黑胸散白蚁肠道纤维素酶基因的初步探究
土白蚁属白蚁(Odontotermes)肠道细菌多样性及其降解木质纤维素的功能研究
土白蚁属白蚁（Odontotermes）肠道细菌多样性及其降解木质纤维素的功能研究对化石能源的严重依赖而导致一系列的环境与能源问题已成为亟待解决的全球性问题之一,高效利用以木质纤维素为代表的生物质资源,是实现环境与能源可持续发展的重要突破口。
但由于木质纤维素结构复杂,降解利用难度大,工业规模上高效转化成本高,限制了生物能源的发展。
白蚁及其肠道微生物共生系统因具有独特、高效降解转化木质纤维素的能力,引起了各领域科研人员的广泛关注。
土白蚁属白蚁(Odontotermes)是我国南方常见的一类高等培菌白蚁,占据整个培菌白蚁种群的一半以上,它与真菌以及肠道细菌组成三重共生关系,该体系几乎可以完全降解利用木质纤维素成分而备受关注。
土白蚁属白蚁的共生真菌在木质纤维素特别是木质素的降解方面发挥重要作用。
近年来,已有研究从培菌白蚁肠道细菌群落中发现大量的纤维素和半纤维素酶基因,表明其肠道细菌同样在木质纤维素降解中发挥重要作用,并逐渐成为研究热点。
但目前我们对土白蚁属白蚁肠道细菌的多样性及其降解木质纤维素的功能还缺乏系统而深入的认识。
本文以西双版纳地区长颚土白蚁(Odonotermes longgignathus)、黑翅土白蚁(Odonotermes formosanus)以及Odonotermes sp.YN14这三种土白蚁为研究对象,通过高通量测序的技术,解析土白蚁属白蚁肠道共生细菌的组成及多样性;通过体外培养的方法,发掘白蚁肠道中木质纤维素降解类细菌资源,并对其产酶能力进行定性定量分析;挑选产酶能力较突出的菌株,进一步进行产酶条件优化,并对其应用前景进行了初步探讨。
本研究的主要结果归纳如下:(1)通过16s rRNA高通量测序的手段,成功解析了西双版纳地区长颚土白蚁、黑翅土白蚁、土白蚁YN14中肠道共生细菌的组成与多样性。
研究发现,三种白蚁肠道细菌丰度最高的均为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)以及变形菌门(Proteobacteria)。
木质纤维素高效降解的动物源机制
木质纤维素高效降解的动物源机制叶美瀛;陈雪;刘研萍【摘要】生物质资源在解决能源短缺和环境污染方面有着巨大的潜力,但生物质的低成本高效转化利用机制仍需进行深入研究.在动物源木质纤维素降解体系中,选取低等白蚁进行了系统分析,由于其体内具有高效转化木质纤维素系统,其肠道消化体系是一个非常高效的“生物反应器”.白蚁体内含丰富的木质纤维素降解酶系和高效微生物资源,在白蚁-共生微生物双重作用下,纤维素和半纤维素能够被高效降解.通过分子生物技术,可对纤维素酶和半纤维素酶进行异源表达,表达产物活性高.文章阐述了低等白蚁的木质纤维素降解酶系统,共生微生物的多样性及功能和高效降解木质纤维素机制,以及木质纤维素酶异源表达情况,为生物质低成本、系统的高效转化利用提供新的方向和思路.【期刊名称】《中国沼气》【年(卷),期】2016(034)002【总页数】6页(P18-23)【关键词】低等白蚁;木质纤维素降解酶;共生微生物;异源表达【作者】叶美瀛;陈雪;刘研萍【作者单位】北京化工大学环境科学与工程系,北京100029;北京国能中电节能环保技术有限责任公司,北京100020;北京化工大学环境科学与工程系,北京100029【正文语种】中文【中图分类】S216.4;TQ35木质纤维素主要是由纤维素，半纤维素和木质素组成，是地球上最丰富的可再生资源，具有生物燃料和生物材料生产的潜力[1]。
木质纤维素由于结构复杂，纤维素晶体高度有序，与半纤维素交杂在一起，被性质稳定的木质素包裹起来，而难以被酶和微生物降解，导致其降解率一直不高。
在自然界中，存在许多生物能够以木质纤维素为食来获取营养物质和能量，白蚁就是一类最具代表性的动物，大约2600种白蚁广泛分布在世界范围[2]。
据估计，白蚁每年大约可消耗3～7亿吨的木质纤维素，能高效消化79%～99%的纤维素，对热带和亚热带地区生态系统的碳循环起着非常重要作用[3]。
低等白蚁占总白蚁种类的25%，共有6个科，分别为草白蚁科、原白蚁科、澳白蚁科、木白蚁科、齿白蚁科和鼻白蚁科[4]，在我国长江以南城市广泛分布存在，典型的有家白蚁、散白蚁、木白蚁和原白蚁等[5]。
白蚁肠道纤维素酶菌株筛选及生长条件研究
纤维素是植物残体 的主要成分之一 ， 约占植物干重
材的生产和园林观赏植物的生长 ， 并破坏景观。农产品 中的甘蔗 、 木薯、 花生、 芋头、 、 玉米、 桑 茶、 小麦 、 烟草 、 板 栗等都会受到白蚁的危害。此外 ， 白蚁还能危害电缆、 交
的 ３ ．％ － ０ Ｏ 是地球上丰富的ห้องสมุดไป่ตู้再生资源 ， ３４ ５ ．％， 在每年
中 图分 类 号 ：９９ １２ 文献 标 识 码 ： 文 章 编 号ｊ０ １— ５ １２ １ ） ８ ０ ８ ０ Ｑ ３ ．３ Ａ １０ ８８ （０ ２ ０ — ０ １— ４
Ｓ ｒ ｅ ｉ ｇ Ｏ Ｕ ｌａ ｅ Ｓ ｒ ｉ ｒ ｍ ｎ ｅ ｔｎ ｓ ｏ ｒ ｔ ｎ Ｉｓ Ｇｒ ｗｔ ｎ ｔｏ ｃ ｅ ｎ ｎ ｆＣｅ ｌｌｓ ｔ ａ ｎ ｆ ｏ ｌ ｔ ｓｉ ｅ ｆ Ｔｅ ｍｉｅ ａ ｄ ｔ ｏ ｈ Ｃｏ ｄｉｉ ｎ
酶 系 。纤维 素酶 （ ｅｕ ｓ） 源 广 泛 ， 自然 界 有 许 Ｃ ｌｌ ｅ 来 ｌｏ 在 多可 分泌纤 维素 酶 的微 生 物 ， 要包 括 真 菌 、 菌 、 线 主 细 放
本试验主要通过分离和筛选 白蚁体 内高产纤维素
酶 的菌株 ， 一步 了解 白蚁 肠 道 内微 生 物 的生 态 和生 理 进
２ ｎｔｕｅ ｆ ｇ ｃｌ ｒ ｉ ｏｉａ Ｅ ｇｎｅ ｎ ｕａ ｒｖ ｃ ， ｈｎｓａ４０２ ， ｈ ａ ．Ｉｓｔｔ ｏ ｕｕａ Ｂｏ ｇ ｌ ｎｉｅｒ ｇｉ Ｈ ｎｎＰｏｉ ｅ Ｃ ａｇｈ １１８ Ｃ ｉ ） ｉ Ａ ｔ ｌ ｌ ｃ ｉ ｎ ｎ ｎ
Ａｂｓｒ ｃ ｔａ ｔ：Ｔ ａ ｔ ｒａ ｔａｎ ｗｈｉｈ ｃ ｕｌ ｒ ｄ ｃ ｃ ｅｌ ｌ ｓ ｓ ｉｏ ￣ｅ ａ ｃ ｅ ｎ ｄ ｏ ｔｆｏ ｔ ｅ ｉｔ ｓｉ ｅ ｉｉ ｇｔ ｒ ｈｅ ｂ ｃｅｉｌｓｒ ｉ ｃ ｏ ｄ ｐ ｏ ｕ ｅ ｍｕ ｈ ｃ ｌｕ ａ ｅ ｗａ ｓ ｌ ｄ ｎｄ ｓ ｒｅ ｅ ｕ ｒ ｍ ｈ ｎ ｅ ｔｎ ｓｏ ｌｖｎ ｅ ． ｆ
白蚁消化道及肠道微生物研究简述
摘要： 白蚁的消化道分前 、中、后肠，不同种类及 品级之间在结构上会有一定 的差异 。低等 白蚁消化道 中有 各种 原生动物 、细菌 、螺旋体和耗氢微生物等，对维持 白蚁的各种生理活动具有重要的意义。本文对白蚁 消化道 结构 及体 内的各种微生物做 了简单概述 。 关键 词： 白蚁 ；消化道 ；原生动物；细菌
（ｏ ｈ ｍｏ ｓ 蟋蟀 中有存 在外 ， 余也 只 限于低 等 Ｌ ｐ ｏ ａ） 在 其 白 蚁 及 隐 尾 蠊 的 消 化 道 内 。 毛 滴 虫 目 中 所 有 Ｄ ｖ ｓｏ ｉｉａ ｅ ｅｃ ｖｎｄｅ和 Ｃ ｌｎ ｍｐ ｌａ 、 量单尾 滴 虫科 ａ ｙ ｈｄ ｅ 少 ｏ
后 肠 的混 生节，有 大量 的共 生微生物 ，这 些微 生物可 降解 纤 维素 和半 纤维 素 ，发酵成 短链 的脂肪酸 ，脂 肪酸 被 白蚁 吸收 氧化 。几乎所 有 的实验证 据表 明低等 白 蚁 后肠 中共 生物 （ 包括 原生动 物 ）是纤维 素和 半纤 维 素消 化 的驱动 力 。高 等 白蚁 其消化 木质 素主要 依 靠 自身分泌 的消化液 ｌ。包 括 唾腺 、 中肠都 是消 化 ４ Ｊ
和 一些个 体大 ， 己分 化 的毛滴 虫科（ｒ ｈｍｏ ａｉａ） Ｔｉ ｏ ｎｄｄｅ ｃ
鞭毛虫都只存在于低等 白蚁消化内【。 ６ 】
１３ 年 Ｈ ｎａ ９８ ｕ ｇｔ 已经 提 出 白蚁 利用共 生物 消 ｅ就 化木 质 的过程 ，即木质 纤维 进入 白蚁 消化 系统后 ， 被 消化道 中 的原 生动物 吸 收，在 原生动 物体 内被 氧 化 为乙酸 ，二氧 化碳和 氢气 ， 乙酸 被 原生动 物分 泌
黑胸散白蚁工蚁与工蚁型补充生殖蚁体内抗氧化酶和解毒酶的活性及基因表达变化
黑胸散白蚁工蚁与工蚁型补充生殖蚁体内抗氧化酶和解毒酶的活性及基因表达变化董亚楠;牛童;吴佳;王超;张贺【期刊名称】《昆虫学报》【年(卷),期】2022(65)10【摘要】【目的】社会性白蚁的工蚁可以转化成补充生殖蚁参与生殖,提高自身适合度。
本研究旨在探究工蚁转变成补充生殖蚁后,与氧化应激抗衰老相关的抗氧化酶和解毒酶活性的变化,为揭示生殖蚁的繁殖和抗衰老机制提供参考。
【方法】利用生化方法分别测定黑胸散白蚁Reticulitermes chinensis工蚁、工蚁型补充生殖蚁和原始生殖蚁体内的2种抗氧化酶过氧化氢酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)与4种解毒酶酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)、羧酸酯酶(carboxylesterase,CarE)和细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)的酶活性;同时利用qRT-PCR检测这些酶对应的基因RsCAT,RsSOD,RsACP,RsCYP450和RsCarE的表达量。
【结果】与雌性工蚁相比,黑胸散白蚁工蚁型补充生殖蚁体内的CAT,SOD,ACP,AKP和CarE 活性显著上升,分别达到雌性工蚁的5.82,1.41,1.39,2.27和2.70倍,CYP450活性在两品级间没有显著差异;RsCAT,RsSOD,RsACP,RsCarE和RsCYP450的表达量也显著增加。
补充生殖蚁体内CAT和ACP活性显著高于原始生殖蚁的,而SOD和AKP活性在两品级间没有显著差异;雌雄补充生殖蚁RsCAT的相对表达量分别是原始生殖蚁的5.68和3.60倍,RsACP的相对表达量分别是原始生殖蚁的81.12和46.72倍。
【结论】黑胸散白蚁工蚁由非生殖品级转化为生殖品级以后,体内抗氧化酶和解毒酶的酶活力和基因表达水平显著升高,从一定程度上揭示了生殖品级的抗衰老机制。
白蚁肠道纤维素分解菌的筛选鉴定及产酶条件的研究
基、 牛肉膏蛋白胨培养基 、 酵母膏琼脂培养基 、 PDA 培养基 ; 发酵产酶培养基 。 [5] 1. 1. 3 试剂 DNS试剂 ( 3, 5 - 二硝基水杨酸 ) ,不同 pH 值的柠檬酸缓冲液的配制 。
1. 2 方法
[4]
φ =用 75%的酒精对白蚁表面进行消毒 ,在用蒸馏水洗 3 次 ,待用 。 1. 2. 1 白蚁的处理
收稿日期 : 2009 - 08 - 29 修回日期 : 2009 - 09 - 16 基金项目 : 江西农业大学博士启动基金 ( 2004 )资助 作者简介 : 黄小晖 ( 1983 - ) ,男 ,硕士生 ,主要从事微生物资源开发研究 , 3 通讯作者 : 霍光华 ,教授 ,博士 , E - mail: hgh3813899@ sohu. com。 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reser西 农 业 大 学 学 报
第 31 卷
为了确定分离得到的菌株是否为白蚁 肠道菌 。本试验中 , 分离白蚁肠道菌的过 程中平行做了 2 组对照 , 1 组是用消毒过 的白蚁表面在营养培养基上滚动擦拭 , 1 组为实验室空气中微生物的检测 , 只有在
2 组对照平板上没有杂菌生长的情况下才
第 31 卷第 6 期 2009 年 12 月
江 西 农 业 大 学 学 报 Acta Agriculturae Universitatis J iangxiensis
Vol . 31, No. 6 Dec. , 2009
文章编号 : 1000 - 2286 (2009) 06 - 1140 - 06
图 1 菌 BY8 形态特征 (10 × 100)
黑翅土白蚁纤维素酶开发利用前景
１６４
城市害虫综合治理进展——全国第七届城市昆虫学术研讨会论文集
酶功能基因，以便为系统研究和利用白蚁纤维素酶功能基因奠定基础，我国白蚁工作者有必要 加大这方面的研究，尽快克隆与表达出自蚁源纤维素酶基因，并弄清其生物学功能，以便为今 后开发利用白蚁源纤维素酶生物工程菌株进行生物能源工业化生产创造条件。
ＣａＥＧ（ＡＦ３３６１２０，未出版）、栖北散白蚁的ＲｓＥＧ和ＲｓＥＧ２（ＡＢ００８７７８，ＡＢ０１９０９５）、高山象白 蚁的ＮｔＥＧ（ＡＢ０１３２７２）、Ｎ．ｗａｌｋｅｒｉ的ＮｗＥＧ（ＡＢ０１３２７３），以及达尔文澳白蚁Ｍａｓｔｏｔｅｒｍｅｓ ｄａｒｗｉｎｉｅｎｓｉｓ的ＭｄＥＧ（ＡＪ５１１３４３，未出版）。利用多序列联配Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（１．８１）软件包对上述８ 种编码Ｃ。酶的基因进行序列分析后发现，这８个基因彼此间的相似性高达７０％以上［２
５．６
改为ｐＨ ６．５时，酶分子上催化酸／碱的Ｇｌｕ４１ ２的侧链结构会发生变化，使得酶在较高的ｐＨ 值条件下活性降低口“。 目前，白蚁纤维素酶研究的重点，已从过去单纯地探讨纤维素酶的来源与活性转移到了纤 维素酶编码基因的克隆和表达及其功能分析方面。然而，至今为止，我国白蚁科技工作者除对 几种白蚁的纤维素酶活性作了初步研究外［２１，３２～３４］，还未从白蚁体内克隆出编码纤维素酶的基 因，更未对这些基因的功能进行生物学研究。因此，为了获得具有自主知识产权的白蚁纤维素
资
源
昆
莫建初
（浙江大学城市昆虫学研究中心，浙江杭州３１００２９）
摘
要
能源短缺是我国经济可持续发展的重要障碍，大力发展生物能源是解决能源短缺的重要途径。
黑翅土白蚁是一种利用植物纤维作为食物的古老生物，研究其体内分解植物纤维的纤维紊酶编码基因并弄 清其功能，对人类直接转化植物纤维成酒精作为替代能源，显然具有十分重要的启迪作用。本文介绍了国内 能源现状和生物质能源开发、利用的前景及途径，为今后发展高效的纤维素酶基因工程菌株提供了有益的背 景信息。
两种木食性白蚁肠道微生物源糖苷水解酶多样性和酶学特性研究
两种木食性白蚁肠道微生物源糖苷水解酶多样性和酶学特性研究木食性白蚁高效降解纤维素的能力与其体内丰富的纤维素酶系有关。
高等白蚁和低等白蚁肠道均有多种共生微生物,其中很多微生物都具有产纤维素酶的能力,在木质纤维素的降解过程中发挥重要作用。
目前已经从白蚁肠道共生微生物中发现了多种纤维素酶、半纤维素酶基因,但有关这些酶的特性及其在白蚁木质纤维素降解过程中的作用与机制的研究还很缺乏。
本文分别以低等白蚁黑胸散白蚁(Reticulitermes chinensis Snyder)和高等白蚁海南象白蚁(Nasutitermes hainanensis)为对象,研究了木食性白蚁肠道共生微生物来源的纤维素酶基因的多样性,并研究了 3个纤维素酶以及半纤维素酶的体外酶活和特性,为阐明白蚁体内木质纤维素的降解机理以及共生微生物与木食性白蚁之间的共生机制,提供新的理论指导。
本论文的主要研究结果如下:1.对从黑胸散白蚁分离到的疣微菌Opitutaceaesp.TSB-47进行了全基因组测序。
该菌基因组大小为7.29Mb,具有5520个编码基因,染色体中的G+C含量为62.88%。
疣微菌Opitutaceae sp.TSB-47基因组中含有多个纤维素酶基因,包括3个内切葡聚糖酶基因,14个葡萄糖苷酶基因;还含有多种多样的半纤维素酶基因,其中木聚糖酶基因有4个,β-木糖苷酶基因有3个,半乳糖苷酶基因有41个。
选取其中的7个进行异源表达,仅有一个木聚糖酶基因获得了可溶性蛋白,命名为Xyn1959。
经NCBI比对,Xyn1959与来源于疣微菌Pedosphaera parvula的内切-β-1,4-木聚糖酶的序列相似性最高(62%)。
对纯化的Xyn1959蛋白进行酶活性质研究,Xyn1959最适反应温度为35℃,最适反应pH值为5.2,在pH4.4到pH7.6的范围内,酶活性均在60%以上,在15～45℃的温度范围内进行酶促反应时能保持一半以上的活性,具有较广的温度作用范围。
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!基金项目：国家自然科学基金项目（３０５７００３４）通讯作者：杨红，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｙａｎｇ０２０２＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ作者简介：杜蕾蕾（１９８１－），女，山东威海人，华中师范大学生命科学学院２００５级硕士研究生，研究方向为微生物分子生物学。
白蚁是自然界为数不多的能消化纤维素的昆虫之一，其食物来源主要是木质纤维素类物质，如树皮、树干、朽木、干草及富含腐殖质的土壤等。
纤维素是地球上最丰富的可再生生物质资源，是多个葡萄糖残基以β－１，４－糖苷键连接而成的多聚物。
木质纤维素的降解需纤维素酶的参与，而纤维素酶是能将纤维素水解成葡萄糖的一组酶的总称。
据报道，自然界每年通过光合作用产生的纤维素８９％尚未被人类利用。
因此对包括白蚁在内的能消化纤维素的生物体内相关纤维素酶的研究成了近年来的热点。
低等白蚁能依靠内源和外源纤维素酶将木质纤维素降解为可完全吸收利用的营养物质［１］［２］［３］。
虽然很早就发现了低等白蚁共生鞭毛虫降解纤维素的现象，但有关纤维素酶基因方面的研究却开始的比较晚［４］。
２０００年日本学者Ｏｈｔｏｋｏ从栖北散白蚁（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓｓｐｅｒａｔｕｓ）中克隆出了纤维素酶ＧＨＦ４５家族的的多种基因，荧光原位杂交显示纤维素酶基因来源于鞭毛虫［５］。
Ｎａｋａｓｈｉｍａ等人也从台湾乳白蚁后肠中克隆出一种纤维素酶基因。
迄今为止，人们已经从白蚁肠道中得到分属于糖基水解酶家族ＧＨＦ５、ＧＨＦ７和ＧＨＦ４５的多种纤维素酶基因［６］［７］［８］。
本文报道了对低等白蚁黑胸散白蚁纤维素酶基因的初步研究结果。
１．材料和方法１．１材料１．１．１白蚁的采集和饲养黑胸散白蚁（ＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＳｎｙｄｅｒ）采集自武汉市狮子山树林内，在实验室条件下用内盛松木的塑料盒饲养，选用工蚁为实验材料。
１．１．２主要试剂和仪器１．１．２．１试剂磷酸缓冲液ＰＢＳ（１３６．８９ｍＭＮａＣｌR ２．６８ｍＭＫＣｌR４．０５ｍＭＮａ２ＨＰＯ４R １．４７ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ＰＨ７．４）；Ｔｒｉｚｏｌ、反转录酶Ｍ－ＭＬＶ均为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品；ＤＮＡ序列的合成和测序由北京利嘉泰成科技有限公司完成；Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ均购自天源公司；克隆载体为ｐＧＥＭ－ＴｅａｓｙＶｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；５｀ＲＡＣＥ试剂盒为ＴＡＫＡＲＡ公司产品。
１．１．２．３仪器ＲＣＲ仪为Ｂｉｏｒａｄ公司产品１．２方法１．２．１ＲＮＡ的提取和ＲＴ－ＰＣＲ收集黑胸散白蚁工蚁３０条，依次以７０％酒精、无菌蒸馏水清洗其表面。
用尖头镊子将工蚁肠道拉出，小心刺破后肠将肠液挤入含有１ｍｌＰＢＳ的ＥＰ管中，离心去上清，沉淀物包括后肠所有的微生物。
Ｔｒｉｚｏｌ法提取混合物的总ＲＮＡ。
用ｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）１７和反转录酶合成ｃＤＮＡ第一条链［９］，然后以糖基水解酶家族ＧＨＦ７基因的特异性引物（ｃｆＦ５｀－ＡＡＹＣＡＲＧＣＩＧＡＲＡＡＹＣＡＹＣＣ－３｀，Ｆ７Ｒ５｀－黑胸散白蚁肠道纤维素酶基因的初步探究!杜蕾蕾，杨红b（华中师范大学生命科学学院昆虫学研究所农药与化学生物学教育部重点实验室，武汉４３００７９）摘要：白蚁是自然界为数不多的能消化纤维素的昆虫之一。
白蚁对木质纤维素的消化作用与其体内的纤维素酶与肠道内的共生微生物密切相关。
本文报道了对广泛分布于我国的一种木食性白蚁，黑胸散白蚁（ＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓＣｈｉｎｅｓｅＳｎｙｄｅｒ）肠道纤维素酶基因的初步研究结果。
通过ＲＴ－ＰＣＲ得到五个纤维素酶基因的部分序列，由３｀ＲＡＣＥ和５｀ＲＡＣＥ技术分别得到纤维素酶基因ｃＤＮＡ３｀末端五个６２０ｂｐ左右的核苷酸序列和５｀末端八个８００ｂｐ的核苷酸序列。
对序列的分析表明，黑胸散白蚁肠道纤维素酶基因与ＧＨＦ７家族具有较高的同源性。
本实验为进一步研究黑胸散白蚁纤维素酶基因的多样性和功能奠定了基础。
关键词：黑胸散白蚁；肠道；纤维素酶基因中图分类号：Ｑ９３６文献标识码：Ａ华中师范大学研究生学报ＨｕａｚｈｏｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅｓ第１５卷第１期Ｖｏｌ．１５Ｎｏ．１２００８年５月Ｍａｙ２００８１３０ＧＣＹＴＣＣＣＡＤＡＴＲＹＣＣＡＴＹＴＣ－３）扩增纤维素酶基因的中间序列［８］。
ＰＣＲ反应条件为：９４℃预变性３ｍｉｎ，３０个循环（９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ），最后７２℃再延伸７ｍｉｎ，目的基因连接到ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体然后测序。
１．２．２纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的扩增以引物ｃｆＦ、ＲＦ７Ｒ（５＇ＧＡＲＡＴＧＧＲＹＡＴＨＴＧＧＧＡＲＧＣ３＇）和接头引物（５′－ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ（Ｔ）１７－３′）用３｀ＲＡＣＥ技术合成纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的３｀末端。
第一步ＰＣＲ扩增以接头引物和ｃｆＦ为引物；第二步反应以第一步ＰＣＲ产物为模板，接头引物和ＲＦ７Ｒ为引物进一步扩增纤维素酶基因的３｀末端序列。
两步ＰＣＲ的反应体系均为：１０ｘＰＣＲ缓冲液５μｌ，ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）０．５μｌ，引物（５０ｍＭ）各０．５μｌ，模板ＤＮＡ５μｌ，Ｔａｑ酶１Ｕ，其余用超纯水补足至５０μｌ。
ＰＣＲ反应条件同上。
最后将目的基因连接到ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体测序［１３］。
依据ｃＤＮＡ３｀末端序列设计下游特异性引物（ＧＳＰ１５｀－ＡＧＴＡＡＧＴＴＧＡＧＴＣＡＡＴＴＧＧＡＣＣ－３｀，ＧＳＰ２５｀－ＧＣＴＴＴＧＡＡＧＴＣＧＴＴＣＴＴＧＴＣ－３｀），以５｀ＲＡＣＥ试剂盒扩增纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的５｀末端序列。
２．结果和分析２．１ＲＴ－ＰＣＲ扩增纤维素酶基因部分序列采用兼并引物ＲＴ－ＰＣＲ得到目的基因条带长度为６３０ｂｐ左右（图１）。
将目的基因连接到ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体上，转化感受态细胞ＤＨ５α，筛选出阳性克隆测序得到五个纤维素酶基因的中间序列。
根据在ＮＣＢＩ数据库中ＢＬＡＳＴ搜索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）发现这五个基因与与其它散白蚁纤维素酶基因ＧＨＦ７同源性最高。
图１黑胸散白蚁纤维素酶基因的ＲＴ－ＰＣＲＭ：ｍａｒｋｅｒ１：黑胸散白蚁肠液微生物的总ＲＮＡ２．２纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ３｀末端的扩增以总ＲＮＡ反转录合成的第一条链ｃＤＮＡ为模板采用巢式ＰＣＲ扩增纤维素酶基因的３｀末端序列，得到长度为７４０ｂｐ左右的目的条带，如图２所示。
将ＰＣＲ产物连接到Ｔ－ｅａｓｙ载体上，测序得到五个纤维素酶基因的３｀末端序列。
经比对分析表明所得到的序列为ＧＨＦ７基因，且序列３＇端含ｐｏｌｙＡ，说明３＇ＲＡＣＥ已完成。
图２黑胸散白蚁纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的３｀ＲＡＣＥＭ：ｍａｒｋｅｒ１：黑胸散白蚁肠液微生物的总ＲＮＡ２．３纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ５｀末端的扩增根据３｀ＲＡＣＥ得到的五个序列的保守区设计的特异性引物，采用５｀ＲＡＣＥ试剂盒扩增纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的５｀末端序列，得到长度为１１４５ｂｐ左右的ＰＣＲ产物，如图３所示。
经与ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体连接并转化大肠杆菌ＤＨ５α，测序得到８个核苷酸序列，经比对分析表明所得到的序列为ＧＨＦ７基因。
这八个序列彼此之间的相似性高于９７％，并且与３｀末端ｃＤＮＡ序列能拼接起来。
图３纤维素酶ＧＨＦ７ｃＤＮＡ的５｀ＲＡＣＥＭ：ｍａｒｋｅｒ１：纤维素酶基因５｀末端扩增条带３．讨论纤维素是地球上最丰富的可再生的生物质资源，１３１大部分纤维素并没有得到很好的利用，充分利用纤维素不仅能有效地解决目前世界上面临的食物、饲料、以及能源短缺的问题，而且在医药领域纤维素酶的应用也越来越受到重视［１０］。
本研究以黑胸散白蚁为材料克隆其肠道纤维素酶基因，初步得到了纤维素酶ＧＨＦ７家族基因ｃＤＮＡ接近全长的核苷酸序列。
ＢＬＡＳＴ分析表明从黑胸散白蚁肠道得到的纤维素酶ＧＨＦ７基因与从其它白蚁如家白蚁（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ）肠道共生鞭毛虫中得到的ＧＨＦ７基因同源性最高，说明糖基水解酶家族ＧＨＦ７类的纤维素酶在白蚁纤维素消化中起着重要的作用。
白蚁肠道纤维素降解的复杂过程往往与多种纤维素酶相关［１１］，因此，对黑胸散白蚁肠道纤维素酶多样性和功能的进一步研究是必要的。
参考文献［１］Ｔｉａｎ－ｃｉＹａｎｇ，Ｊｉａｎ－ｃｈｕＭｏ，Ｊｉａ－ａｎＣｈｅｎｇｌ．ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｏｍｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｆｒｏｍＯｄｏｎｔｏｔｅｒｍｅｓｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（Ｉｓｏｐｔｅｒａ：ｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ）［Ｊ］．ＥｎｔｏｍｏｌｏｇｉａＳｉｎｉｃａ，２００４，１１（１）：１－１０．［２］ＧａｋｕＴｏｋｕｄａ，ＮａｔｈａｎＬｏ，ＨｉｒｏｆｕｍｉＷａｔａｎａｂｅ，，ｅｔａｌ．Ｍａｊｏｒａｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｔｅｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｃｅｌｌｕｌａｓｅｓｉｎｍｅｍｂｅｒｓｏｆａｎａｐｉｃａｌｔｅｒｍｉｔｅｌｉｎｅａｇｅ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｃｏｌｏｇｙ，２００４，１３：３２１９－３２２８．［３］ＫｅｉｓｕｋｅＮａｋａｓｈｉｍａ，ＨｉｒｏｆｕｍｉＷａｔａｎａｂｅ，ＨｉｔｏｓｈｉＳａｉｔｏｈ，ｅｔａｌ．Ｄｕａｌｃｅｌｌｕｌａｓｅ－ｄｉｇｅｓｔｉｎｇｓｙｓｔｅｍｏｆｔｈｅｗｏｏｄ－ｆｅｅｄｉｎｇｔｅｒｍｉｔｅ，Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ（Ｓｈｉｒａｋｉ）［Ｊ］．ＩｎｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００２，３２：７７７－７８４．［４］ＭｏｒｉｙａＯｈｋｕｍａ，ＫｕｎｉｙｏＯｈｔｏｋｏ，ＴｏｓｈｉｙａＩｉｄａｅｔａｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｙｐｅｒｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ，Ｓｐｉｒｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ，Ｈｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓ，ａｎｄｐａｒａｂａｓａｌｉａｎｓｙｍｂｉｏｎｔｓｉｎｔｈｅｈｉｎｄｇｕｔｏｆｔｅｒｍｉｔｅｓ［Ｊ］．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，４７：２４９－２５９．［５］ＫｕｎｉｙｏＯｈｔｏｋｏ，ＭｏｒｉｙａＯｈｋｕｍａ，ｅｔａｌ，．Ｄｉｖｅｒｓｅｇｅｎｅｓｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓｏｆｇｌｙｃｏｓｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅｆａｍｉｌｙ４５ｆｒｏｍｔｈｅｓｙｍｂｉｏｔｉｃｐｒｏｔｉｓｔｓｉｎｔｈｅｈｉｎｄｇｕｔｏｆｔｈｅｔｅｒｍｉｔｅＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓｓｐｅｒａｔｕｓ［Ｊ］．ｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ，２０００，４：３４３－３４９．［６］ＨｉｒｏｆｕｍｉＷａｔａｎａｂｅ，ＫｅｉｓｕｋｅＮａｋａｓｈｉｍａ，ＨｉｔｏｓｈｉＳａｉｔｏｈ，ｅｔａｌ．Ｎｅｗｅｎｄｏ－β－ｇｌｕｃａｎａｓｅｓｆｒｏｍｔｈｅｐａｒａｂａｓａｌｉａｎｓｙｍｂｉｏｎｔｓ，ＰｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａｇｒａｓｓｉｉａｎｄＨｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓｍｉｒａｂｉｌｅｏｆＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓｔｅｒｍｉｔｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．ＬｉｆｅＳｃｉ，２００２，５９：１９８３－１９９２．［７］ＴｅｔｓｕｓｈｉＩｎｏｕｅ，ＳｈｉｇｅｈａｒｕＭｏｒｉｙａ，ＭｏｒｉｙａＯｈｋｕｍａ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍａｓｙｍｂｉｏｔｉｃｐｒｏｔｉｓｔｏｆｔｈｅｌｏｗｅｒｔｅｒｍｉｔｅ，Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，２００５，３４９：６７－７５．［８］Ｋｅｉｓｕｋｅ．Ｎａｋａｓｈｉｍａ，ＨｉｒｏｆｕｍｉＷａｔａｎａｂｅ，Ｊｕｎ－ｉｃｈｉＡｚｕｍａ．ｅｔａｌ．ＣｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｆｒｏｍｔｈｅｐａｒａｂａｓａｌｉａｎｓｙｍｂｉｏｎｔＰｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａｇｒａｓｓｉｉｉｎｔｈｅｈｉｎｄｇｕｔｏｆｔｈｅｗｏｏｄ－ｆｅｅｄｉｎｇｔｅｒｍｉｔｅＣｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．ＬｉｆｅＳｃｉ．，２００２，５９：１５５４－１５６０．［９］ＧａｋｕＴｏｋｕｄａ，ＮａｔｈａｎＬｏ，ＨｉｒｏｆｕｍｉＷａｔａｎａｂｅ，ｅｔａｌ．Ｍｒｔａｚｏａｎｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｆｒｏｍｔｅｒｍｉｔｅｓ：ｉｎｔｒｏｎ／ｅｘｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄｓｉｔｅｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４４７：１４６－１５９．［１０］陈小坚．纤维素酶的分子生物学研究及应用进展．湖北民族学院学报．科学版２００６，２３（４）：４８１．［１１］ＭａｒｓｈａＭ．Ｗｈｅｅｌｅｒ，ＸｕｇｕｏＺｈｏｕ，ＭｉｃｈａｅｌＥ．Ｓｃｈａｒｆ＿，ＦａｉｔｈＭ．Ｏｉ１，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｄｙｎａｍｉｃｓｈｉｆｔｓｏｆｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｐｒｏｔｏｚｏａｉｎＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓｆｌａｖｉｐｅｓ［Ｊ］．ＩｎｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，３７（２００７）：１３６６－１３７４．ＰｒｉｍａｒｙＳｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅＣｅｌｌｕｌａｓｅＧｅｎｅｓｉｎｔｈｅＧｕｔｏｆＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓＣｈｉｎｅｓｅＳｎｙｄｅｒＤＵＬｅｉ－ｌｅｉ，ＹＡＮＧＨｏｎｇ（ＫｅｙｌａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｅｓｔｉｃｉｄｅ＆ＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎmＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｕａｚｈｏｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７９，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｅｒｍｉｔｅｓａｒｅｏｎｅｏｆｔｈｅｆｅｗｉｎｓｅｃｔｓｗｈｉｃｈｃａｎｄｅｇｒａｄｅｃｅｌｌｕｌｏｓｅｉｎｔｈｅｎａｔｕｒｅ．Ｔｈｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌｏｓｅｗａｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｅｒｍｉｔｅ＇ｓｇｕｔｓｙｍｂｉｏｎｔｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ．Ｐｒｉｍａｒｙｓｔｕｄｉｅｓｏｎｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｆｒｏｍａｗｏｏｄ－ｆｅｅｄｉｎｇｔｅｒｍｉｔｅ，ＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓＣｈｉｎｅｓｅＳｎｙｄｅｒｗｈｉｃｈｉｓｗｉｄｅｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎＣｈｉｎａｗａｓｒｅｐｏｒｔｅｄ．ＦｉｖｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｐａｒｔｉａｌｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ．Ｆｉｖｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ３＇－ｅｎｄ（６２０ｂｐ）ａｎｄｅｉｇｈｔｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ５＇－ｅｎｄ（８００ｂｐ）ｏｆｔｈｅｃＤＮＡｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙ３｀ＲＡＣＥａｎｄ５｀ＲＡＣＥ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＢｌａｓｔｓｅａｒｃｈｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｏｆＲ．ＣｈｉｎｅｓｅＳｎｙｄｅｒｓｈａｒｅｄｈｉｇｈｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｔｏｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｗｈｉｃｈｂｅｌｏｎｇｓｔｏＧＨＦ７ｆａｍｉｌｙ．ＦｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｉｅｓｗｉｌｌｆｏｃｕｓｏｎｔｈｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓｉｎＲ．ＣｈｉｎｅｓｅＳｎｙｄｅｒ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＲｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＳｎｙｄｅｒmｇｕｔmｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｅｎｅｓ指导老师杨红责任编辑王媛１３２。