高分辨率溶解曲线HRM突变筛查和基因分型系统
高分辨熔解曲线
高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。
它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。
HRM 原理HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。
同许多荧光 PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。
如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。
随着高精度PCR 仪（LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000）和饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。
HRM 特点由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。
基于这种检测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规 PCR 基础上增加一个饱和染料。
所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。
高分辨率溶解曲线简介资料
高分辨率溶解曲线简介(2011-09-01 11:30:50)转载▼标签：杂谈高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称 HRM ，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。
HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。
其中，主要的研究方向集中在： 1 、基因未知突变以及 SNP 的扫描； 2、已知突变及 SNP 的基因分型； 3、动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定； 4 、法医鉴定、亲子鉴定； 5 、HLA 的配型； 6 、甲基化的研究等。
一、HRM技术的基本原理：HRM 技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。
不同核酸分子的片段长短、 GC 含量、 GC 分布等是不同的，因此任何双链 DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。
以二倍体细胞为例，当纯和子样品通过 PCR 扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图一 A 。
而杂合子 PCR 扩增完，经过变性复性后，样品中会形成部分的含有非沃森 - 克里克配对的双链分子存在。
图一： A ：纯合子样品 B ：杂合子样品如图一 B 所示，杂合子样品扩增后，经变性复性，会有非配对碱基的形成，而纯合子样品没有。
这样，杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，表现在解链温度上就会有微小的差别。
如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而成功的筛选出纯合子与杂合子。
下图是杂合子样品熔解曲线的的示意图：图二：杂合子样品的熔解曲线为四种不同双链的熔解曲线的叠加的结果。
以二倍体细胞为例，杂合子扩增后通过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双链的混合物，在熔解过程中四种链会形成一条独特的溶解曲线，从而与纯合子的熔解曲线区分出来。
高分辨率溶解曲线HRM突变筛查与基因分型系统课件
Small Amplicon Genotyping 扩增小片段直接进行基因型鉴定
•使用已知Tm值的双链DNA做温 度内标，低温内标Tm(~61℃) ,高 温内标Tm (~92 ℃) •内标能够实现96/384孔板的温度 均一矫正。
•PCR片段的Tm值范围： 70-88 ℃
•优点：不需要探针，直接利用 PCR产物针对已知突变位点进行 基因分型
为何要使用温度内标
A>T SNP without Calibration – 72bp
Apply Temperature Calibration
A>T SNP with Calibration
Small Amplicon Genotyping
M.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为 56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线h Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用
— 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping）
—小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
软件自动基因分型，PCR产物不需要处理
谢谢！
HRM – Lunaprobe genotyping
HRM – Lunaprobe genotyping
1 Probe – 1 SNP, All Possible SNPs
1 Probe – 1 SNP, All Possible SNPs
HRM技术
最新SNP检测方法！无与伦比！！SNP, 无与伦比, 检测高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法——HRM技术应用HRM介绍高分辨熔解曲线分析（high-resolution melting analysis，HR）技术是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
基于高效稳健的PCR 技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。
HRM原理HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。
随着高精度PCR仪（LightCycler® 480和Rotor-Gene 6000）和饱和染料（LC Green、Eva Green等）的出现，HRM技术的普及使用成为可能。
HRM应用1.SNP（单核苷酸多态性）的筛查。
2.基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。
3.新突变的筛查。
4.甲基化的筛查。
5.遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。
6.HLA基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。
7.法医学鉴定、亲子鉴定。
8.动植物品质相关多态性位点的研究等。
植物抗逆性，突变与性状关联性研究。
HRM特点高通量：1次可同时检测10-384样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。
高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。
检测灵敏性远高于“PCR+测序”的25%，即100个正常细胞中至少有25个突变细胞，测序仅适用手术组织。
hrm高分辨率溶解曲线实验流程
hrm高分辨率溶解曲线实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法—HRM 技术应用
高通量、低本钞票SNP、突变或甲基化检测方法—HRM技术应用HRM介绍HRM技术是high-resolutionmeltinganalysis即高分辨熔解曲曲折折曲曲折折折折线分析技术，是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
基于高效稳健的PCR技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直截了当运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。
因操作简便快速，使用本钞票低，结果正确，实现了真正的闭管操作，HR M技术受到普遍关注。
HRM原理HRM的要紧原理是依据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲曲折折曲曲折折折折线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度到达对单个碱基差异的区分。
随着高精度PCR仪〔L ightCycler®480和Rotor-Gene6000〕和饱和染料〔LCGreen、EvaGreen等〕的出现，HRM技术的普及使用成为可能。
HRM应用• SNP〔单核苷酸多态性〕的筛查。
•基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。
•新突变的筛查。
•甲基化的筛查。
•遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。
• HLA基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。
•法医学鉴定、亲子鉴定。
•动植物品质相关多态性位点的研究等。
植物抗逆性，突变与性状关联性研究。
HRM特点•高通量：1次可同时检测10-384样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。
•高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。
检测灵敏性远高于“PCR+测序〞的25%，即100个正常细胞中至少有25个突变细胞，测序仅适用手术组织。
•特异性好：PCR产物无需后续处理，特异性高达100%。
HRM技术发展和应用
HRM技术发展和应用作者：马自俭来源：《畜牧兽医科学》 2018年第3期摘要：高分辨率溶解曲线技术( HRM)是将饱和荧光染料，荧光探针和实时荧光定量PCR技术的优点进行整合而产生的一种用于检测基因突变位点和进行基因分型的新技术。
高分辨率溶解曲线技术以其成本低，通量高，简便快捷，高灵敏度和高特异性著称。
本文主要介绍HRM技术的研究进展和应用，以期为应用该技术的爱好者做理论参考。
关键词：高分辨率溶解曲线技术(HRM)；原理；发展中图分类号：Q754 文献标识码：B doi：10. 3969/j. issn. 2096-3637. 2018. 03.0251HRM的发展史HRM技术是近几年来新兴起的一种用于检测单核苷酸多态性的诊断技术。
HRM检测技术除了具有高通量、低成本、灵敏性和特异性高之外，真正实现了闭管操作，因此，HRM检测技术深受国内外科研人员的关注并得到广泛的应用。
已经商品化的用于HRM检测的仪器是LightScanner，它是由美国Idaho公司生产的专门用于单核苷酸多态性位点的检测的仪器，可以在5min的时间里检测96或者384个样品进行突变位点的检测。
此外，市场上其他公司的荧光定量PCR仪器也可以完成对突变位点的检测，如伯乐公司和罗氏公司生产的荧光定量PCR仪可以完成对反应产物的突变位点的检测和基因分型。
目前，常用的应用于基因分型的比较准确的方法之一是探针法，但是探针的合成成本比较高，因此，其临床应用也受到极大的限制。
而本文所介绍的HRM技术不会受到碱基的位点或者碱基的类型限制，也不需要合成价格较高的探针，只需要在反应结束后对反应产物进行一步溶解，再用仪器对溶解曲线进行分析，完成基因分型和突变位点的扫描。
2高分辨率溶解曲线技术的原理高分辨率溶解曲线技术的原理非常简单，就是在PCR扩增结束后，另设置一个解链的步骤。
在温度逐渐上升的阶段，DNA双链由于受到热力作用，碱基之间的氢键会逐步打开，在碱基双链解开到一半的时候，会产生一个解链加剧的点，这个关键点的温度就是DNA双链的Tm温度，在DNA双链逐渐打开的过程叫做溶解。
基于熔解曲线分析技术的鹿茸药材分子鉴别
基于熔解曲线分析技术的鹿茸药材分子鉴别高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）是一种主要用于基因分型和突变扫描的分子诊断技术，在中药真伪鉴定中有着广泛应用前景。
文章将高分辨率熔解曲线技术应用于鹿茸真伪鉴别，利用COⅠ序列，在退火温度为60 ℃，45个循环数的条件下，建立正品鹿茸药材熔解曲线模型，并筛选确定其DNA模板浓度、引物浓度、Mg2+浓度的适宜范围。
结果表明，鹿茸药材在模板DNA质量浓度为10～100 mg·L-1、引物浓度0.2 μmol·L-1，Mg2+浓度 2.0 mmol·L-1的条件下，梅花鹿熔解曲线为双峰，其Tm分别为（81.96±0.07），（84.51±0.03）℃;马鹿熔解曲线为双峰，其Tm为（82.58±0.13），（85.95±0.05）℃。
该方法可以实现简单、快速、高通量、可视化的鹿茸药材真伪鉴定。
标签：高分辨熔解曲线;鹿茸药材;分子鉴定Molecular identification of hairy antler by analysis of high resolution meltingCHEN Kang1，2，JIANG Chao1，YUAN Yuan1*，HUANG Lu-qi1，JIN Yan1（1. State Key Laboratory of Dao-di Herbs，National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;2. Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230038，China）[Abstract]High resolution melting （HRM），an important technology for genotyping and mutation scanning，has broad prospects in the authenticity of traditional Chinese medicine. This paper selected universal COⅠprimers and used HRM to establish a new method for authenticity of Hairy Antler. PCR was conducted at the annealing temperature of 60 ℃and 45 cycles. The range of the DNA template concentration，the primer concentration and the Mg2+ ion concentration were further optimized. The results showed that the Tm values of Cervus nippon were （81.96±0.07），（84.51±0.03）℃and Cervus elaphus was（82.58±0.13），（85.95±0.05）℃with 10-100 mg·L-1 DNA template，0.2 μmol·L-1 primer，2.0 mmol·L-1 Mg2+. This method can authenticate of hairy antler and is simple，fast，high-throughput，visualization.[Key words]high resolution melting; hairy antler; molecular identificationdoi：10.4268/cjcmm20150409鹿茸始载于《神农本草经》，具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任、托疮毒的功效，能够提高机体工作能力、减轻疲劳，改善睡眠、饮食及蛋白质代谢障碍，增加肾脏利尿功能[1]。
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内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
Small Amplicon Genotyping
扩增小片段直接进行基因型鉴定
•使用已知Tm值的双链DNA做温 度内标，低温内标Tm(~61℃) , 高温内标Tm (~92 ℃) •内标能够实现96/384孔板的温度 均一矫正。 •PCR片段的Tm值范围： 70-88 ℃ •优点：不需要探针，直接利用 PCR产物针对已知突变位点进行 基因分型
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
PCR
Lightscanner高分辨溶解曲线结果
LC Green plus —— 高分辨溶解曲线专用荧光染料
Saturating dye
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
HRM – Lunaprobe genotyping
HRM – Lunaprobe genotyping
1 Probe – 1 SNP, All Possible SNPs
1 Probe – 1 SNP, All Possible SNPs
Class 1 C:T, G:A Class 3 C:G
SNP及突变研究的最新工具 高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting） 突变筛查和基因分型系统
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting） • 高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析;T SNP without Calibration – 72bp
Apply Temperature Calibration
A>T SNP with Calibration
Small Amplicon Genotyping
M.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为 56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表 纯合型CC和TT。
Mutation Scanning
未知SNP扫描
M.H.Ye等对北京油鸡CAPN1基因外显子进行扫描，筛查其潜在SNPs。
Bernhard等对Barley的eukaryotic translation
initiation factor 4E (eIF4E) gene基因外显子进行突变扫描结果
Bernhard J. HoWnger · Hai-Chun Jing ·Kim E. Hammond-Kosack · Kostya Kanyuka (Barley Application) Theor Appl Genet (2009) 119:851–865 DOI 10.1007/s00122-009-1094-2 数据来自英国洛桑农业实验站
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
Class 2 C:A, G:T
Class 4 A:T
1 Probe, 2 SNPs, 1 Amplicon
2 Probes, 2 SNPs, 1 Amplicon- ApoE
2 Probes, 2 SNPs, 2 Amplicons - HFE
Amplicon Scanning – 发现新的突变
High Resolution DNA Melting（HRM)是基于有序列变化的Amplicon之间微弱的 Tm值差异，通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：
LightScanner突变检测原理 Wild type Tube 1 Homozygote Tube 2 Tube 3 Heterozygo te
rr
Mix Rr:rr by 1:1 Rrrr
RR
Mix RR:Rr by 1:1 RRRr Rr
David De ，Yong Song at el.Application og high-resolution DNA melting for genotyping and variant scanning of diploid and autotetraploid potato Mol Breeding (2010) 25:67–90