和 染 料 不抑 制 Ｐ Ｒ反 应 ， Ｃ 因此 占据 了双链 Ｄ Ａ 的所 有 碱基 对 ， 外 ， Ｎ 此 当双 链 Ｄ Ａ局部解 链 时 ， 离下 来 的染 料 亦不会 重 新 Ｎ 游
文献标 志码： Ａ
高 分 辨 率 熔 解 曲线 及 其 在 分 子 诊 断 中的应 用
沈 薇 综述 ， 傅 启华 审校 （ ．上海 交 通大学 医 学院 附属仁 济 医院检 验科 ， １ 上海 ２ ０２ ； ０ １７ ２ ．上海 交通 大学 医学 院附属 上海儿 童 医学 中心检 验科 ， 上海 ２０２ ） ０ １７ 通 过 加热使 双链 Ｄ Ａ解离 为单链 是 Ｄ Ａ基 Ｎ Ｎ 本 特性 之 一 ， 分 辨 率 熔 解 曲 线 （ ｉ ｅｏｕｏ 高 ｈｇ ｒｓｌｔｎ ｈ ｉ
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息 ， 如 突 变 、 核 苷 酸 多 态 性 （ｉｇ ｕｌ ｔ ｅ 例 单 ｓ ｌ ｎｃｅ ｉ ｎｅ ｏｄ
HRM
Applied Biosystems7500荧光定量PCR新应用HRM(高分辨率溶解曲线)的高通量基因突变扫描Enid M.ZhaoApplications Specialistcnmcbsupport@Contents●HRM应用的3个特点:●与常规SYBR Green溶解曲线功能相比,HRM的特点:原理熔解曲线7500Software v2.0●New look for the7500and7500Fast Systems with new,moreuser-friendly v2.0software andHRM*capability●Improvements to existing SDSv1.4workflows●Additional features includinggene expression study package ●Versatile interfaces to suitexperienced customers and new users*HRM–High Resolution Melting饱和性染料例如LC Green®Spectra vsSYBR®Green化学:纯荧光谱FAM dye Saturating Dye1 ROX dye SYBR Green dye2.仪器:HRM在溶解曲线阶段要求高捕获率Regular Dissociation High Resolution Dissociation Capture rate~0.2-0.5°C Capture rate~0.1-0.02°C3.HRM数据分析–荧光标准化和生成等位基因特定曲线的温度变化数据工作原理?杂合子样本融解曲线读取高分辨率溶解曲线标准溶解曲线●每个孔扩增产物有一个Tm值HRM图形HRM的发展特点和优势应用应用应用HRM on7500fastHRM on7500fast简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程简便的操作流程7500fast HRM应用举例7500fast HRM应用举例Thanks for your attention cnmcbsupport@ 。
高分辨荧光熔解曲线法检测脊肌萎缩综合症SMNt基因7号外显子缺失
高分辨荧光熔解曲线法检测脊肌萎缩综合症SMNt基因7号外显子缺失欧志英;李丽霞;刘丽;夏慧敏;龚四堂;王凤华;尹应先【摘要】目的探讨高分辨荧光熔解曲线分析在SMNt基因7号外显子缺失检测中的应用. 方法用高分辨荧光熔解曲线分析方法分析脊肌萎缩综合症SMNt基因7号外显子纯合缺失、SMNc基因7号外显子纯合缺失及未见SMNt、SMNc完全缺失三种情况. 结果高分辨荧光熔解曲线分析方法能很好地区分SMNt基因7号外显子纯合缺失、SMNc基因7号外显子纯合缺失及未见SMNt、SMNc完全缺失三种基因型,与基因测序方法所得的结果完成一致. 结论高分辨荧光熔解曲线法可用于脊肌萎缩综合症SMNt基因7号外显子缺失检测,具有快速、准确、可靠的特点.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2011(003)005【总页数】3页(P300-302)【关键词】脊肌萎缩综合症;高分辨荧光熔解曲线;基因缺失;DNA序列分析【作者】欧志英;李丽霞;刘丽;夏慧敏;龚四堂;王凤华;尹应先【作者单位】广州市妇女儿童医疗中心新生儿外科,广东,广州510623;广州市妇女儿童医疗中心新生儿外科,广东,广州510623;广州市妇女儿童医疗中心新生儿外科,广东,广州510623;广州市妇女儿童医疗中心新生儿外科,广东,广州510623;广州市妇女儿童医疗中心新生儿外科,广东,广州510623;广州市妇女儿童医疗中心新生儿外科,广东,广州510623;广州市妇女儿童医疗中心新生儿外科,广东,广州510623【正文语种】中文脊肌萎缩综合症（spinal muscular atrophy，SMA）是一类脊髓前角运动神经元退行性病变所致肌无力与肌萎缩的常染色体隐性遗传病，高加索人群发病率约为1/10000，居致死性常染色体隐性遗传病的第2位，亚洲人携带者频率约为1/56。
SMA主要病理改变表现为脊髓前角运动神经元变性。
运动神经元存活基因SMN与SMA关系密切，是脊肌萎缩综合症的主要致病基因，位于5q13.3区域的两个高度同源的SMN基因，分别位于端粒侧（SMN-t）与着丝粒侧部位（SMN-c）。
人力资源知识高通量低成本SNP突变或甲基化检测方法—HRM技术应用
（人力资源知识）高通量低成本SNP突变或甲基化检测方法—HRM技术应用高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法—HRM技术应用HRM介绍HRM技术是high-resolutionmeltinganalysis即高分辨熔解曲线分析技术，是近年国外兴起的壹种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
基于高效稳健的PCR技术，HRM不受突变碱基位点和类型局限，无需序列特异性探针，于PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-S NP、甲基化、HLA配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。
HRM原理HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均壹性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。
随着高精度PCR仪（LightCycler®480和Rotor-Gene6000）和饱和染料（LCGreen、EvaGreen等）的出现，HRM技术的普及使用成为可能。
HRM应用•SNP（单核苷酸多态性）的筛查。
•基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。
•新突变的筛查。
•甲基化的筛查。
•遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。
•HLA基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。
•法医学鉴定、亲子鉴定。
•动植物品质关联多态性位点的研究等。
植物抗逆性，突变和性状关联性研究。
HRM特点•高通量：1次可同时检测10-384样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。
•高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。
检测灵敏性远高于“PCR+测序”的25%，即100个正常细胞中至少有25个突变细胞，测序仅适用手术组织。
高分辨率熔解曲线技术常用的仪器和荧光染料
高分辨率熔解曲线技术常用的仪器和荧光染料郭心灵;尤崇革【摘要】高分辨率熔解曲线技术(HRM)是近年来发展迅速的一项用于基因突变扫描与检测的新技术.由于具备快速、简便、价廉、高通量和闭管均相检测等优点,HRM已被广泛地应用于突变基因的扫描、基因分型、遗传配型以及法医学鉴定等领域,并受到越来越多的关注且发展迅速.本文就该技术常规应用时的相关仪器与荧光染料的发展及应用进行分析总结.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2012(004)001【总页数】4页(P50-53)【关键词】高分辨率熔解曲线技术;聚合酶链反应;荧光染料;PCR仪【作者】郭心灵;尤崇革【作者单位】兰州大学第二医院中心实验室,甘肃,兰州730030;兰州大学第二医院中心实验室,甘肃,兰州730030【正文语种】中文高分辨率熔解曲线技术（high resolution melting，HRM）是美国Utah大学Wittwer实验室在2003年首次提出的基于新型饱和荧光染料LC Green的发明而进行基因突变检测的新技术[1]。
其基本原理就是利用与荧光染料结合的双链DNA 在温度升高的过程中会发生减色效应的物理性质，通过检测双链DNA在熔解过程中释放的染料荧光信号所形成的特征熔解曲线，进行PCR产物中核苷酸差异的鉴别。
该技术的应用不仅需要饱和荧光染料，而且更需要能进行高分辨检测的定量PCR仪。
近年来用于HRM技术的仪器和染料都在不断更新，朝着操作简便化、试剂专业化的方向发展，在常规检测、疾病诊断、实验室研究、前沿问题研究等方面发挥着重要作用[2,3]。
目前HRM技术可用于基因突变扫描、遗传配型、细菌分型和多重基因分型等领域[4,5]。
本文就HRM技术的常规开展所需要的相关仪器与荧光染料进行综述。
1 HRM仪器常规定量PCR仪由于温控不够灵敏、分辨率不够高及其熔解曲线无法区分熔解温度上差异很小的序列（如单核苷酸多态性、单碱基插入/缺失等），所以不能用于HRM分析。
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高分辨熔解曲线突变检测
高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。
该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。
HRM原理
HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。
在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green 在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。
不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。
因此不能用于熔解曲线的检测。
而LC Green (Idaho)是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。
HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在Lightscanner仪器（Idaho）升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。
HRM的特点和应用
HRM应用：
•检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁
•鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变
•基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失
•特定突变、多态性位点的筛选
•外显子和短扩增子基因型扫描
HRM特点：
•灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。
如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。
•特异性好：HRM的特异性可以达到90-100%。
短的扩增子特异性要更高
•不受碱基位点局限，适用范围广
•在封闭的试管内进行，可降低污染操作简单
•成本低廉、时间少、误差小、高通量检测
•检测的样品范围广：HRM检测片段范围在38-1000bp不同来源的样品都可以用于HRM如血粉、口腔细胞、冷冻的肿瘤样品、也可用于酒精固定、福尔马林固定或石蜡包埋的组织等，在人类遗传性疾病的研究中，通常用周边血液淋巴细胞中提取DNA，用于HRM分析。
HRM：实验设计中需要考虑的问题
•高效的扩增方案的设计对于HRM的成功至关重要。
最大的灵敏度和特异性有助于最佳的PCR结果的产生，同时扩增子的溶解特性对于结果也非常重
要。
这取决于引物的设计和引物的位置。
•在实验结果中有时会出现假阳性，这时可以通过调整引物或者扩增参数避免出现假阴性的结果。
•样品的质量对特异性有一定的影响，因此，进行HRM分析时要选用高质量的样品。
总结
HRM灵敏度高、特异性好
该方法是在封闭的试管内进行，可降低污染，因此，该技术具有操作简单、成本低廉、时间少、误差小、高通量检测的优点。
是进行突变扫描的首选方法。