棉花脂肪酸脱氨酶FAD2基因真核载体的构建和转基因小鼠的初步建立
利用毒蛋白基因提高棉花转化效率的研究的开题报告
利用毒蛋白基因提高棉花转化效率的研究的开题报告题目：利用毒蛋白基因提高棉花转化效率的研究背景和研究意义：植物转基因技术已经被广泛应用于农业生产领域，但在具体实施中，对于某些作物来说，转化效率仍然较低。
棉花作为全球主要经济作物之一，对其进行基因转化研究有着重要的现实意义。
目前，研究表明，毒蛋白可以抑制细胞线粒体和叶绿体中的蛋白合成，从而产生细胞死亡现象，进而提高转化效率。
因此，本课题旨在探索利用毒蛋白基因提高棉花转化效率的可能性，为棉花转基因的研究提供新的思路和方法。
研究内容：本研究首先将合成的毒蛋白基因转化到棉花中，并将其表达在不同的转化体系中，包括农杆菌介导的遗传转化和基因枪法。
随后，采用PCR、酶联免疫吸附试验等技术对转化后的棉花进行检测和鉴定，并对不同转化体系的转化效率和影响因素进行分析和比较。
最后，选取转化效率较高的体系，对其中的重要基因进行进一步分析和功能验证。
研究方法及进度安排：第一阶段（1个月）：筛选合成毒蛋白基因，将其与转化载体结合构建毒蛋白基因表达载体，同时收集并筛选棉花品种作为实验材料。
第二阶段（2个月）：通过农杆菌介导的遗传转化和基因枪法将毒蛋白基因转化到棉花中，对转化后的棉花进行筛选和检测。
第三阶段（2个月）：对不同转化体系的转化效率和影响因素进行分析和比较。
第四阶段（3个月）：选择转化效果较好的体系进行重要基因的分析和功能验证，并对研究结果进行综合分析和总结。
预期成果：本研究预期可以构建出毒蛋白基因表达载体并将其成功转化到棉花中，经过筛选和检测，选出转化效果较好的体系，进而进一步分析和验证重要基因的功能。
本研究结果可以为棉花的转基因研究提供新的思路和方法，也可以为其他作物的转化研究提供参考和借鉴。
棉花抗坏血酸从头合成途径中VTC2基因的克隆及其功能的初步分析
棉花抗坏血酸从头合成途径中VTC2基因的克隆及其功能的初步分析引言：抗坏血酸（维生素C）在植物生长和发育过程中起着重要的作用。
棉花（Gossypium hirsutum）作为一种重要的经济作物，其维生素C合成过程一直备受关注。
抗坏血酸在棉花中的合成途径一直是科学家们研究的焦点之一。
本研究旨在从棉花中克隆VTC2基因，并对其功能进行初步分析。
通过对VTC2基因的研究，可以揭示棉花维生素C合成途径的分子机制，为进一步提高棉花抗逆性能和产量水平提供理论依据和技术支持。
材料与方法：1. 样品采集：从棉花叶片中采集总RNA，提取纯化后转录成cDNA。
2. 基因克隆：设计引物，进行PCR扩增，将VTC2基因的编码序列扩增出来。
3. 亚细胞定位：将VTC2基因的编码序列克隆至绿色荧光蛋白（GFP）标签载体中，并转化入大肠杆菌，然后将其转化入拟南芥（Arabidopsis thaliana）中。
4. 表达分析：利用荧光定量PCR技术检测VTC2基因在不同组织和发育阶段的表达水平。
结果：1. VTC2基因的克隆：通过PCR扩增和克隆技术，成功获得了VTC2基因的编码序列。
2. 亚细胞定位：经过转化后，观察到拟南芥中绿色荧光蛋白在细胞核和质网中均有分布，说明VTC2基因定位在细胞核和质网。
3. 表达分析：VTC2基因在棉花的不同组织和发育阶段均有表达，且在嫩叶和幼花中表达水平较高。
讨论：本研究成功克隆了棉花中的VTC2基因，并对其功能进行了初步分析。
根据亚细胞定位实验结果，可判断VTC2基因在细胞核和质网中均有分布，可能在维生素C的合成过程中发挥作用。
表达分析结果显示，VTC2基因在棉花的嫩叶和幼花中表达水平较高，这与维生素C在植物的生长和发育过程中起重要作用的现象是一致的。
结论：本研究初步分析了棉花中VTC2基因的功能。
VTC2基因在细胞核和质网中分布，并在棉花的嫩叶和幼花中表达水平较高。
这些结果说明VTC2基因在棉花维生素C的合成途径中可能发挥重要作用。
中间锦鸡儿fad2基因克隆与序列分析
中间锦鸡儿fad2基因克隆与序列分析林萍;汪阳东;齐力旺;李春秀;史胜青;王建华;张守攻【期刊名称】《分子植物育种》【年(卷),期】2008(6)1【摘要】油酸去饱和酶FAD2(fatty acid desaturase2)在油酸中引第二个双键生成亚油酸,是负责植物体内产生多不饱和脂肪酸的第一步关键酶。
本研究采用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术,以中间锦鸡儿未成熟种子为材料,克隆了三个fad2基因(分别命名为fad2-2A、fad2-1A和fad2-1B)。
将这三个基因与汪阳东从中间锦鸡儿枝叶中克隆的fad2-2B(CaFAD2基因,GenBank 登录号AY957394)一起进行了序列比对和分析。
序列同源性比较结果表明,fad2-1A与fad2-1B同源性很高,fad2-1A编码的前283个氨基酸与fad2-1B的同源性高达98.9%,fad2-2B与fad2-1A的氨基酸序列同源性最低,只有64.7%。
这四个基因的成功克隆,为进一步研究基因分工、调控方式打下了基础,为实现对锦鸡儿属植物脂肪酸成分直接、精确调控提供了保证,也是从一个物种中克隆四个fad2基因的第一次报道。
【总页数】7页(P148-154)【关键词】中间锦鸡儿;fad2基因;RACE;序列分析【作者】林萍;汪阳东;齐力旺;李春秀;史胜青;王建华;张守攻【作者单位】中国林业科学研究院林业研究所,北京 100091;中国林业科学研究院亚热带林业研究所,富阳 311400;中国林业科学研究院森林环境与保护研究所,北京100091【正文语种】中文【中图分类】Q949.751.9;Q785【相关文献】1.中间锦鸡儿FAD2基因拷贝数检测及组织表达谱分析 [J], 林萍;汪阳东;齐力旺;张守攻2.中间锦鸡儿fad2基因片段的克隆和反义表达载体的构建及遗传转化初步研究[J], 汪阳东;张守攻;李春秀;齐力旺3.中间锦鸡儿fad2基因片段的克隆和反义表达载体的构建及遗传转化初步研究[J], 汪阳东;张守攻;李春秀;齐力旺4.中间锦鸡儿种子特异性fad2基因克隆及fad2-1A基因酵母表达载体的构建 [J], 林萍;李春秀;齐力旺;张守攻5.中间锦鸡儿fad2基因片段克隆、反义表达载体构建及遗传转化初步研究 [J], 汪阳东;李春秀;齐力旺;张守攻因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
棉花FAD2-1基因的克隆及其ihpRNA和amiRNA干扰载体的构建
油 酸 和 仪 亚 麻 酸 。油酸 又 是 硬 脂 酸 的脱 饱 和 产 ．
物 ， 油 酸 因其 脱 饱 和 反应 受 阻 而 积 累时 ， 向 当 逆 地 抑制 了硬 脂 酸生 成 油酸 的反 应 ， 硬 脂 酸 即饱 使
生物 中普 遍存 在 的长 约 ２ ｔ ２ｎ 的单 链 Ｒ ＮＡ，能够
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棉花FAD2-1基因的5'UTR内含子与启动子的顺式作用元件的鉴定及其转录调控作用的研究
棉花FAD2-1基因的5'UTR内含子与启动子的顺式作用元件的鉴定及其转录调控作用的研究棉花FAD2-1基因的5'UTR内含子与启动子的顺式作用元件的鉴定及其转录调控作用的研究摘要：内含子作为转录后调控的重要元素，在基因调控中起着关键作用。
本研究利用棉花FAD2-1基因为研究对象，旨在鉴定其5'UTR内含子及启动子中的顺式作用元件，并探讨其转录调控作用。
首先，通过测序和生物信息学分析，鉴定了FAD2-1基因的5'UTR内含子并预测其二级结构。
接着，利用荧光定量PCR技术和转录瞬时表达实验验证了FAD2-1基因5'UTR内含子与启动子的相互作用，并进一步研究了这两者在转录调控中的功能。
关键词：棉花；FAD2-1基因；5'UTR内含子；启动子；顺式作用元件引言：棉花是世界上重要的经济作物之一，在纺织业中具有重要的应用前景。
棉花油脂中多不饱和脂肪酸的含量对纺织品的质量具有重要影响，而FAD2-1基因的表达水平与棉花油脂脂肪酸含量密切相关。
因此，研究FAD2-1基因的调控机制对棉花油脂脂肪酸含量的调节具有重要意义。
材料与方法：1. 棉花品种：选取高油棉花品种为实验材料。
2. RNA提取与cDNA合成：采用RNA提取试剂盒提取棉花幼苗的总RNA，并反转录为cDNA。
3. 鉴定FAD2-1基因的5'UTR内含子：利用RT-PCR扩增FAD2-1基因的5'UTR内含子，通过测序和生物信息学工具预测其二级结构。
4. 荧光定量PCR：利用荧光定量PCR技术检测FAD2-1基因5'UTR内含子和启动子的相互作用情况。
5. 转录瞬时表达实验：构建FAD2-1基因激活子载体和报告基因载体，并转化到棉花组织中，通过荧光定量PCR技术检测基因表达水平。
结果与讨论：1. FAD2-1基因的5'UTR内含子的鉴定与预测：利用RT-PCR成功扩增了FAD2-1基因的5'UTR内含子，并通过测序和二级结构预测工具发现该内含子具有一定的二级结构。
生物技术实验设计方案-- 棉花MYB转录因子的克隆与载体构建
西北农林科技大学生物技术实验设计方案题目：棉花MYB转录因子的克隆与载体构建院（系）：专业：班级：姓名：学号：成绩：完成日期：棉花MYB转录因子的克隆与载体构建1、棉花MYB转录因子的克隆与载体构建的研究背景和目的、意义1.1 棉花MYB转录因子的克隆与载体构建的研究背景MYB类转录因子家族是指含有MYB结构域的一类转录因子。
MYB结构域是一段约51-52个氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列。
分子结构是每隔约18个氨基酸规则间隔的色氨酸残基，它们参与空间结构中疏水核心的形成。
有时色氨酸残基会被某个芳香族氨基酸或疏水氡基酸所取代，尤其是在植物R2R3-MYB转录因子中，R3MYB 结构域的第一色氨酸经常被亮氨酸、异亮氮酸或苯丙氨酸所取代。
其次，在每个保守的色氨酸前后都存在一些高度保守的氨基酸，例如在第一个色氨酸的C-末端通常是一簇酸性氨基酸正是上述这些保守的氨基酸残基使MYB结构域折叠成螺旋-螺旋-转角-螺旋结构。
特点及功能是参与植物苯丙烷类次生代谢途径的调节，苯丙烷类代谢是植物主要的3条次生代谢途径之一，它起始于苯丙氨酸，经过几个共同步骤后，分成两个主要分支途径，其中一条分支称为黄酮类代谢途径，主要与植物色素合成相关。
R2R3-MYB转录因子作为调节蛋白广泛参与苯丙烷类代谢途径的调控，主要的证据来自对欧芹、玉米、金鱼草和矮牵牛中黄酮类分支途径的生化和遗传学研究。
MYB基因是最大的植物转录因子基因家族之一，参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应答，并对细胞分化、细胞周期、器官的形成以及植物叶片的形态建成具有重要的调节作用；对MYB转录因子基因LHY和CCA1的研究结果显示，它们可能通过对光信号的应答参与植物生理节律的调控。
前人研究进展MYB转录因子具有高度保守的DNA结合域——MYB结构域。
在每个MYB区域中，一般都含有3个保守的色氨酸残基，其间隔为18～19个氨基酸，是疏水核心的重要成分，对于维持螺旋-转角-螺旋（HTH）的构型起着非常重要的作用。
棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（2）： 231-239http：///ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9E-mail： xbzw@本研究由国家自然科学基金项目（31171590）资助。
*通讯作者（Corresponding author）： 郭旺珍， E-mail： moelab@Received（收稿日期）： 2013-06-17； Accepted（接受日期）： 2013-09-24； Published online（网络出版日期）： 2013-12-05. URL： http：///kcms/detail/11.1809.S.20131205.1101.003.htmlDOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.00231棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立李妮娜 丁林云 张志远 郭旺珍*南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 / 教育部杂交棉创制工程研究中心， 江苏南京210095摘 要： 以棉花幼嫩子叶为材料， 分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素， 以棉花叶肉原生质体为受体， 建立了稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。
技术体系包括， 选择自然生长12 d 的棉花幼嫩子叶为材料， 混合1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol L -1甘露醇、20 mmol L -1 KCl 、20 mmol L -1 MES 、0.1 mol L -1 CaCl 2和1.0 g L -1 BSA， 在28℃黑暗条件下振荡酶解8 h， 可游离出浓度达1.0×106 mL -1以上的纯净棉花叶肉原生质体。
利用该方法将棉花锌指蛋白基因GhZFP2整合到pJIT166-GFP 质粒载体， 构建了GhZFP2：GFP 融合载体， 采用40% PEG-4000介导转化， 获得高转化率的棉花叶肉原生质体。
棉花4个脂肪酸合成相关基因的克隆和表达特征分析
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(12): 2084−2090/zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由国家重大基础研究计划项目(973计划) (2007CB108805)和教育部高等学校学科创新引智计划项目(111计划)(B08025)资助。
*通讯作者(Corresponding author): 郭旺珍, E-mail: moelab@Received(收稿日期): 2010-05-24; Accepted(接受日期): 2010-08-02.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.02084棉花4个脂肪酸合成相关基因的克隆和表达特征分析董 佳 魏利斌 胡 艳 张天真 郭旺珍*南京农业大学 / 作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095摘 要: 脂肪酸合成相关代谢在控制油的合成和抗非生物胁迫中均起着重要作用, 其脂肪酸合成相关基因的时空表达水平直接影响油的含量和脂肪酸合成相关酶的活性。
本研究克隆了4个脂肪酸合成相关基因, 分别命名为GhKASII 、GhKASIII 、GhFAD 和GhGPAT , 其中GhKASIII 、GhFAD 和GhGPAT 基因cDNA 全长通过电子克隆和同源克隆得到。
而GhKASII 通过筛库和5′RACE 途径得到。
组织表达分析表明, 上述4个基因在根、茎、叶及纤维发育不同时期均有表达, 属于组成性表达基因。
其中GhKASII 、GhKASIII 在25 DPA 种子中表达量最高, GhGPAT 在0 DPA 胚珠和15 DPA 纤维中表达量很高, GhFAD 在0 DPA 胚珠, 15 DPA 种子, 20 DPA 纤维中表达量均很高。
不同非生物胁迫的诱导表达分析表明, 上述4个基因均不同程度被茉莉酸甲酯, ABA, 创伤和冷害等逆境诱导表达。
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农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2005,13(2):207~211*基金项目：国家自然科学基金(No.30270647)和北京市自然科学基金项目(No.5012007)资助。
王宇：男，1975年生，硕士研究生。
**通讯作者。
Author for correspondence.Email:<goukm@>.收稿日期：2004-04-09接受日期：2004-05-09·研究论文·棉花脂肪酸脱氢酶-2(FAD2)转基因小鼠模型的建立*王宇1安晓荣1柳青2苟克勉1**(1.中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室,北京100094；)摘要：以pEGFP-N1质粒为基础载体，切除基因的编码序列后，在多克隆位点依次插入动物肌肉启动子和棉花ω-6脂肪酸脱氢酶编码基因(fatty acid desaturase-2)的cDNA序列，构建成cDNA真核表达载体。
用显微注射方法，将线性化的载体DNA注入KM×B6D2F1小鼠受精卵的的原核内部，然后将胚胎移植到输卵管内，13只受体怀孕产仔。
合计移植了286枚受精卵，最后获得34只健康的成年小鼠，PCR方法检测确认5只为阳性小鼠，Southern blot证明只有1只阳性转基因小鼠。
关键词：棉花；脂肪酸脱氢酶-2；基因脂肪酸脱氨酶-2；转基因；小鼠Establishment of Transgenic Mice Integrated with GeneEncoding Cotton Omega-6Fatty Acid Desaturase-2WANG Yu1AN Xiao-Rong1LIU Qing2GOU Ke-Mian1** ()The aim of this study is to produce the transgenic mouse integrated with gene encoding cotton() omega-6fatty acid desaturase-2(FAD2).We firstly constructed an expression vector bearing the cDNA derived by pro-moter of bovine skeletal muscle gene.Then the linear vector was microinjected into the pronucleus of the KM×B6D2F1zygotes to produce the transgenic mice.Thirty-four adult mice were produced from286of injected embryos.Five of them were transgenic by ge-nomic DNA polymerase chain reaction(PCR).Southern blotting results revealed that only one mouse was integrated withgene.;fatty acid desaturase-2;gene;transgenic;mice脂肪酸脱氢酶-2(fatty acid desaturase-2,FAD2)是植物细胞内质网表面的一种去饱和酶，主要作用是将细胞质中的单不饱和脂肪酸的第12位碳碳单键脱氢成双键，生成含有2个双键的多态不饱和Ω-6脂肪酸(Liu.,2001;Okuley.,1994)。
人和其它哺乳动物细胞都没有这个酶的编码基因，不能合成Ω-6脂肪酸。
因此，动物和人类只能从植物(植物油、蔬菜、水果等)和鱼类(源于海藻)食物中摄取(Kang,2003;Spychalla.,1997)。
Ω-6脂肪酸是人体的必需脂肪酸，它不仅是细胞膜的组成成分，而且与人的心血管、大脑和神经系统的正常发育和生理功能密切相关(Decsi.,1998;Hoffman., 1993;Pawlosky.,2003)。
在成功克隆到棉花cDNA基因编码序列(未发表资料)的基础上，本研究以小鼠为模式动物，通过转基因技术，尝试将植物合成Ω脂肪酸的多级代谢通路导入到动物体内，人为地在动物体内增加多态不饱和脂肪酸的合成途径，有利于进一步探讨由此导致的动物自身脂肪酸成分发生质量和比例的变化后，动物体的正常发育和生理能力会产生什么样的变化。
以及探讨一种畜产品改良的途径。
本研究首先构建了肌肉特异表达基因的真核载体，然后通过显微注射技术获得农业生物技术学报2005年了1只整合基因的小鼠，为下一步的研究工作奠定了基础。
1材料和方法1.1主要材料DNA聚合酶和限制性内切酶购自大连宝生物公司(中国)。
T4连接酶及Klenow购自Promega 公司。
引物合成和DNA序列测定由上海博亚公司完成(中国)。
cDNA由本课题组克隆(未发表资料)。
含有启动子的pSKA质粒为本课题组保存。
实验用DBA/2、C57BL/6和昆明(KM)小鼠,购自中国医学科学院实验动物中心,C57BL/6母鼠与DBA/2公鼠繁殖的F1代简记为B6D2F1(黑色),用于本实验。
小鼠的饲养管理见文献(Yan., 2004)。
胚胎培养溶液为CZB+5.56mmol/L D-glu-cose+4mg/mL BSA；操作液为20mmol/L HEP-ES-buffered CZB+5mmol/L NaHCO3,参照文献(Nagy.,2003)所述方法配制。
除特殊说明外,所有胚胎用试剂均购自Sigma公司，分子生物学试剂全部为国产。
1.2真核表达载体的构建以pEGFP-N1质粒(Clontech)为骨架载体，在多克隆位点依次插入启动子和cDNA，切掉基因的编码区，利用基因编码区下游的SV40poly A构建了一个顺序含有启动子、cDNA和SV40poly A的真核表达载体(图1)。
具体方法是：首先对带有启动子的pSKA质粒进行Ⅰ＋dⅢ酶切，带有cDNA的pBlue-fad2质粒进行RⅠ酶切，分别回收0.9kb 的启动子片段和1.37kb的cDNA片段。
对pEGFP-N1质粒进行Ⅰ＋dⅢ酶切，然后回收4.65kb线性化载体，并用T4DNA连接酶对载体片段和启动子进行连接重组，酶切鉴定后将正确重组质粒命名为pEGSKA。
对pEGSKA 进行Ⅰ＋Ⅰ酶切,去掉基因800bp编码区，回收4.75kb片段，Klenow补平切口，T4DNA连接酶进行自连重组，酶切鉴定获得正确的重组质粒pESKA。
对pESKA进行RⅠ酶切，回收载体片段并用cip去磷酸化，用T4DNA连接酶将该载体片段和cDNA进行连接重组，酶切鉴定，重组质粒命名为pFAD2。
最后将此质粒测序，用BLAST软件进行序列比较。
1.3转基因小鼠的制备Ⅰ＋Ⅰ双酶切pFAD2质粒后，用E.N.Z.A.Gel Extraction Kit(Omega Bio-tek Co.,Ltd，USA)回收2.4kb目标片段，溶于TE，用PCR产物纯化柱纯化(Millipore Co.,Ltd)。
用紫外分光光度计确定DNA浓度，TE(pH7.4)溶液稀释至5μg/mL，用于显微注射。
图1.重组pFAD2质粒图谱Fig.1.Construct of pFAD2recombinant plasmid6～8周龄B6D2F1母鼠，腹腔注射7.5IU的PMSG(天津市华孚高新生物技术公司)，48h后，腹腔再注射7.5IU HCG(宁波生物制品厂)，并与成年KM公鼠合笼。
20h后，检查精栓，断颈法处死母鼠，从输卵管膨大部冲取受精卵，移入含300IU/mL透明质酸酶(Sigma)的HEPES-CZB培养液中，37℃温育1~2min，消化除去卵丘细胞；受精卵用CZB洗涤3次后，用CZB溶液在37℃条件的CO2箱培养(Nagy.,2003)。
参照Nagy等(2003)所述标准步骤，将DNA注射到受精卵原核内和输卵管移植胚胎，19~20d后，小鼠出生。
1.4转基因小鼠的分子鉴定鼠尾基因组的提取及酶切均按Sambrook和Russell(2001)所述的方法进行。
3~4周龄幼鼠的1.5 cm尾尖组织，剪碎后用0.1mg/mL蛋白酶K (Invitrogen)的SNET盐溶液55℃消化过夜。
酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提30min后，12000r/min，离心5min，吸取上层水相；加入等体积异丙醇，混匀后用枪头吸出缠绕在一起的DNA，转移到无菌的Eppendorf管中，加入70％乙醇洗涤1次，真空抽干后将DNA溶于TE(pH8.0)溶液中，4℃储存备用。
合成PCR检测引物:引物1:5'-TTT CAC TTT CTC CCA CAA CC-3';引物2:5'-CCA ATC CCA TTC AGA CGA-3'。
在野生型小鼠的尾尖基因组DNA中分别混入208第2期王宇等:棉花脂肪酸脱氢酶-2(FAD2)转基因小鼠模型的建立1×、10×和100×拷贝浓度梯度的pFAD2质粒DNA，进行PCR扩增(94℃，1min；47℃，1min；72℃，1min。
35~40个循环)，确定PCR的灵敏度；用质粒作阳性对照，以野生型小鼠尾尖基因组DNA作阴性对照，以0.5~1.0μg小鼠尾尖DNA作为模板用上述条件进行PCR扩增。
参照Sambrook和Russell(2001)所述的方法进行Southern blot，单独吸取10μg实验小鼠、野生型小鼠(阴性对照)和混合有1.37kb cDNA片段的野生型小鼠(阳性对照)的基因组DNA，分别用RⅠ酶切，然后用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳。
将凝胶DNA碱转移至带有正电荷的Hybond N+尼龙膜(Amersham)上。
用32P-dCTP标记探针时，参照Rediprime TMⅡ随机引物标记试剂盒(Amersham)说明书进行，以648bp的PCR回收产物作为探针模板。
进行Southern blot时，首先使用不含探针的磷酸-SDS杂交液在65℃预杂交5h以上，然后更换杂交液，加入标记好的预变性探针，继续杂交12~16h。
磷酸-SDS洗液Ⅰ和Ⅱ洗涤后，将膜与X光片一起在－70℃放射自显影16~24h；最后进行X光片的显影和定影，冲洗晾干后保存。
2结果和分析2.1真核表达载体的鉴定首先将0.9kb启动子片段(图2,lane3)插入到pEGFP-N1质粒的多克隆位点之间构建成功中间质粒pEGSKA(图3,lane4)；然后酶切去掉基因编码区，自连接获得重组中间质粒pESKA(图4,lane3~4)后；将1.37kb cDNA片段(图2, lane2)插入pESKA质粒的RⅠ位点(图5，lane 2），获得目标质粒pFAD2(图5,lane3)。