高分辨率溶解曲线HRM
高分辨率溶解曲线简介资料
高分辨率溶解曲线简介(2011-09-01 11:30:50)转载▼标签：杂谈高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称 HRM ，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。
HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。
其中，主要的研究方向集中在： 1 、基因未知突变以及 SNP 的扫描； 2、已知突变及 SNP 的基因分型； 3、动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定； 4 、法医鉴定、亲子鉴定； 5 、HLA 的配型； 6 、甲基化的研究等。
一、HRM技术的基本原理：HRM 技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。
不同核酸分子的片段长短、 GC 含量、 GC 分布等是不同的，因此任何双链 DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。
以二倍体细胞为例，当纯和子样品通过 PCR 扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图一 A 。
而杂合子 PCR 扩增完，经过变性复性后，样品中会形成部分的含有非沃森 - 克里克配对的双链分子存在。
图一： A ：纯合子样品 B ：杂合子样品如图一 B 所示，杂合子样品扩增后，经变性复性，会有非配对碱基的形成，而纯合子样品没有。
这样，杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，表现在解链温度上就会有微小的差别。
如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而成功的筛选出纯合子与杂合子。
下图是杂合子样品熔解曲线的的示意图：图二：杂合子样品的熔解曲线为四种不同双链的熔解曲线的叠加的结果。
以二倍体细胞为例，杂合子扩增后通过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双链的混合物，在熔解过程中四种链会形成一条独特的溶解曲线，从而与纯合子的熔解曲线区分出来。
高分辨熔解曲线分析技术临床应用研究进展
多症。李闪等［４］研究发现软骨发育不全与ＦＧＦＲ３
１ 高分辨熔解曲线分析技术概况
基因Ｇｌｙ３８０Ａｒｇ突变有关，软骨发育不良与ＦＧＦＲ３
Ｕｔａｈ大学的Ｗｉｔｔｗｅｒ实验室和Ｉｄａｈｏ公司在 基因Ａｓｎ５４０Ｌｙｓ突变有关，并针对两组基因突变建
１９９７年首次提出ＰＣＲ联合熔解曲线，由荧光信号 立了ＨＲＭ技术的快速筛查方法。角膜炎－鱼鳞病
监测扩增产物熔解曲线变化的新兴核酸分析技 带－３蛋白缺陷，何本进等［３］研究表明高效、准确、
术［１］。高分辨熔解曲线分析技术已经应用到临床的 低成本的分子诊断方法ＨＲＭ可以对ＳＬＣ４Ａ１基因
各个领域，对遗传病、肿瘤的诊断和细菌的鉴定及药 进行突变筛查，从而辅助诊断遗传性球形红细胞增
敏试验、药物的鉴定等发挥了重要作用。
有快速简便、成本低、灵活性高、敏感性高、特异性 关，叶军等［９］证实了ＭＥＤ１２基因突变与子宫肌瘤
高、闭管操作等优点。
有关，这两种基因突变都可以采用ＨＲＭ技术进行
２ 高分辨熔解曲线分析技术临床应用
检测，可用于高危人群的健康筛查和风险评估，为广
２．１ 遗传病
大妇女同志带来福音。ＨＲＭ技术在非小细胞肺癌
变化实时监控ＰＣＲ产物的技术，随后几年此方法不 －耳聋综合征的ＧＪＢ２基因［５］、原发性肥大性骨关
断改进，经历了ＨＲ－１，ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ和Ｒｏｔｏｒ－ 节病的ＨＰＧＤ基因［６］、原发性局限性皮肤淀粉样变
Ｇｅｎｅ６０００等，期间也不断有其他公司研制出用于 的ＯＳＭＲ基因［７］等都可以采用ＨＲＭ作为筛查方
Ｓｙｔｏ９，ＥｖａＧｒｅｅｎｓ等，不同染料对分析结果影响很 产生严重后果，因此肿瘤患者的早期诊断和治疗就
大，有的染料不适用于杂合子变异检测，有的不适用 显得尤为重要。乳腺癌和子宫肌瘤是困扰女性的两
hrm高分辨率溶解曲线实验流程
hrm高分辨率溶解曲线实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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高分辨率熔解HRM简介
高分辨率熔解HRM简介早在上世纪六十年代，双链DNA的熔解靠吸光度监测，数微克的DNA样品以每分钟0.1-1.0℃的速度缓缓加热，待直至数小时后完成熔解。
随后出现的利用荧光检测互补双链DNA是一个更灵敏的方法，这种方法需要先进行PCR富集DNA产物，它的流行得益于1997年问世的实时定量PCR仪Light- Cycler®。
毛细管进样和小样品体积保证了良好的温控效果，使得熔解速率大大加速到每秒钟0.1-1.0℃。
高分辨率熔解分析High Resolution Melting (HRM)于2003年发明，是一项近年来备受关注的创新的技术，实现了通过研究PCR产物依赖于序列的熔解温度而对PCR产物进行鉴定。
可用于检测样品中存在的双链DNA的单核苷酸多态性（SNPs）基因变异（Mutation）、多态性（Polymorphisms）和表观遗传学（Epigenetic）差异。
HRM分析技术的神奇之处在于它是基于对核酸双链高温熔解行为的实时监测，仅仅是在普通荧光PCR之后加一步闭管的熔解步骤，操作简便，样品可随着其本身的序列、长度、GC 含量及双链互补程度不同而被区分开。
因此，甚至是单个碱基如SNPs也可轻易被鉴定出。
原则上来说，HRM分析技术的发展得益于三项技术上的进步：1. 1. 发现了新一代的对DNA无抑制作用的饱和染料（如LC Green Plus，Resolight等）；2. 2. 高度精密的荧光监控光学系统的问世；3. 3. 发明了能够对熔解状况进行细致分析的新算法。
高分辨率熔解分析最重要的应用是基因扫描，相比传统基因分型技术，HRM具有许多优势：1. 1. 省钱—相比较测序和Taqman® SNP分型技术，HRM更适合于大规模基因分型项目；2. 2. 快速—能够在更短时间内精确分型；3. 3. 简单—易上手操作，可在高分辨率的荧光PCR仪上方便实现。
由于突变导致的突变样本熔解曲线相对于参考样本的变化是可以明显识别出来的。
高分辨率熔解曲线实验优化建议
High Resolution Melting高分辨率熔解曲线实验优化建议picture placeholderApplication Support Center Roche Applied Science Hotline: 800 820 0577Email: asc.support@饱和双链DNA结合染料减少非特异性产物和引物二聚体引物模板Mg 2+ PCR 程序•引物设计–引物退火温度 Tm~60o C–扩增片段长度 <250bp，通常在100-150bp左右–使用专业的引物设计软件；利用BLAST(/BLAST) 来确保引物与模板DNA结合的特异性•引物纯度–使用HPLC纯化级别的高纯度引物•引物浓度–为了避免引物二聚体的生成，使用较低的引物浓度：例如 200nM each•核酸提取–确保所有样品的提纯方法都是一样的–使用高质量的核酸提纯方法。
例如：商业化的手动核酸提取试剂盒或者全自动核酸提取仪•模板浓度–建议模板起始浓度在5-30ng/20ul，扩增曲线的Cp值<30–用吸光度方法计算待测样品的核酸浓度，调整模板浓度使它们的起始浓度相同167 bp PCR FragmentMgCl2 Titration 1.0 – 4.0 mMPCR Primers: 200 nM each Touchdown PCR Protocol (64 – 54°C)MWMPCR Products (+ NTC 4.0 mM)MWM50 bp4.04.03.53.02.52.01.51.050 bpMgCl 2 ConcentrationAgarose Gel 2%Touchdown PCR•用于：当无法进一步调节引物退火温度时•原理：先在较高的温度退火，保证产物的特异性；在后面的循环中，退火温度逐渐降低，保证有足够的产物总量•局限性：Touchdown PCR 不适用于定量实验Example 1: Touchdown PCR with40 Cycles and 0.5 °C step sizeExample 2:Touchdown PCR with45 Cycles and 1°C step size在 LC Nano中编辑 Touchdown PCR•问题：丰度低的突变基因在PCR扩增中很难被检测到•解决方法：选择性的扩增突变序列•Fast COLD PCR原理：–适用于 G/C → A/T 的突变，Tm(wt)>Tm(mut)–变性温度设在Tm(mut)附近，保证在这个温度下只有突变型发生变性•实验必备条件:–精确的温度控制–孔间温差尽量小，保证样品中突变型扩增的富集程度一致•其他应用：–Fast COLD-PCR：优先扩增 Tm 低于野生型 homoduplexes，适用于 (G/C → A/T, 占突变的84%)–Full COLD-PCR：优先扩增 heteroduplexes, 适用于所有突变–Ice-COLD-PCR：与 Full COLD-PCR 相同, 但使用了 reference sequence(RS) oligo, 提高heteroduplex 的突变检出率HRM优化 - Spiking方法区分纯合子样品•问题：纯合野生型和纯合突变型的Tm接近，分组不清晰•解决方法：向所有样品中加入20%纯合野生型样品–Homozygous WT：组分不变–Homozygous MT：含有20% WT–heterozygous：组分不变，仍然是heterozygousAAA B + AABB + AA AAA BBB20% AA20% AA20% AA内容小结•HRM实验优化建议–引物–模板–Mg2+浓度–PCR程序: Touchdown PCR, COLD PCR •Spiking方法区分纯合子样品We Innovate Healthcare。
高分辨熔解曲线(HRM)
高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM) 分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。
它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。
HRM 原理HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。
同许多荧光PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。
如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。
随着高精度PCR 仪（LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000）和饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。
HRM 特点由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。
基于这种检测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规PCR 基础上增加一个饱和染料。
所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。
高分辨率熔解HRM的应用前景
高分辨率熔解HRM的应用前景星期一, 三月1st, 2010 | HRM技术 | 苏州为真生物| 浏览:118摘要：高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析是一门新兴的技术。
它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、基因分型和甲基化分析等多个方面。
凭借其速度和简便性，高分辨率熔解这种方法正在迅速普及。
高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析是一门新兴的技术。
它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、序列配对和基因分型等多个方面。
凭借其速度和简便性，高分辨率熔解这种方法正在迅速普及。
其实双链DNA的熔解分析可追溯到上世纪六十年代，当时是通过紫外吸收来监测的。
分析需要几微克的DNA，而样品以0.1-1.0°C/分钟的速率缓慢加热，常常要花上几个小时才能完成。
后来，LightCycler定量PCR仪的出现，让荧光熔解分析变得流行。
样品量因毛细管而缩减至纳克级，且熔解速率更快，达0.1-1.0°C/秒，这样熔解时间缩短至几分钟。
当时使用的染料是SYBR® Green I。
然而，这种熔解分析只能区分在片段大小和GC含量上差别较显著的DNA序列，比如检查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其他非特异性的扩增。
如果要区分SNP，分辨率还不够。
为什么呢？这里有必要先介绍一下饱和染料和非饱和染料。
SYBR Green I就属于非饱和性染料，由于它对PCR的抑制作用，在实验中的使用浓度很低，远未将DNA双螺旋结构中的小沟饱和。
这样，DNA双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生重排，荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降。
于是，饱和染料问世了。
为什么称为饱和染料呢？因为它们即便在饱和浓度（荧光最大）下，也不会抑制PCR。
高分辨溶解曲线突变检测
高分辨熔解曲线突变检测高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。
该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。
HRM原理HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。
在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green 在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。
不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。
因此不能用于熔解曲线的检测。
而LC Green (Idaho)是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。
HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在Lightscanner仪器（Idaho）升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。
HRM的特点和应用HRM应用：•检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁•鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变•基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失•特定突变、多态性位点的筛选•外显子和短扩增子基因型扫描HRM特点：•灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。
如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。
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Class 2 C:A, G:T
Class 4 A:T
1 Probe, 2 SNPs, 1 Amplicon
2 Probes, 2 SNPs, 1 Amplicon- ApoE Amplicon-
2 Probes, 2 SNPs, 2 Amplicons - HFE
Amplicon Scanning – 发现新的突变
在PCR反应前加入 LCGreen 荧光染料 • 时间大约2小时（包含试剂准备） 时间大约2小时（包含试剂准备）
在LightScanner上进行高分辨溶解曲线分析 • 大约需要5 大约需要5-10 分钟
数据分析和处理 • 大约需要5 大约需要5-10 分钟
PCR产物可以直接进行下游的测序分析等（如 需要） • 大约需要30-60分钟 大约需要30-60分钟 30
LightScanner适于 适于SNP分析 适于 分析
1. 速度、通量—LightScanner 5～10分钟完成96/384孔板的PCR产物检测 ， 20000个SNP/天 2. 3. 4. 5. 6. 可检测未知、已知突变，对已知突变进行Genotyping 检测未知及已知突变准确性100%、特异性92.7% （<400bp） 重复性—LightScanner重复性100% 费用—LightScanner检测SNP每个样品的荧光染料成本为1.6RMB 操作—LightScanner只需将PCR产物（96/384孔板）放入仪器内便可， 软件自动基因分型，PCR产物不需要处理
谢谢！
Bernhard J. HoWnger · Hai-Chun Jing ·Kim E. Hammond-Kosack · Kostya Kanyuka (Barley Application) Theor Appl Genet (2009) 119:851–865 DOI 10.1007/s00122-009-1094-2 数据来自英国洛桑农业实验站
SNP及突变研究的最新工具 及突变研究的最新工具 高分辨率熔解曲线（ 高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting） ） 突变筛查和基因分型系统
北京思博全科技有限公司
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting） • 高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
HRM – Lunaprobe genotyping
HRM – Lunaprobe genotyping
1 Probe – 1 SNP, All Possible SNPs
1 Probe – 1 SNP, All Possible SNPs
Class 1 C:T, G:A Class 3 C:G
Mutation Scanning
未知SNP扫描 未知SNP扫描 SNP
M.H.Ye等对北京油鸡CAPN1基因外显子进行扫描，筛查其潜在SNPs。
Bernhard等对Barley的eukaryotic translation
initiation factor 4E (eIF4E) gene基因外显子进行突变扫描结果
Rosario Muleo（2009）等用HRM方法对三个品种的SSR DCA4进行分析，DCA4的等位基因有131bp的重复序列，杂 合等位基因的序列为131-133bp，分析结果如图8所示，HRM曲线可以将纯合样品和杂合样品明显的区分，其中一个 等位基因只相差2bp。 三种颜色（浅灰，深灰、黑色）表明3种不同的品种。
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
Rosario Muleo等得出结论： HRM是一种快速、重复性 高、成本低，操作简单，且 可以应用于其他物种的SNP 检测及SSR基因分型的方法。
Rosario Muleo,Marir Chiara Colao,Dario Miano at el. 2009 Genome52:252-260
内容提示
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
• HRM仪器
2005 LightScanner 96/384
•96/384 孔板 •~8 分钟 板 分钟/板 •~2-6 秒/样品 样品 •温度均一性：± 0.15oC 温度均一性： 温度均一性 •数据采集速度：大于100pts/秒 数据采集速度：大于 数据采集速度 秒 •升温速度： 0.1oC/秒 升温速度： 升温速度 秒
为何要使用温度内标
A>T SNP without Calibration – 72bp
Apply Temperature Calibration
A>T SNP with Calibration
Small Amplicon Genotyping
M.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为 56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表 纯合型CC和TT。
Small Amplicon Genotyping 扩增小片段直接进行基因型鉴定
•使用已知Tm值的双链DNA做温 度内标，低温内标Tm(~61℃) ,高 温内标Tm (~92 ℃) •内标能够实现96/384孔板的温度 均一矫正。 •PCR片段的Tm值范围： 70-88 ℃ •优点：不需要探针，直接利用 PCR产物针对已知突变位点进行 基因分型
LightScanner突变检测原理 突变检测原理 Wild type Tube 1 Homozygote Tube 2 Heterozygote
Tube 3
PCR
Lightscanner高分辨溶解曲线结果 高分辨溶解曲线结果
LC Green plus —— 高分辨溶解曲线专用荧光染料
Saturating dye
High Resolution DNA Melting（HRM)是基于有序列变化的 是基于有序列变化的Amplicon之间微弱的 （ 是基于有序列变化的 之间微弱的 Tm值差异，通过 值差异， 片段熔解曲线的差异进行突变检测， 值差异 通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如： 片段熔解曲线的差异进行突变检测 比如：
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
•HRM 检测 • 60 分钟内完成定量 PCR 和 HRM 检测 • HRM检测升温速度可以在 0.05 ～ 0.90oC/秒之间调 检测升温速度可以在 秒之间调 节 •在升温速度小于 在升温速度小于≤0.3℃/秒时，温度均一性：±0.05oC 秒时， 在升温速度小于 ℃ 秒时 温度均一性： • 数据采集速度：20pts/秒～400pts/秒（与升温速度有 数据采集速度： 秒 秒 关） • 0.3oC/秒 升温速度 67 pts/ ℃ 秒 升温速度= • 0.05oC/秒 升温速度 = 400 pts/ ℃ 秒
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
rr
Mix Rr:rr by 1:1 Rrrr
RR Mix RR:Rr by 1:1 RRRr Rr
David De ，Yong Song at el.Application og high-resolution DNA melting for genotyping and variant scanning of diploid and autotetraploid potato Mol Breeding (2010) 25:67–90
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• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 分析 — 检测甲基化