L_谷氨酰胺高产菌的选育和发酵条件
谷氨酸发酵的工艺流程
谷氨酸发酵的工艺流程
《谷氨酸发酵的工艺流程》
谷氨酸是一种重要的氨基酸，广泛应用于食品、医药和化工等领域。
发酵工艺是生产谷氨酸的主要方法之一，下面将介绍谷氨酸发酵的工艺流程。
1. 选择菌株：选择适合发酵生产的菌株是谷氨酸发酵工艺的第一步。
通常采用属于放线菌属或棒状杆菌属的菌株进行发酵。
这些菌株具有较高的谷氨酸产量和较好的耐受性。
2. 发酵培养基的配制：发酵培养基是支撑谷氨酸发酵的重要基础。
一般包括碳源、氮源、无机盐、生长因子等组成成分。
常用的碳源包括葡萄糖、麦芽糖等，氮源包括氨基酸、尿素等。
3. 发酵条件控制：发酵过程中的温度、pH值、氧气供应等条件都会影响谷氨酸的产量。
通常采用恒温发酵，温度一般控制在28-32摄氏度。
同时控制好培养基的pH值，通常在6.5-7.5之间。
氧气供应也是非常重要的，通过控制搅拌速度和通气量来保证充足的氧气供应。
4. 发酵过程监测：在发酵过程中需要对微生物生长、培养基中各种成分的消耗和产物的生成进行持续监测。
通过检测微生物生长曲线和培养基中各成分的浓度变化来掌握发酵情况，及时调整发酵条件以提高产量。
5. 发酵产物的提取与精制：发酵结束后，需要对发酵产物进行
提取和精制。
通常采用离心、过滤等方法将微生物分离，然后通过酸碱调节、浓缩、结晶等工艺步骤来得到纯净的谷氨酸产物。
通过以上工艺流程，谷氨酸发酵生产可以实现高效、稳定的产量，并且能够得到高纯度的产物，满足市场需求。
L-谷氨酰胺高产菌株选育及发酵过程优化的开题报告
L-谷氨酰胺高产菌株选育及发酵过程优化的开题报告
一、选题背景
谷氨酰胺（L-Glutamine，L-Gln）是一种广泛应用于医药、保健品、食品和饲料等领域的重要氨基酸，在生物体内具有多种功能，如维持肠
道黏膜屏障、免疫调节、脑神经传递等。
由于其生理功能的多样性和重
要性，谷氨酰胺市场需求量逐年增加，成为一种具有广阔市场前景的生
物活性物质。
谷氨酰胺的生产主要依靠微生物发酵工艺，然而，传统发酵方法生
产谷氨酰胺效率较低，产量有限。
因此，选育高产菌株和优化发酵过程
是解决该问题的有效途径。
二、研究目的和内容
本研究旨在选育高产谷氨酰胺的菌株，并通过发酵过程的优化，提
高谷氨酰胺的生产效率。
具体内容包括：
1. 从具有谷氨酰胺生产潜力的微生物中筛选出高产谷氨酰胺的菌株，并进行鉴定和优化。
2. 采用响应面分析等方法优化谷氨酰胺发酵过程的参数，包括菌种
培养条件、发酵基质成分和发酵条件等。
3. 根据最佳发酵条件进行大规模发酵试验，考察谷氨酰胺的产量和
品质等指标，并与传统发酵工艺进行比较分析。
三、研究意义
本研究的成果可以为谷氨酰胺的生产提供新的思路和方法，解决传
统发酵工艺产量低、生产效率低等问题，提高谷氨酰胺的产量和质量，
为生物活性物质的生产和应用提供强有力的支持。
此外，研究过程中所涉及到的微生物分离、鉴定和优化方法，对于探索和利用其他有潜力的微生物，并提高其代谢产物的产量和质量也具有一定的参考意义。
L-色氨酸高产菌的选育及其发酵条件的优化的开题报告
L-色氨酸高产菌的选育及其发酵条件的优化的开题报告一、选题背景及意义色氨酸是一种重要的氨基酸，在医学、食品工业、化学工业等领域中有着广泛的应用。
目前，大多数色氨酸的生产是通过化学合成实现的，由于其分子结构的复杂性，合成成本较高，而且合成的产物容易受到污染和环境污染问题。
因此，寻求一种高效、环保的生物合成方法，就显得尤为重要。
色氨酸合成的最终目的是要获得高纯度的L-色氨酸，因此需要使用高产菌株。
此外，发酵条件的优化也对提高色氨酸产量至关重要。
因此，本文旨在选育L-色氨酸高产菌株，并通过优化发酵条件，提高L-色氨酸的产量，为生产高纯度的L-色氨酸提供一种可行的方法。
二、选题内容及方法1. 选育L-色氨酸高产菌株通过筛选不同的菌株，选育出一种L-色氨酸高产的菌株。
初始阶段将使用不同的培养基，包括Luria-Bertani（LB）培养基、M9培养基、中等选择性培养基等，并使用不同浓度和比率的糖类和氮源来寻求最适合L-色氨酸合成的培养条件和培养细节，从而达到高产菌株的选育目的。
2. 产酸菌对色氨酸产酸的影响在L-色氨酸生产过程中，一些产酸菌可能会对色氨酸的合成产生负面影响。
因此，将研究产酸菌对L-色氨酸合成的影响，也会探索针对这些产酸菌的处理策略。
3. 优化发酵条件通过改变发酵条件，例如气体供应、温度和pH，进一步提高L-色氨酸的产量。
将对不同的发酵条件进行研究，以了解每个变量对产量的影响，并将最优条件应用于大规模的产酸过程。
4. 产品分离和提纯通过膜分离、离子交换、逆渗透等技术，对发酵液进行处理并获得高纯度的L-色氨酸。
三、预期成果及意义通过本研究，有望选育出L-色氨酸高产菌株并优化发酵条件，从而实现高效低成本的生物制造L-色氨酸过程。
同时，研究发现的产酸菌和其他负面影响，可以指导未来合成L-色氨酸的研究和生产。
最终，高纯度的L-色氨酸将应用于医药、食品工业、化学工业等领域，推动相关领域的发展。
高产谷胱甘肽酵母菌选育及发酵条件的研究的开题报告
高产谷胱甘肽酵母菌选育及发酵条件的研究的开题
报告
一、选题背景
谷胱甘肽是一种重要的生物活性多肽，在人体免疫、氧化还原等多种生理过程中发挥着关键作用。
谷胱甘肽合成的关键酶是谷胱甘肽合成酶（GSH-S）和谷氨酰基转移酶（GS-T）。
目前，谷胱甘肽的生产主要依靠微生物发酵方式，而酵母菌是谷胱甘肽生产的最重要菌种之一。
高产谷胱甘肽酵母菌的选育和优化其发酵条件对谷胱甘肽生产和应用具有重要意义。
二、研究目的
本研究旨在筛选出产谷胱甘肽能力更强的酵母菌株，同时优化其发酵条件，实现大规模生产高纯度谷胱甘肽的目的。
三、研究内容
1.筛选谷胱甘肽高产酵母菌株
通过微生物菌种筛选、突变体筛选、遗传工程等手段，筛选出能够生产大量谷胱甘肽的高产酵母菌株。
2.优化谷胱甘肽酵母菌的培养条件
通过单因素和响应面实验的方法，研究影响酵母菌高产谷胱甘肽的主要因素，并优化其培养条件，使其生产效率和产量最大化。
3.谷胱甘肽生产工艺的研究
结合筛选出的高产酵母菌株和优化后的培养条件，研究谷胱甘肽的生产工艺，并探究相关的工艺参数对生产效率的影响。
四、研究方法
本研究采用细胞生物学、微生物学、分子生物学等方法，结合单因素和响应面实验的方法，系统研究谷胱甘肽高产酵母菌株的筛选和培养条件的优化。
五、结论意义
本研究将通过筛选和优化，获得高产谷胱甘肽的酵母菌株，实现对谷胱甘肽生产的快速高效，并优化其工艺，提高其纯度。
这将为谷胱甘肽在医药、护肤品等领域的应用提供高质量的原料保障。
谷氨酸生产菌的选育
生化121
•
22号
谷氨酸生产菌的选育方法，主要是
采用常规的诱变育种及遗传工程技 术构建工程菌株。
诱变育种
利用各种诱变剂处理微生物细胞， 提高基因的随即突变频率，扩大变 异幅度，通过一定的筛选方法，获 取所需要优良菌株的过程，称为诱 变育种。
诱变育种包括诱变和筛选两个部分：首 先，以合适的诱变剂处理大量而均匀分
（5）摇瓶筛选 将突变株接入摇瓶发酵培养集中，进 行摇瓶发酵，比较菌株的谷氨酸产量，选出谷氨酸高 产菌株。
(6)原生质体制备 将DES突变株的斜面菌接入一级种子 培养集中，32摄氏度振荡培养5h，加入青霉素G，使青 霉素G的浓度为0.6U/ml，继续培养3h，离心弃去上清 液，用高渗稳定液洗涤2次，将菌体与高渗稳定液混合， 于装有玻璃珠的无菌三角瓶充分振荡，制成菌体的高渗 悬液，调节菌体浓度为（1-3）× 个/ml。然后，加入 溶菌酶，使其浓度为200-800U/ml，恒温32摄氏度振荡 处理，镜检观察原生质体的形成情况，当95%以上的细 胞变为原生质体时，离心弃去上清液，用高渗稳定液洗 涤2次，最后制成原生质体的高渗悬液。取1ml原生质体 悬液，用无菌水稀释后涂布于完全培养基上恒温28摄氏 度培养72h，以霉检前的菌悬液为对照，根据在平板上 形成的菌落数计算原生质体形成率，计算公式如下：原 生质体形成率=
体再生→香豆素和氯化锂平板筛选
→谷氨酸为唯一碳源平板筛选→摇 瓶筛选→UV突变株→稳定性试验 →生产条件试验
谷氨酸菌诱变选育操作步骤
（1）菌悬液的制备 将出发菌株AS1.299斜面菌接入一 级种子培养集中，32摄氏度振荡培养8h，离心去清夜， 加入7.0缓冲液稀释菌体泥制菌悬液。
（2）硫酸二乙酯诱变 在菌悬液中加入硫酸二乙酯， 使硫酸二乙酯浓度为1%（体积分数），在电磁搅拌下 处理20—30分钟，处理后加入硫代硫酸钠终止反应。
谷氨酸发酵的工艺流程
谷氨酸发酵的工艺流程谷氨酸是一种重要的生物体中的氨基酸，广泛应用于食品添加剂、保健品和生化制药等领域。
谷氨酸的工业生产主要采用微生物发酵的方法，下面将介绍一种常见的谷氨酸发酵工艺流程。
1. 菌种培养：选用高产谷氨酸的菌株，如乳杆菌属、大肠杆菌等。
先将菌株接种到培养基中培养，再将培养好的菌液接种到发酵罐中进行扩大培养。
菌种培养的条件包括适宜的温度、pH值、培养基组成等。
2. 发酵罐的准备：通常采用不锈钢发酵罐，选择适宜的体积和搅拌速度。
发酵罐内要保持无菌状态，并可以自动控制温度、pH值、溶氧量等参数。
3. 发酵工艺参数设定：设定适宜的温度和pH值，一般发酵温度为30-37摄氏度，pH值为6-7。
通过自动控制系统实时监测和调控这些参数，保证发酵过程的正常进行。
4. 发酵过程：首先将适量的底物加入发酵罐中，底物包括主碳源、氮源、矿物元素等。
然后将菌种接种进入发酵罐，并继续搅拌保持良好的氧气传递。
发酵过程中，微生物利用底物产生代谢产物，包括谷氨酸。
5. 收获和提取：发酵过程一般持续3-5天，当菌体处于最佳生长阶段时，收获发酵液。
发酵液需要经过后处理，包括澄清、浓缩、精制等步骤。
澄清可以通过离心或滤过等方式进行。
浓缩可以利用蒸发、真空浓缩等方法进行。
精制包括溶剂提取、结晶、脱色等步骤，以提高谷氨酸的纯度。
6. 产品包装和贮存：将精制后的谷氨酸产品进行包装，通常采用铝箔袋或塑料瓶。
包装完成后，产品需要进行质量检验，并储存于低温、干燥、密封的环境中，以延长产品的保质期。
以上就是谷氨酸发酵的工艺流程。
随着生物技术的不断发展，谷氨酸发酵工艺也在不断改进，以提高谷氨酸的产量和纯度。
同时，工艺的经济性、环保性也是发酵工艺改进的重要方面，以实现可持续发展。
L-谷氨酰胺高产菌的选育和发酵条件
Ａｂｓｒ ｃ Ｔｈ ｒｇｎ ｌｓｒ ｉ ｔ ａ ｔ： ｅ ｏ ｉ ａ ｔａｎ ＬＧ一 ｓ ｍｕ ａ ｅ ｙ ｕ ｔａ ｉ ｌｔｒ ｄａ ｉｎ ａ ｄ ｄ ｅｈ ｌｓ ｌａｅ，ａ ｃ ｅ ｎ ｄ ｉ ３ ｗａ ｔ ｔｄ ｂ ｌｒｖ ｏ ｅ ａ ｉｔｏ ｎ ｉｔ ｙ ｕ ｆ ｔ ｎｄ ｓ ｒ ｅ ｅ
件 进 行 优 化 ， ７ 瓶 发 酵产 量 可 达 ４ ４ Ｌ ７Ｌ发 酵罐 补 料 分 批 发 酵 ４ 经 ２ｈ摇 ７～ ８ ， ０ｈ可 达 ５ Ｌ ５ 。
关 键 词 ： 种 ； 酵 ； 一 氨 酰 胺 ； 变 育 发 Ｌ 谷 诱
中 图分 类 号 ：８ ５ Ｑ １
文献标志码 ： Ａ
品， 有着 巨大 的市场 。 目前 ， 全球 的 Ｌ—Ｇｎ年 产 量 已达１ ０ 右 ， ｌ ００ ０ｔ 左
到 ２ ／ 。汪 世华 等 以谷 氨酸 棒杆 菌 ￥ １４为 出 ５ｇ Ｌ ９ １ 发菌 株 ， 经 线 和硫酸 二 乙酯 （ Ｅ ） 变 处理 ， 向 Ｄ Ｓ诱 定 选 育 出 １株 生 产 菌 Ｓ ４ Ｌ—Ｇ ｎ产 量 可 积 累 达 Ｈ ４， ｌ ４ ． ／ 。李 爽等 。 黄 色 短 杆 菌 Ｓ Ｄ Ｎ 抗 １４ ｇ Ｌ 。以 Ｇ和 Ｏ 性 菌株 作 为 生 产 菌 株 ， ６ Ｌ罐 中发 酵 ４ １ ４ ｈ后 可 产
Ｃ ＨＡＩ ｉ ｋ ｉ ＨＡＮＧ Ｗ ｅｇ ｏ ｎ ａ ，Ｚ Ｊ ｉｕ
（ ｅ ａ ｏａ ｒ ｏ Ｉ ｄ ｓ ｉ ｉ ｅｈ ｏ ｇ ｆ ｈ ｎｓ ｆ ｄ ｃ ｔ ｎ Ｊ ｎ ｎ ｎ Ｕ ｉ ｒｉ ， ｘ ２ ４ ２ ，Ｃ ｉａ Ｋ ｙ Ｌ ｂ ｒｔ ｙ ｆ ｎ ｕ ｔ ａ Ｂ ｏ ｃ ｎ ｌ ｙ ｏ ｔｅＭｉｉ ｒ ｏ ｕ ａ ｏ ， ｉ ｇ ａ ｎ ｅｓ ｙ Ｗｕ ｉ １ １ ２ ｈｎ ） ｏ ｒｌ ｔ ｏ ｔ ｙ Ｅ ｉ ａ ｖ ｔ
谷氨酸的菌株选育及发酵生产
谷氨酸的菌种选育及发酵生产谷氨酸是构成蛋白质的20种常见α氨基酸之一，是一种酸性氨基酸。
它是谷氨酰胺、脯氨酸以及精氨酸的前体物质。
L-谷氨酸是蛋白质合成中的编码氨基酸，哺乳动物非必需氨基酸，在体内可以由葡萄糖转变而来。
D-谷氨酸则参与多种细菌细胞壁和某些细菌杆菌肽的组成。
谷氨酸的生物合成途径大致是这样的：葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成磷酸烯醇式丙酮酸，其进一步转换为丙酮酸，丙酮酸经氧化生成乙酰辅酶A(乙酰CoA)，然后进入三羧酸循环（同时，丙酮酸也固定二氧化碳产生草酰乙酸进入三羧酸循环），生成三羧酸循环中间产物α-酮戊二酸。
α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。
当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。
因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。
菌种的选育：在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地排到细胞外面，就会大量生成谷氨酸。
研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。
因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，如生物素缺陷型菌种的选育。
生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。
生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。
而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分之一。
因此，磷脂的合成量也相应减少，这就会导致细胞膜结构不完整，提高细胞膜对谷氨酸的通透性。
由于谷氨酸的分泌受细胞膜控制，而影响细胞膜的谷氨酸通透性主要是细胞膜的磷脂含量。
因此，提高细胞膜谷氨酸通透性，必须从控制磷脂含量着手或者使细胞膜受损伤。
磷脂由不饱和脂肪酸、甘油、磷酸和侧链组成，因此，可通过选育这几种物质的缺陷型。
1．选育耐高渗透压菌株耐高糖（20-30%）、耐高谷氨酸（15-20%）、耐高糖、高谷氨酸（20%+15%）2．选育不分解利用谷氨酸菌株以谷氨酸为唯一碳源菌体不能生长或生长微弱3.选育细胞膜渗透性好的菌株（1）生物素缺陷型生物素是脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的辅酶，该酶催化乙酰CoA合成丙二酰CoA。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第9卷第1期2011年1月生 物 加 工 过 程Ch i nese Journa l o f B ioprocess Eng i neer i ng V o.l 9N o .1Jan .2011do:i 10.3969/.j issn .1672-3678.2011.01.007收稿日期:2010-08-23基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2006AA0203014-10)作者简介:柴进凯(1984)),男,四川宜宾人,硕士研究生,研究方向:工业微生物;张伟国(联系人),教授,E-m ai:l zhang w g168@126.co mL -谷氨酰胺高产菌的选育和发酵条件柴进凯,张伟国(江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡214122)摘 要:以嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriu m acetoaci dophilu m )LG-3为出发菌株,经紫外线(UV )和硫酸二乙酯(DES)诱变处理,磺胺胍(SG )、高浓度(NH 4)2S O 4定向筛选,获得1株谷氨酰胺高产菌株LG-65,在未经优化的条件下摇瓶发酵72h 可产谷氨酰胺4315g /L,比出发菌株的产量3214g /L 提高了3413%。
在此基础上,对其发酵条件进行优化,经72h 摇瓶发酵产量可达47~48g /L,7L 发酵罐补料分批发酵40h 可达55g /L 。
关键词:育种;发酵;L -谷氨酰胺;诱变中图分类号:Q 815 文献标志码:A 文章编号:1672-3678(2011)01-0029-06B reedi ng of L -gl uta m i ne hi gh produci ngstrai n and its fer m entation conditi onsCHA I Jinka,i Z HANG W e iguo(K ey L aboratory of Industrial B iotechno logy of t he M i n i stry of Educati on ,Jiangnan U n i ve rs i ty ,W ux i 214122,Ch i na)Abst ract :The orig i n al stra i n LG -3w as m utated by ultrav i o let rad iation and d iet h yl su lfate ,and screened i n culture dish hav i n g high concentrati o n of sulfaguan i d i n e or (NH 4)2SO 4.A stra i n LG-65w as obta i n ed for producing 4315g /L of L -gluta m ine .The fer m entati o n cond itions w ere f u rther opti m ized ,the y ie l d reached 47-48g /L i n shaker flask f o r 72h and reached 55g /L cultivated in 7L fer m en tor for 40h.K ey w ords :breeding ;fer m entati o n ;L-g l u ta m i n e ;m utati o n L -谷氨酰胺(L -g l u ta m ine ,简称L -G ln)是L -谷氨酸C -羧基酰胺化的必需氨基酸。
临床上主要用于治疗胃肠溃疡[1]、缓解运动疲劳[2]、调节免疫力[3]、增强脑神经机能[4]以及辅助治疗癌症等,还可以改善脑出血后的记忆障碍,促进智力低下儿童的智力发育,防治癫痫病发作,是一种极有发展前途的新药[5-6]。
因此,L -G l n 作为医疗或食品保健品,有着巨大的市场。
目前,全球的L -G l n 年产量已达10000t 左右,且呈增长趋势,但主要由日本等几个国家生产。
我国的生产规模仍处于小试或中试阶段,出口规模不到1000t [7],需加强L -G l n 工业生产菌株和工艺的研究。
国际上生产L -G l n 均采用发酵法。
Ya m ada 等[8]通过诱变获得了青霉素抗性突变株产黄菌FERM-P no .3628,L -G l n 生产能力由10g /L 提高到25g /L 。
汪世华等[9]以谷氨酸棒杆菌S9114为出发菌株,经C 线和硫酸二乙酯(DES)诱变处理,定向选育出1株生产菌SH 44,L -G l n 产量可积累达4114g /L 。
李爽等[10]以黄色短杆菌SG r 和DON r抗性菌株作为生产菌株,16L 罐中发酵44h 后可产L -G l n 5512g /L 。
汪世华等[11]采用C 线-DES -C 线进行复合诱变,筛选得到1株高产菌株S H 77,L -G ln 平均生产能力由812g/L提高到5513g/L,最高达5612g/L,这是目前国内报道的最高产能。
本文采用紫外和化学诱变相结合的方法,经高浓度的磺胺胍(SG)和(NH4)2SO4定向筛选,以获得1株高产L-G l n的菌株LG-65(SG r, (NH4)2SO r4),并在7L发酵罐中发酵,考察其优化后的发酵条件。
1材料与方法1.1材料1.1.1菌种嗜乙酰乙酸棒杆菌(C orynebacteri u m acetoaci-dophilu m)LG-3,笔者所在实验室保藏。
1.1.2试剂葡萄糖(工业级),山东西王生化科技有限公司;玉米浆,华北制药康欣有限公司;(NH4)2SO4(工业级),山东菱花味精股份有限公司;磺胺胍(SG),美国S i g m a公司;硫酸二乙酯(DES)、(NH4)2SO4 (分析纯),国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3仪器与设备SBA-40C生物传感分析仪,山东省科学院生物研究所;UV-2100可见紫外分光光度计,上海尤尼克有限公司;往复式摇床,无锡查桥轻机厂;P H S-3C型精密pH计,上海雷磁仪器厂;7L发酵罐,高百特发酵机(上海)有限公司。
1.1.4培养基基本培养基(g/L):葡萄糖20,(NH4)2SO4115, KH2PO41,K2H PO4#3H2O1,M gSO4#7H2O011, M nSO4#4H2O0101,FeSO4#7H2O0101,尿素115,琼脂20,生物素0100003,V B10100004。
完全培养基(g/L):葡萄糖5,牛肉膏10,蛋白胨10,酵母膏5,N a C l5,琼脂20。
种子培养基(g/L):葡萄糖25,K2H PO4#3H2O 1,KH2PO41,M gSO4#7H2O015,玉米浆30,尿素5。
摇瓶发酵培养基(g/L):葡萄糖140,玉米浆12, (NH4)2SO470,KH2PO4#3H2O2,M gSO4#7H2O015, M nSO4#H2O0101,CuSO4#5H2O01001,ZnSO4#7H2O 01001,V B1#H C l01001,V H0100003,Ca CO350。
上罐发酵培养基(g/L):葡萄糖100,玉米浆12,(NH4)2SO470,KH2PO4#3H2O2,M gSO4#7H2O 015,M nSO4#H2O0101,CuSO4#5H2O0101,ZnSO4# 7H2O01001,V B1#HC l01001,V H0100003。
另加消泡剂0115mL/L。
将(NH4)2SO4配制成400g/L的溶液,用N a OH 溶液调节p H为710,与发酵液分开灭菌,接种前与发酵液混合。
所有培养基灭菌前用Na OH溶液调p H为710~712,种子培养基、基本培养基和完全培养基在011M Pa下灭菌20m in,发酵培养基在0107 M Pa下灭菌15m i n。
1.2方法1.2.1培养方法1)斜面、平板培养方法在30e培养箱里培养20~24h。
2)摇瓶培养方法种子培养:500m L三角瓶中装液100m L,于往复式摇床上30e、90r/m in振荡培养7~8h。
摇瓶发酵培养:500mL三角瓶中总装液20mL,接种前加入(NH4)2SO4使其质量浓度为70g/L,接一环菌体或2m L种子液于往复式摇床上100r/m i n、30e培养72h。
3)7L发酵罐培养方法总装液量4L,接种前加入(NH4)2SO4溶液使其质量浓度为70g/L,接种量10%,通风2L/m in,调节搅拌转速使溶氧8h前维持在10%~15%,之后使溶氧维持在18%~ 25%;前期调节p H为712,8h后调节pH为5155~ 5160,发酵过程中流加800g/L葡萄糖溶液使其残糖质量浓度维持在40~50g/L,后期不再补糖使发酵结束时残糖质量浓度在10g/L以下,发酵40~ 45h结束。
112.2诱变方法紫外诱变和常规化学诱变法[12]。
1.2.3筛选方法1)平板筛选把诱变的菌液分别涂布于含SG 和(NH4)2SO4的基本培养基上,30e下培养3~4 d,挑出长势较好的单菌落进行摇瓶筛选。
2)摇瓶筛选初筛:将诱变得到的单菌落分别接环于20m L摇瓶发酵液中培养,挑出产酸较高的菌株。
复筛:将初筛得到的菌株接于种子液中,培养7~8h,再将种子液分别接种于3个摇瓶发酵液中进行摇瓶发酵,测出产量,挑出高产菌株。
1.2.4分析方法1)pH的测定国产精密pH试纸和PH S-3C型精密p H计测定。
2)OD的测定取012mL发酵液用0125m o l/LH C l溶液稀释25倍,于562nm测吸光度。
3)发酵液中还原糖含量的测定采用SBA-40C30生物加工过程第9卷生物传感分析仪测定。
4)发酵液中L-G l n含量的测定纸层析法[13]和酸解酶膜联用法[14]测定。
2结果与讨论SG是对氨基苯甲酸的结构类似物,能通过阻碍叶酸的合成,从而间接抑制ATP。
若菌种具有SG 抗性,便能解除这种抑制,从而提高细胞中ATP的含量,促进L-G l n的生成。
谷氨酸在谷氨酰胺合成酶(GS)的作用下结合一个NH+4后生成L-G ln,高浓度的NH+4是L-G l n大量合成的必要条件,但是过量的NH+4对GS有阻遏作用,所以选育具有NH+4抗性的突变株,可解除对GS的阻遏,从而有利于L-G ln的合成。
2.1L-G l n高产菌株的选育与抗性比较2.1.1L-G l n高产菌株的选育LG-3经UV和DE S诱变,再经SG平板、高浓度(NH4)2SO4平板筛选和摇瓶发酵,得到1株具有SG抗性和高浓度(NH4)2SO4抗性的突变株LG-65,在未经优化的条件下,可生产L-G l n4315 g/L。