纤维素酶基因工程菌pHBM_End培养条件的研究[1]

基金项目：四川省教育厅自然科学科研项目（２００５Ａ０３０）

＊通讯作者

纤维素酶是一类能够降解纤维素，使之生成纤维二糖和葡萄糖等一系列酶的总称，按各酶功能的不同可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶三大类（谢占玲和吴润，２００４），在协同作用下它们可以将纤维素物质彻底水解成葡萄糖，进而发酵产生乙醇，解决能源再生以及环境污染等问题。

目前，纤维素酶成本高及酶活力低严重制约其在生产中的广泛应用。为解决这个问题，一方面需要筛选高产量和高酶活力的纤维素酶产生菌，另一方面就是通过现代的基因工程手段，构建高效表达的基因工程菌，或通过对已知的纤维素酶进行分子改造以提高其比活力。由于筛选原始菌株工作量大，且产量一般情况下较基因工程菌低，所以构建高效表达的基因工程菌是降低纤维素酶成本、提高产量的有效手段。目前，国内外鲜见在巨大芽孢杆菌中表达内切葡聚糖酶的报道。本试验以工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ为研究对象，对其产酶条件进行优化，通过优化培养条件以进一步提高表达量，为实现基因工程菌产业化奠定基础。

１材料与方法

１．１菌种来源四川农业大学生命科学与理学

院生物化学与分子生物学实验室自行构建保存的基因工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ。

１．２培养基ＬＢ培养基：１％胰蛋白胨，１％Ｎａ－

Ｃｌ，０．５％酵母浸出粉，ｐＨ７．０～７．５；配制固体培养基时需加入１．５％～２．０％的琼脂粉；配制抗生素培养基时需加入四环素（终浓度为１０μｇ／ｍＬ）。ＬＢ－ＣＭＣ培养基：在ＬＢ培养基中加入０．５％的羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）。

１．３生物量测定将培养液稀释２５倍，用７２１－型分光光度计在６００ｎｍ下测定光密度，以未接

种的培养基等量稀释液作对照。

１．４酶活力测定参照郑淑霞等（２００４）方法。以１ｍＬ１％（ｍ／Ｖ）羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）溶液为底物，加入０．１ｍＬ适当稀释的酶液并混匀，置水浴锅中５０℃静置保温３０ｍｉｎ，然后加入２．５ｍＬ

二硝基水杨酸钠（ＤＮＳ）溶液，混匀后置１００℃煮沸５ｍｉｎ，取出后用流水冷却至室温，定容至

５ｍＬ，最后在５３０ｎｍ波长处测得各管溶液的吸光值并计算酶活力。对照先加ＤＮＳ，后加酶液，其余步骤不变。在上述条件下，１ｍＬ原酶液每分钟催

化底物产生相当于１μｇ葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（Ｕ／ｍＬ）。

１．５种龄（Ｘ１）对产酶的影响从平板上挑取一

纤维素酶基因工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ培养条件的研究

四川农业大学生命科学与理学院

韩学易

陈

惠＊胥

兵

阮景军

［摘要］对基因工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ培养条件优化的研究结果表明：２５０ｍＬ三角瓶中装入５０ｍＬＬＢ培养基（含

有１０μｇ／ｍＬＴｅｔ），按５％的接种量接种种龄为１２ｈ的液体种子，培养４ｈ后加入终浓度为０．２％的木糖进行诱导，

９ｈ后上清液中酶活可达８８９Ｕ／ｍＬ，是出发菌株Ｃ－３６（７９．２Ｕ／ｍＬ）的１１．２２倍。

［关键词］巨大芽孢杆菌；内切葡聚糖酶；培养条件［中图分类号］Ｓ８１６．３２

［文献标识码］Ａ

［文章编号］１００４－３３１４（２００８）１７－００１４－０４

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＴｈｅｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｔｒａｉｎｐＨＢＭ－Ｅｎｄｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｃｕｌｔｕｒｅｗｅｒｅ：ｖｏｌｕｍｅ５０ｍＬ，ｔｈｅｓｅｅｄａｇｅ１２ｈ，ｔｈｅｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｒａｔｅ５％，ｔｈｅｉｎｄｕｃｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ０．２％，ａｎｄｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｉｍｅ９ｈ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅｉｓｕｐｔｏ８８９Ｕ／ｍＬｗｈｉｃｈｉｓａｂｏｕｔ１１．２２ｔｉｍｅｓｏｆｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｓｔｒａｉｎ（７９．２Ｕ／ｍＬ）．

［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ＢａｃｉｌｌｕｓＭｅｇａｔｅｒｉｕｍ；ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ；ｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ

图３接种量与菌体浓度和产酶的关系

１．４

１．２１０．８

０．６０．４０．２０１

２

３

４５

６

接种量／％

酶活力／（Ｕ／ｍＬ）

６１０

６００５９０５８０５７０５６０５５０菌体浓度（ＯＤ６００）

酶活力

菌体浓度（ＯＤ６００）

５４０

１．６图２

工程菌种龄曲线

图１

工程菌生长曲线

１．４

１．２１０．８０．６０．４０．２０６

８

１０

１２

１４

１６

１８

２０

时间／ｈ

菌体浓度（ＯＤ６００）

１．４１．２１０．８

０．６０．４０．２０

６

８

１０

１２

１４

１６

１８

２０

种龄／ｈ

酶活力／（Ｕ／ｍＬ）

６３０６１０

５９０５７０５５０５３０５１０

菌体浓度（ＯＤ６００）

酶活力

菌体浓度（ＯＤ６００）

环ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ单菌落接种１０ｍＬＬＢ培养基中，３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ振荡培养１２ｈ后取出作为液体

种子。按３％接种量分别接种到ＬＢ培养基（含

１０μｇ／ｍＬ四环素），分别于６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０ｈ取样，以未接种的相应培养基作对照，用蒸

馏水稀释１倍后测定ＯＤ６００。同时，在各时间点分别按３％接种量接种１０ｍＬ含相应抗生素的ＬＢ培养基，培养４ｈ后加入终浓度为０．１％木糖，继续培养６ｈ后取上清液测定酶活。

１．６接种量（Ｘ２）对产酶的影响按１％、２％、

３％、４％、５％、６％的接种量，分别接种最佳种龄

为Ｘ１的工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ液体种子于１０ｍＬ

ＬＢ培养基（含１０μｇ／ｍＬ四环素），３７℃剧烈振荡

培养４ｈ后加入终浓度为０．１％木糖，诱导６ｈ后测定菌体浓度与上清液酶活。

１．７木糖浓度（Ｘ３）对产酶的影响以最佳接种

量Ｘ２接种最佳种龄为Ｘ１的液体种子于１０ｍＬ

ＬＢ培养基（含１０μｇ／ｍＬ四环素），３７℃剧烈振荡

培养４ｈ后加入终浓度分别为０．１０％、０．１５％、

０．２０％、０．２５％、０．３０％、０．３５％、０．４０％、０．４５％、０．５０％的木糖诱导６ｈ后测定菌体浓度与上清液

酶活。

１．８诱导时间（Ｘ４）对产酶的影响以最佳种龄

Ｘ１接种最佳接种量为Ｘ２的液体种子于１０ｍＬＬＢ培养基（含１０μｇ／ｍＬ四环素），３７℃剧烈振荡培养４ｈ后按最佳木糖诱导浓度加入终浓度为Ｘ３

的木糖，分别于２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ｈ取样，进行菌体浓度和上清液酶活的测定。

１．９瓶装量（Ｘ５）对产酶的影响采用２５０ｍＬ三

角瓶，分别装量为２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０ｍＬ和１００ｍＬＬＢ培养基（含１０μｇ／ｍＬ四环素），以最佳种龄Ｘ１接种最佳接种量为Ｘ２的液体种子于上述三角瓶中，３７℃剧烈振荡培养４ｈ后加入终浓度为Ｘ３的木糖，按最佳诱导时间培养Ｘ４ｈ后取上清液测定酶活。

２结果与分析

２．１种龄（Ｘ１）对产酶的影响从液体种子中按３％接种量分别接种到１０瓶ＬＢ培养基（含１０μｇ／ｍＬ四环素），分别于６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０ｈ取出

一瓶测定ＯＤ６００值，获得工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ的生长曲线，见图１。

以各时间点取样的菌液作为种子，按３％接

种量转接到１０ｍＬ含相应抗生素的ＬＢ培养基，

４ｈ后加入终浓度为０．１％木糖继续培养６ｈ后取

上清液测定酶活，获得菌株ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ的种龄曲线，见图２。

由生长曲线可知：前１２ｈ菌体量呈指数增长，处于对数生长期，菌体的生长状态最好，以后趋于平稳，在１２ｈ菌体浓度达最大值。由种龄曲线可知：当种龄为１２ｈ和１４ｈ时可获得最高酶活，当种龄小于１２ｈ或大于１４ｈ，培养液中酶活都会大幅度下降，所以工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ的种龄

１２ｈ为最佳。２．２

接种量（Ｘ２）对产酶的影响

按１％～６％的

接种量分别接种最佳种龄为１２ｈ的工程菌

ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ液体种子于１０ｍＬＬＢ培养基（含１０

μｇ／ｍＬ四环素）培养，培养４ｈ后加入终浓度为０．１％木糖诱导６ｈ后测定菌体浓度与上清液酶活，结果见图３。

由图３可见：随着接种量的增加，菌体浓度也随之增加，接种量为２％～４％时菌体浓度几乎