结球白菜结球莲座期和包心期叶片mRNA差异表达研究

*基金项目:北京市科委重点基金项目（954410900）资助。

郭晶心：女，1972年生，现为华南农业大学生命科学学院博士后，E-mail:<jingxinguo@>.**通讯作者。

Author for correspondence.E-mail:<caomq@>.收稿日期：2002-10-31接受日期:2003-04-02农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2003,11(5):456~460·研究论文·结球白菜结球莲座期和包心期叶片mRNA 差异表达研究*郭晶心1周乃元1，2马荣才1，2曹鸣庆1，2**(1.北京农业生物技术研究中心，北京100089；2.首都师范大学生物系，北京100089)摘要：以结球白菜北京桔红心(L.ssp.)为材料，选用4种G 、C 含量高的锚定引物和3种随机引物。

在结球白菜莲座期和包心期叶片的mRNA 差异显示电泳图谱中，选择23个差异cDNA 片段进行反向Northern 检验，从中得到两个在包心期表达量增加比较明显的阳性cDNA 片段。

核苷酸序列同源性分析发现，它们分别与编码转录延伸因子eEF-1和谷胱甘肽转移酶的序列高度同源，同源性分别为99%和85%，为探索结球白菜由莲座期至包心期发育过程中叶片基因表达的变化进行了初步研究。

关键词：mRNA 差异显示；莲座期；包心期；结球白菜mRNA Differential Display Analysis at Rosette and Folding Stages of ChineseCabbage (L.ssp.)Guo Jingxin 1Zhou Naiyuan 1，2Ma Rongcai 1，2Cao Mingqing 1，2**(1.Beijing Agro-biotechnology Research Center,Beijing 100089,China;2.Department of Biology,Capital Normal University,Beijing 100089,China)mRNA differential display (DDRT-PCR)analysis was carried out to investigate gene expression of Chinese cabbage(L.ssp.)leaves at rosette and folding stages.Four anchored primers with high G-C content and threerandom primers were selected.Twenty-three differential cDNA fragments were cut from gels and examined by reverse Northernblotting.And two of them were proved to be positive,which were expressed at higher level at the folding and rosette stages.Nucleotide sequence analysis of these two cDNA fragments showed that their homologous genes encoded translation elongation factor eEF-1and glutathione S-transferase,respectively.Multiple alignment results showed that each of the putative amino acid sequences had strong homology with their counterparts from other plant species,and the homologies were 99%and 85%,respectively.mRNA differential display;gene expression;Chinese cabbage结球白菜原产于我国，是重要蔬菜作物。

结球白菜叶球贮藏了丰富的营养物质，是典型的变态器官。

结球白菜的营养生长可分为幼苗期、莲座期、包心期和结球期4个时期①。

其中在莲座期，结球白菜叶片的主要生理功能是进行光合作用和呼吸作用，叶片开展，叶色为绿色。

进入包心期后，结球白菜的心叶向内弯曲生长，相互抱合并逐渐肥厚，转变为营养贮藏器官，叶色白或淡黄。

尽管深入了解叶球的分化和发育在理论上和实践上都具有十分重要的意义，但对这一过程中相关基因表达和调控的认识还相当有限[1,2]。

mRNA 差异显示（简称DDRT-PCR ）技术能够揭示出生物在不同发育阶段或不同环境条件下基因的差异表达，在一定程度上能加快克隆新基因的进程[3,4]。

但是，这一方法的缺点是假阳性基因片段比较多，对此人们作了进一步的改进，其中反向North-ern 杂交能够有效排除假阳性片段[3,4]。

本研究对结球白菜莲座期和包心期的叶片进行了DDRT-PCR 分析，试图在分子水平上认识结球白菜叶球发生的基①陈机.大白菜形态学.北京:科学出版社，1984.第5期郭晶心等：结球白菜结球莲座期和包心期叶片mRNA差异表达研究因表达调控机制。

1材料和方法1.1材料供试材料为“北京桔红心”结球白菜（L.ssp.）自交系由北京蔬菜中心提供。

材料于2000年8月15日播种于基地，9月13日植株生长到莲座期，具9耀12片叶，叶片开展呈绿色，从植株上切取两片心叶，混合后放于液氮中速冻保存。

间隔12d后，于9月26日植株生长到包心期，此时植株心叶弯曲抱合，颜色桔黄。

从植株上切取两片抱合的桔黄色心叶，混合后放于液氮中速冻保存。

分别将这两个时期的叶片用于RNA提取。

1.2方法1.2.1总RNA的提取、RT及RT-PCR反应、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异显示片段、条带的回收及再扩增参照GENOMYX公司荧光差异显示试剂盒(HIEROGLYPH mRNA Profile Kit Cat.No. 146081146086)说明书进行。

所用3'端锚定引物为AP2、AP3、AP6和AP7;5'端随机引物为ARP2、ARP3和ARP4。

其中，锚定引物包含1个T7启动子序列（ACGACTCACTATAGGGC），可以从3'端直接测序；随机引物包含1个M13通用反向引物序列（ACAATTTCACACAGCA），可以从5'端直接测序。

1.2.2反向Northern检测参照Hicham等[5]，采用Amersham Pharmacia公司的CDP-STAR荧光检测试剂盒（Cat.No.RPN3540、RPN3510），按照使用说明进行。

1.2.3序列测定及同源性分析测序委托上海生工生物工程有限公司进行，同源性分析和序列比较在NCBI中的BLAST程序和DNA软件中完成。

2结果和分析2.1莲座期和包心期叶片的DDRT-PCR分析选用4种锚定引物和3种随机引物，共12种DDRT-PCR反应，电泳结果如图1所示。

结果表明，结球白菜叶片在莲座期和包心期两个发育阶段中基因表达存在着明显差异。

有些cDNA片段只在莲座期或包心期表达，有些cDNA片段在两个时期都表达，也有些cDNA片段在两个时期中存在着表达量的差异。

从中挑选了23个分子量在400bp以上的差异表达的cDNA片段，其中有12个cDNA片段是在包心期特异表达的，有9个在莲座期特异表达，还有两个cDNA片段在两个时期存在表达量的差异。

对其进行回收和再扩增后，进一步鉴定它们的表达情况。

图1.莲座期和包心期结球白菜叶片的mRNA差异显示分析Fig.1.mRNA differential display of Chinese cabbage leaves atthe rosette and folding stagesA，莲座期；B，包心期；M，分子量标准（自上而下为1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350和300bp）；AP，锚定引物；ARP，随机引物。

箭头表示各差异显示片段。

A,rosette stage;B,folding stage;M,DNA standards(from top to bottom:1000,950,900,850,800,750,700,650,600,550,500,450, 400,350and300bp);AP,anchored primer;ARP,random primer. Arrows indicate the differential fragments.2.2反向Northern分析差异显示的DNA片段的进一步鉴定在差异显示分析中至关重要，通常采用的方法是Northern杂交和反向Northern杂交。

前者需要将每个片段进行标记，然后与不同的RNA分别杂交以排除假阳性，工作量大且难度高，需要大量的RNA；后者则以标记的cDNA第一链为探针，与差异片段进行杂交，简便易行。

在该工作中，我们采用了反向Northern 分析。

457农业生物技术学报2003年将回收的23个差异cDNA片段进行了再扩增，将PCR产物定量后，各取200ng的DNA产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳分离，转至尼龙膜上，同时制备两张相同的尼龙膜。

将莲座期和包心期叶片的总RNA进行逆转录反应，作为标记探针，分别与两张膜杂交。

结果发现，所有的差异显示基因在包心期的表达量都没有减少，而且9-1和13-1号两个cD-NA片段代表的基因在包心期时表达量明显增加（图2），另外，片段2和10代表的基因也在包心期的表达量有比较明显的增强。

图2.结球白菜不同发育时期部分差异显示cDNA片段的反向Northern杂交结果Fig.2.Reverse-Northern blotting analysisof the differentially displayed cDNAfragments at the two developmental stagesof Chinese cabbageA，莲座期；B，包心期。

A,rosette stage;B,folding stage.2.3序列分析及同源性比较由DDRT-PCR所获得的cD-NA片段一般长300耀500bp，被称为DD-EST。

对23个cDNA片段进行了序列分析和同源性比较，其中有10个片段虽然所获得的核苷酸序列较长，可以大致推测其编码的氨基酸序列，但是因为有较多的未知核苷酸，未在GenBank中登记。