高分辨率溶解曲线
高分辨率溶解曲线简介资料
高分辨率溶解曲线简介(2011-09-01 11:30:50)转载▼标签：杂谈高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称 HRM ，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。
HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。
其中，主要的研究方向集中在： 1 、基因未知突变以及 SNP 的扫描； 2、已知突变及 SNP 的基因分型； 3、动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定； 4 、法医鉴定、亲子鉴定； 5 、HLA 的配型； 6 、甲基化的研究等。
一、HRM技术的基本原理：HRM 技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。
不同核酸分子的片段长短、 GC 含量、 GC 分布等是不同的，因此任何双链 DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。
以二倍体细胞为例，当纯和子样品通过 PCR 扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图一 A 。
而杂合子 PCR 扩增完，经过变性复性后，样品中会形成部分的含有非沃森 - 克里克配对的双链分子存在。
图一： A ：纯合子样品 B ：杂合子样品如图一 B 所示，杂合子样品扩增后，经变性复性，会有非配对碱基的形成，而纯合子样品没有。
这样，杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，表现在解链温度上就会有微小的差别。
如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而成功的筛选出纯合子与杂合子。
下图是杂合子样品熔解曲线的的示意图：图二：杂合子样品的熔解曲线为四种不同双链的熔解曲线的叠加的结果。
以二倍体细胞为例，杂合子扩增后通过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双链的混合物，在熔解过程中四种链会形成一条独特的溶解曲线，从而与纯合子的熔解曲线区分出来。
高分辨率熔解曲线分析(HRM)及其在植物种质资源鉴定中的应用
摘要 ： 饱和 荧光染料 、 未标记探 针 与 实时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ结合产 生 的
关键词 ： 高分辨率 熔解 曲线分析 ； 种 质鉴定 ； Ｓ Ｓ Ｒ；Ｓ Ｎ Ｐ
中图分类号 ： Ｓ３ ３ ０ 文献标志码 ： Ａ
文章编号 ： １ ０ ０ １ — ４ ７ ０ ５ （ ２ ０ １ ３ ） １ ０ － ０ ０ ５ ７ － ０ ４
高分 辨 率 熔 解 曲线 分 析 （ Ｈｉ ｇ ｈ Ｒ ｅ ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｍｅ ｌ ｔ ｉ ｎ ｇ Ｃ ｕ ｒ ｖ ｅ Ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ， Ｈ Ｒ Ｍ） 是在实时荧光定量 Ｐ Ｃ Ｒ基 础 上 发展起 来 的一 项新 技术 。 目前 ， Ｈ Ｒ Ｍ 分 析 的应 用 领域
因型 。
多态 ） 分析 、 突变扫 描 、 甲基 化 分析 、 基 因分 型 、 序列 匹
配等研究 ， 近年来 已成 为生命科 学研究 中的热点技 术 … 。在植 物种 质 资源 研 究 中 ， 高 分 辨 率熔 解 曲 线分
析 的应 用 已经 逐步 开展 ， 主要 用 于植 物遗 传 图谱 构建 、 基 因定 位 与标 记辅 助 选 择 、 突 变 检 测 及 种 质 鉴 定 等研
究 Ｊ 。本文对高分辨率熔解 曲线 分析的原理 、 特点及 其在植物种质资源鉴定 中的应用进行综述 ， 并 对该技 术在种质资源鉴定 中的应用前景进行展望。
高分辨率熔解 曲线分析 （ Ｈ Ｒ Ｍ） 技术 的成 功主要 取决 于 ２个方 面 的 因素 ： 饱 和 荧 光染 料 和 高 分 辨率 的 检测 仪器 ２ ’ 。荧 光染 料包 括 非 饱 和荧 光 染 料 和饱 和
高分辨率熔解曲线分析法之Snakback基因分型法
高分辨率熔解曲线分析法之Snakback基因分型法背景：DNA的发夹结构作为自身探针扩增用于PCR产物的分子分析。
在这之前实体分离或共价修饰的寡核苷酸荧光是必须的。
方法：我们用饱和染料LC Green做不对称PCR，40-45个循环，其中1条引物的5’端包括了一条尾巴，这条尾巴和其延伸引物互补，但这尾巴没有任何特别的共价修饰。
样品可以在LightsCycler的转子中快速的扩增，可以在96/384 模块加热PCR仪中进行高通量的扩增。
除了扩增扩增子的双链，通过引物尾巴的“弹回”及其延伸引物的杂交形成单链发夹结构。
在HR-1（毛细管）或Lightscanner（96/384孔板）上运行高分辨率熔解曲线。
结果：用弹回引物扩增的PCR产物在低温处显示两个发夹结构熔解峰，在高温处显示全部扩增子的熔解峰。
发夹结构的熔解温度与其长度（6-28bp）是线性相关，与环的大小成负相关。
我们可以轻松的将杂合突变和纯合突变进行基因分型。
用弹回探针对100个未知基因型的临床样本的F5 1691G>A进行基因分型，与之前的分型结果一致。
我们用2条弹回引物做不对称PCR，分析CFTR基因外显子10的2个范围，通过稀释产物形成分子内部杂合子进行基因分型，分出7种不同的基因型。
结论：弹回引物结合饱和染料基因分型的方法在闭管体系中，只用2条引物便可以提供一条特异的探针，此探针没有特殊的共价修饰。
在分子诊断学中，DNA的发夹结构是非常有用的工具，包括stem-loop探针和self-probing扩增。
stem-loop探针通常叫做“分子信标”，是一段共价修饰的核苷酸，一端末尾是荧光基团，另一端末尾是淬火剂。
self-probing扩增用于弹回单链构想多态性（SSCP）和蝎子引物。
弹回单链构想多态性SSCP逐渐用于在PCR产物中人工引入二级结构进行SSCP分析。
依赖于扩增序列，与引物尾巴互补的8-11bp序列弹回至其延伸产物上，形成了单链发夹结构，虽然弹回SSCP的引物没有共价修饰，电泳已经足够分离发夹结构。
高分辨率熔解曲线及其在分子诊断中的应用
二 、 Ｒ 在分子 诊 断 中的应用 Ｈ Ｍ Ｈ Ｍ 能够 在 没有 标 记 荧 光 探 针 的情 况 下 分 Ｒ 析单个 碱 基 的变 化 。假 如 扩 增 子 包 含 有 一 Ｓ Ｐ Ｎ 位点 Ａ＞Ｃ， 可 能 出现的 双链结 构 为 ２条纯 合双 则 链（ ／ Ａ Ａ和 Ｃ Ｃ） ２条 杂化双 链 （ ／ ／ 和 Ａ Ｔ和 Ｃ Ｇ） ／ ，
结 合 如要 达到饱 和 ， 必须 高浓度 加入 ， 过高 浓度 但
会 抑制 Ｐ Ｒ反 应 ， Ｃ 而饱 和 染 料 不抑 制 Ｐ Ｒ反 应 ， Ｃ 因此 占据 了双链 Ｄ Ａ 的所 有 碱基 对 ， 外 ， Ｎ 此 当双 链 Ｄ Ａ局部解 链 时 ， 离下 来 的染 料 亦不会 重 新 Ｎ 游
文献标 志码： Ａ
高 分 辨 率 熔 解 曲线 及 其 在 分 子 诊 断 中的应 用
沈 薇 综述 ， 傅 启华 审校 （ ．上海 交 通大学 医 学院 附属仁 济 医院检 验科 ， １ 上海 ２ ０２ ； ０ １７ ２ ．上海 交通 大学 医学 院附属 上海儿 童 医学 中心检 验科 ， 上海 ２０２ ） ０ １７ 通 过 加热使 双链 Ｄ Ａ解离 为单链 是 Ｄ Ａ基 Ｎ Ｎ 本 特性 之 一 ， 分 辨 率 熔 解 曲 线 （ ｉ ｅｏｕｏ 高 ｈｇ ｒｓｌｔｎ ｈ ｉ
～
息 ， 如 突 变 、 核 苷 酸 多 态 性 （ｉｇ ｕｌ ｔ ｅ 例 单 ｓ ｌ ｎｃｅ ｉ ｎｅ ｏｄ
HRM高分辨率熔解曲线分析技术--百替生物
由于HRM的操作与后期数据分析简单、 易懂,在多个医学研究领域收到了广泛关注并 发展起来,高分辨率熔解曲线已经成为医学上 DNA诊断的最为理想的解决方法。
Thank you!
在非小细胞性肺癌（NSCLC）患者中发现第19号外显子中 存在有(L747-P753insS)突变，为以后针对性的分子诊断以 及设计药物有潜在意义。(Smith et al., 2008) Clinical Pathology
HRM在序列配对中的应用举例
Human Leucocyte Antigen(HLA)人类白细胞抗原：
LC GREEN
高分辨率：
DNA的熔解曲线取决于DNA碱基序列。理论上 任何一个碱基的改变，都会造成TM值的差异，但是 单个碱基改变造成的差异是极小的，通常只有零点 几度。因此要精确检测TM值的差异，就至少需要保 证每0.1℃获取一次荧光信号。 LightScanner
HRM原理示意图
HRM的技术优势：
TM值：当前温度下50%的双链解链为单链
HRM
RealTime PCR
HRM与RealTime PCR的异同点：
需要加入荧光染料
检测获取荧光信号
•采用的染料类型不同（Sybr和LC）
•荧光信号检测时机不同
•分辨率不同
•数据处理方式不同
饱和染料有效避免了检测荧光信号中的假阳性
新的饱和染料降低了传统染料对PCR反应的抑制作用
1.整体操作方法简单，检测灵敏度高，可检测出单个碱基的改 变，检测效率高，5-10分钟即可完成对96/384孔板的检测。
2.从PCR到检测荧光信号，整个过程在同一个管中进行，最大
程度的避免了污染。 3.无需事先知道突变位点，无需设计探针，大大简化实验设计 时间和研究成本。
高分辨率熔解曲线 算法
高分辨率熔解曲线算法
高分辨率熔解曲线算法是一种用于分析物质熔解过程的算法。
以下是一种常见的高分辨率熔解曲线算法的步骤：
1. 数据采集：收集物质熔解过程中的温度和信号强度数据。
可以使用温度计和光学仪器等设备进行数据采集。
2. 数据预处理：对采集的数据进行预处理，如去噪、数据平滑或峰值修正等。
这些预处理步骤可以提高数据质量和信号特征的可辨识性。
3. 峰检测：使用峰检测算法来找到熔解过程中的峰值。
常用的峰检测算法包括一阶或二阶导数法、小波变换法、基线校正法等。
4. 峰分析：对检测到的峰值进行分析，如峰形参数计算、峰峰高度计算等。
这些分析可以提供关于物质熔解过程的定量或定性信息。
5. 曲线绘制：根据预处理和峰分析的结果，将处理后的数据绘制成熔解曲线图。
通常，熔解曲线图以温度为横轴，信号强度为纵轴。
6. 曲线解释：根据熔解曲线的特征和峰分析的结果，解释物质的熔解过程、化学组成或其他相关信息。
需要注意的是，高分辨率熔解曲线算法可以根据具体的数据类
型和分析目标进行调整和扩展。
因此，上述步骤只是一种常见的算法框架，具体的实现可能因应用需求而异。
高分辨率熔解曲线实验优化建议
High Resolution Melting高分辨率熔解曲线实验优化建议picture placeholderApplication Support Center Roche Applied Science Hotline: 800 820 0577Email: asc.support@饱和双链DNA结合染料减少非特异性产物和引物二聚体引物模板Mg 2+ PCR 程序•引物设计–引物退火温度 Tm~60o C–扩增片段长度 <250bp，通常在100-150bp左右–使用专业的引物设计软件；利用BLAST(/BLAST) 来确保引物与模板DNA结合的特异性•引物纯度–使用HPLC纯化级别的高纯度引物•引物浓度–为了避免引物二聚体的生成，使用较低的引物浓度：例如 200nM each•核酸提取–确保所有样品的提纯方法都是一样的–使用高质量的核酸提纯方法。
例如：商业化的手动核酸提取试剂盒或者全自动核酸提取仪•模板浓度–建议模板起始浓度在5-30ng/20ul，扩增曲线的Cp值<30–用吸光度方法计算待测样品的核酸浓度，调整模板浓度使它们的起始浓度相同167 bp PCR FragmentMgCl2 Titration 1.0 – 4.0 mMPCR Primers: 200 nM each Touchdown PCR Protocol (64 – 54°C)MWMPCR Products (+ NTC 4.0 mM)MWM50 bp4.04.03.53.02.52.01.51.050 bpMgCl 2 ConcentrationAgarose Gel 2%Touchdown PCR•用于：当无法进一步调节引物退火温度时•原理：先在较高的温度退火，保证产物的特异性；在后面的循环中，退火温度逐渐降低，保证有足够的产物总量•局限性：Touchdown PCR 不适用于定量实验Example 1: Touchdown PCR with40 Cycles and 0.5 °C step sizeExample 2:Touchdown PCR with45 Cycles and 1°C step size在 LC Nano中编辑 Touchdown PCR•问题：丰度低的突变基因在PCR扩增中很难被检测到•解决方法：选择性的扩增突变序列•Fast COLD PCR原理：–适用于 G/C → A/T 的突变，Tm(wt)>Tm(mut)–变性温度设在Tm(mut)附近，保证在这个温度下只有突变型发生变性•实验必备条件:–精确的温度控制–孔间温差尽量小，保证样品中突变型扩增的富集程度一致•其他应用：–Fast COLD-PCR：优先扩增 Tm 低于野生型 homoduplexes，适用于 (G/C → A/T, 占突变的84%)–Full COLD-PCR：优先扩增 heteroduplexes, 适用于所有突变–Ice-COLD-PCR：与 Full COLD-PCR 相同, 但使用了 reference sequence(RS) oligo, 提高heteroduplex 的突变检出率HRM优化 - Spiking方法区分纯合子样品•问题：纯合野生型和纯合突变型的Tm接近，分组不清晰•解决方法：向所有样品中加入20%纯合野生型样品–Homozygous WT：组分不变–Homozygous MT：含有20% WT–heterozygous：组分不变，仍然是heterozygousAAA B + AABB + AA AAA BBB20% AA20% AA20% AA内容小结•HRM实验优化建议–引物–模板–Mg2+浓度–PCR程序: Touchdown PCR, COLD PCR •Spiking方法区分纯合子样品We Innovate Healthcare。
探针高分辨率熔解曲线
探针高分辨率熔解曲线探针高分辨率熔解曲线是一种具有非常重要意义的实验方法，用于研究材料的熔化过程和其熔化温度。
这项技术的独特之处在于它可以提供非常详细且准确的数据，以揭示材料的相变行为及其分子结构。
本文将详细介绍探针高分辨率熔解曲线的原理和应用，并探讨其在材料科学领域中的指导意义。
首先，让我们来了解探针高分辨率熔解曲线的原理。
这种技术主要依赖于热量传导和温度测量原理。
通过将材料样品置于一个容器中，然后在其周围放置具有精确温度控制的探针，可以实现对样品的精确加热。
随着温度的升高，材料将开始融化并呈现出熔解曲线。
通过记录探针的温度变化，并对数据进行分析，可以得到准确的熔解曲线图。
探针高分辨率熔解曲线的应用非常广泛。
首先，它可以用于研究和分析材料的纯度。
纯度是衡量材料质量的重要指标之一。
通过分析熔解曲线，可以确定材料中存在的杂质和其他组分，并对其进行定量分析。
这对于制药和化学工业等领域来说尤为重要，因为即使微小的杂质也可能影响产品的质量和性能。
此外，探针高分辨率熔解曲线还可以应用于材料的相变研究。
相变是指物质在特定条件下从一个状态转变为另一个状态的过程。
通过研究材料的熔解曲线，可以确定材料的熔化温度、熔化热和熔解焓等重要参数。
这对于了解材料的相变机制、研究材料性能和改进制备方法都具有重要意义。
在材料科学领域，探针高分辨率熔解曲线的应用有助于指导材料的设计和合成。
通过研究材料的熔化行为和熔化温度，可以选择合适的加热条件和制备方法，以确保所得到的材料具有期望的性能和结构。
这对于开发新型功能材料和高性能材料具有重要价值。
总结起来，探针高分辨率熔解曲线是一种生动、全面且具有指导意义的实验方法。
它通过测量材料的熔化温度和熔解焓等参数，为材料科学领域提供了重要的数据和指导。
它在材料纯度分析、相变研究和材料设计等方面具有广泛应用，为我们深入了解材料的性能和结构提供了有效的手段。
在未来的研究中，我们可以进一步探索和发展这一技术，以实现更高的分辨率和更准确的数据分析，推动材料科学的发展和应用。
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北京泰格瑞分子检验有限公司
高分辨率熔解曲线
高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析的主要原理是由于DNA序列的片段长短，GC含量、分布以及碱基互补性差异等的不同，在DNA 分子热变性时会使溶解曲线的形状和位置有所不同。
同许多荧光PCR技术一样，HRM 利用特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测温度变化过程中双链DNA 荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测, 可以迅速的检测出核酸片段中 GC 含量和单碱基的突变。
高精度PCR 仪及饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现使HRM得到广泛的普及和应用。
项目：
已知SNP位点检测；外显子突变位点筛查；物种鉴定、品种鉴定；甲基化研究；法医学鉴定、亲子鉴定。
样本要求：
新鲜或异硫氰酸胍保存的细胞(﹥5×106)、组织(﹥50mg)、血液(﹥300μl)等样本原材料，或纯化好的DNA(OD260/OD280在 1.7-1.9之间)、总RNA(OD260/OD280在1.9-2.1之间，完整性好)，或反转录好的cDNA不少于30μl(纯度在1.9-2.1之间，及反转录好的cRNA完整性好)。
技术优势：
高通量：1 次可同时检测多个样本。
高敏度：HRM 检测灵敏度达1%-0.1% ，是传统“PCR+ 测序”方法25-250 倍。
特异性好：PCR 产物无需后续处理，特异性强。
重复性好：样品经PCR 扩增后直接进行HRM，直接在同一个PCR 管内进行分析，实现闭管操作，避免交叉污染。
操作简便：只需设计PCR 引物，进行PCR 反应，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限。
成本低：相比传统的SNP/突变分析法和定量探针法，简化了操作步骤，缩短了实验时间，大大降低了使用成本。