应用基于适配器连接介导的等位基因特异性扩增法检测LRRK2基因的单核苷酸多态性

合集下载

单个核苷酸多态性论文：单个核苷酸多态性遗传检测荧光定量PCR RT1复合体高保真酶特异性检测

单个核苷酸多态性论文：大鼠SNP遗传检测技术研究【中文摘要】近年来,随着分子生物学技术的快速发展,实验动物遗传检测方法不断改进和提高,从蛋白到基因组序列,从宏观到微观,以达到准确、快速、高通量的检测要求。

目前,国内外对近交系小鼠SNP遗传检测的研究较多,而对大鼠SNP遗传标记的研究较少,尤其是针对主要组织相容性复合体(RT1)上SNP遗传标记的研究尚未见报道。

主要组织相容性复合体(RT1)是决定近交系大鼠免疫遗传品质最主要的基因群,也是进行遗传学检测的一个重要研究领域。

本论文以大鼠RT1复合物基因组中具有多态性的单个核苷酸(SNP)为研究对象,利用分子生物学技术,建立了三种SNP遗传检测方法,为实验大鼠的遗传质量控制提供新的遗传检测手段。

本研究分为三个方面。

第一部分是建立大鼠SNP直接测序分型遗传检测方法。

通过比对NCBI Nucleiotide数据库,查询BN与F344近交系大鼠多态性程度高的区域即RT1区序列,选定多态性信息丰富的5个区域(A区、B区、C区、D区、E区),以国内7种近交系大鼠(BN、F344、WKY、LEW、SHR、MIJ 和HFJ)为模板进行扩增,片段经直接测序后进行序列比对,结果显示共获得10个SNP多态性位点,即A区序列545位(A...【英文摘要】In recent years, with the rapid development of molecular biological techniques, genetic monitoring methods for experimental animals continue to improve, from protein to genome sequence, from macro to micro, in order to achieveaccurate, fast, high-throughput testing requirement. At present, the study of SNP markers for genetic monitoring of experiment mice is more and more performed, but for rats this study is scarce, especially for SNP loci in major histocompatibility complex. Major histocompatibility comp...【关键词】单个核苷酸多态性遗传检测荧光定量PCR RT1复合体高保真酶特异性检测【英文关键词】Single Nucleotide Polymorphism(SNP) Genetic monitoring Real-time PCR RT1 complex High-fidelity enzyme specific detection technology【索购全文】联系Q1：138113721 Q2：139938848 同时提供论文写作一对一辅导和论文发表服务.保过包发【目录】大鼠SNP遗传检测技术研究一、中文摘要3-5二、英文摘要5-6三、前言7-10四、正文10-74第一部分大鼠SNP 直接测序分型遗传检测方法的建立10-29（一）实验材料10-12（二）实验方法12-16（三）实验结果16-25（四）分析与讨论25-27（五）小结27-29第二部分大鼠SNP 荧光定量PCR 遗传检测方法的建立29-47（一）实验材料29-31（二）实验方法31-38（三）实验结果38-44（四）分析与讨论44-46（五）小结46-47第三部分大鼠SNP 高保真酶特异性遗传检测方法的建立47-72（一）实验材料47-49（二）实验方法49-54（三）实验结果54-67（四）分析与讨论67-71（五）小结71-72第四部分实验总结72-74五、参考文献74-76六、缩略语索引76-77七、文献综述77-85参考文献82-85八、致谢85-86九、在读期间发表文章86。

环介导等温扩增技术在单核苷酸多态性检测中的应用

环介导等温扩增技术在单核苷酸多态性检测中的应用李森;王源升;余红伟;李瑜【摘要】Single nucleotide polymorphisms(SNP),the most common form of sequence variation in the gene,occur about at 1 out of every 1 000 bases in the human genome sequence.There are important applications for SNP gene typing method in the related gene identification researches of genetic diseases,disease susceptibility and pharmacogeneticindicator.Loop-mediated isothermal amplification(LAMP) is a new type of nucleic acid amplification MP-SNP technology is to design the specific primers according to different SNP genes in the same reaction system to realize the detection of SNP gene bining with the advantages of LAMP technology,the application of LAMP technology in the SNP detection field is reviewed.%单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)是一种最常见的基因序列差异,在人类基因组序列中大约每一千个碱基就会出现一次.SNP基因分型检测方法在遗传疾病、疾病易感性和药理学指示物的相关基因识别的研究中有着重要的应用.环介导等温扩增(LAMP)技术是一种新型的核酸放大扩增技术,LAMP-SNP技术就是在同一反应体系中通过设计针对不同SNP基因的特异性引物,从而实现对SNP基因分型的检测.结合LAMP技术的优势,对其在SNP检测领域的应用进行了综述.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2017(034)003【总页数】6页(P1-6)【关键词】环介导等温扩增;快速检测;单核苷酸多态性【作者】李森;王源升;余红伟;李瑜【作者单位】海军工程大学舰船工程系,湖北武汉 430033;海军工程大学理学院,湖北武汉 430033;海军工程大学理学院,湖北武汉 430033;海军工程大学理学院,湖北武汉 430033【正文语种】中文【中图分类】Q81人类基因组DNA序列的差异导致了个体之间的性状差异，包括发生疾病可能性的差异[1-2]。

应用环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究

ｌｏｍｅｉｔｄｓｔｅｍａａｏｐ－ｄａｅｉｏｈｒｌｍｐｌｃｔｎｉａｉｐｒｍｅｓｉｆｏｉｒｗｅｅｅｉｎｅａｄｎｖｅａｄｉｈｙｐｅｉｃｌｏ．ｄａｅｒｄｓｇｄｎａｏｌｎｈｇｌｓｃｆｏｐｍｅｉｔｄｉ
中国动物检疫
２１００年第２７卷第９期
一２５一
持人：藕祥ｇｗｙ胡ｄｊ＠ｉ肿ｍ
应用环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究
唐梦君 ’，一高玉时，生张小燕，周，唐修君，蒲俊华２葛庆联 Ⅲ ，（．１农业部家禽品质监督检验测试中心，苏扬州２０；．江２０３２中国农业科学院家禽研究所，５江苏扬州２５０）２０３
ｋ哪
ｌｈｎｎｌｅｎｌＡｍｐｉｅ￣ａａＡｓａｏｐｄＤＩ０ｆＩｍｔｌａｉｆｓｙｆｒＲａｉ她ｎｏｊ
Ｍ ∞０ Байду номын сангаасｃ
ＴｎｎｊｎａｇＭｅｇ，ＧｏＹｕｈｕａｓｉ，Ｚｏｈｎｈｎｉｏａ，ＴｎｕＵ，Ｐｕｈａ，ＧｉｇｉｈｕＳｅｇ，ＺａｇＸａｙｎａｇＸｉｆｊｌｕＪｎｕ～ｅＱｎｌｎ’ ａ
Ａｂ —
：ＡｃｏｄｎｏｃｒｉｇｔＧｅＢａｋｐｂｉｈｄＬｓｒｎｃｔｇｎｓｈｙｇｎｓｑｅｃ，ｔｒｅｐｉｓｏｐｃｆｎｎ —ｕｌｅｉｔｉｍｏｏｙｏｅｅｌＡｅｅｅｕｎｅｈｅａｒｆｓｅｉｃｓｅａｉ

帕金森病患者PINK1LRRK2基因单核苷酸多态性分析

中国实用神经疾病杂志２０１３年１２月第１６卷第２４期
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｒａｃｔｉｃａｌＮｅｒｖｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓＤｅｃ．２０１３，Ｖｏ１．１６Ｎｏ．２４
・１・
・
论著・
帕金森病患者ＰＩＮＫ１ＬＲＲＫ２基因单核苷酸多态性分析
赵辉
徐州
董丽果
２２１０新
丁新生”
１）南京医科大学第一附属医院南京２１００２９２）徐州医学院附属医院神经内科徐州２２１００２３）江苏徐州中心医院神
Ａｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ０ｆＰＩＮＫ１。ＬＲＲＫ２ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＰａｒｋｉｎｓｏｎ’ ｓｄｉｓｅａｓｅＺｈａｏＨｕｉ，ＤｏｎｇＬｉｇｕｏ，ＭｕＹｉｎｇｆｅｎｇ，ＣｈｅｎＹｕｍｉｎ，ＹａｎｇＸｉｎｘｉｎ，ＤｉｎｇＸｉｎｓｈｅｎｇＮｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｅｎｔａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｘｕｚｈｏｕ２２ｌ００９。Ｃ＾ｉａｎ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｈｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｕｄｙｉｓｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆｒｓ４５５３０３４０，ｒｓ１４９１９４２，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆ

锁核酸和不对称扩增辅助的等位基因多重引物识别KRAS基因突变的研究

锁核酸和不对称扩增辅助的等位基因多重引物识别KRAS基因突变的研究师声;张静;胡岳;刘义庆;褚福禄;兰文军【期刊名称】《齐鲁工业大学学报》【年(卷),期】2022(36)5【摘要】RAS突变的检测为指导结直肠癌的预测和预后提供了有力的工具。

探讨一种简洁、低成本的用于检测KRAS基因突变的多重引物等位基因识别方法(multiplex primer allelic discrimination,MP_(m) AD)。

利用不对称扩增和含锁定核酸(locked nucleic acid,LNA)的等位基因特异性引物、以及共同的反向引物和探针,进行多重孔检测和参考孔检测,以多重检测和参考检测的扩增循环数值差(ΔC_(q))来判定结果。

同时使用福尔马林固定石蜡包埋组织(Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues,FFPET)样本或在野生型基因组DNA背景下混合质粒进行非临床性能评价,并采用Kappa检验比较MP_(m) AD与Sanger测序的结果一致性。

该方法对KRAS热点突变检测灵敏度至少为3%;凝胶电泳也验证了方法的特异性;重现性的变异系数(coefficient of variation,CV)<15%;同源基因检测未观察到交叉反应。

通过分析115例FFPET标本,MP_(m) AD法与Sanger测序结果之间无统计学差异(k>0.9;p<0.001)。

MP_(m) AD方法可以简洁、低成本地检测KRAS热点突变。

【总页数】7页(P55-61)【作者】师声;张静;胡岳;刘义庆;褚福禄;兰文军【作者单位】齐鲁工业大学(山东省科学院)生物工程学院;山东第一医科大学附属省立医院临床医学检验部【正文语种】中文【中图分类】Q754【相关文献】1.采用改进的三引物等位基因扩增法对痛风相关SN P位点的分型研究2.NSCLC 原发肿瘤和转移瘤中EGFR基因突变、基因扩增及KRAS基因突变的Meta分析3.基于锁核酸及等位位点特异性扩增技术的KRAS基因突变检测荧光定量PCR方法研究4.锁核酸修饰探针熔解曲线分析在Kras基因突变检测中的应用因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

基于CRISPR-链取代的等温扩增及检测技术[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810328785.3(22)申请日 2018.04.13(71)申请人中国科学院深圳先进技术研究院地址 518055 广东省深圳市南山区深圳大学城学苑大道1068号(72)发明人喻学锋　周文华　胡丽　(74)专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有限公司 44205代理人许飞(51)Int.Cl.C12Q 1/6844(2018.01)(54)发明名称基于CRISPR-链取代的等温扩增及检测技术(57)摘要本发明公开了基于CRISPR-链取代的等温扩增及检测技术。

基于CRISPR-链取代的等温扩增试剂盒，包括链取代等温扩增试剂，试剂盒还包括了野生型Cas9和/或核酸酶缺陷的Cas9切口酶、特异性识别目标DNA序列上下游的sgRNA对，链取代等温扩增反应的扩增引物对，该引物对与Cas9-sgRNA复合体对与目的基因结合后暴露出的单链区域互补。

该技术操作简单，抗干扰能力强，检测结果准确可靠。

权利要求书1页说明书10页序列表5页附图3页CN 108588182 A 2018.09.28C N 108588182A1.一种基于CRISPR -链取代的等温扩增试剂盒，包括链取代等温扩增试剂，其特征在于：试剂盒还包括了野生型Cas9和/或核酸酶缺陷的Cas9切口酶、特异性识别目标DNA序列上下游的sgRNA对，链取代等温扩增反应的扩增引物对，该引物对与Cas9-sgRNA复合体对与目的基因结合后暴露出的单链区域互补。

2.根据权利要求1所述的等温扩增试剂盒，其特征在于：核酸酶缺陷的Cas9切口酶为HNH核酸酶缺陷的Cas9切口酶。

3.根据权利要求1所述的等温扩增试剂盒，其特征在于：sgRNA对的识别位点分别为目的序列上游CCN序列3’端的10～30个核苷酸序列和下游NGG序列5’端的10～30个核苷酸序列。

一种单核苷酸多态性检测用组合物及其应用[发明专利]

专利名称：一种单核苷酸多态性检测用组合物及其应用专利类型：发明专利
发明人：焦海涛,何志辉,葛海鹏,沈伟强
申请号：CN202011172626.2
申请日：20201028
公开号：CN111996244A
公开日：
20201127
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于基因荧光探针检测技术领域，具体涉及一种单核苷酸多态性检测用组合物及其应用。

单核苷酸多态性检测用组合物含有：不同等位基因间共用的上游引物与下游引物，每种等位基因特异性的等位基因特异性引物，及同各等位基因特异性引物分别互补关联的使用不同荧光标记的探针，探针覆盖单核苷酸多态性位点。

采用本发明单核苷酸多态性检测用组合物进行基因检测，可实现单管内多等位基因检测，灵敏度高，又能区分基因的杂合或纯合类型，且无需探针反复优化，节省成本，提高检测通量，结果准确，便于分析。

申请人：上海鼎晶生物医药科技股份有限公司
地址：200000 上海市浦东新区芙蓉花路118弄3号5层
国籍：CN
代理机构：北京哌智科创知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：蒋辉
更多信息请下载全文后查看。

一种单核苷酸多态性分析方法[发明专利]

专利名称：一种单核苷酸多态性分析方法专利类型：发明专利
发明人：郭安亮,姚见儿,王方金,刘榴
申请号：CN201310062203.9
申请日：20130227
公开号：CN104004821A
公开日：
20140827
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种单核苷酸多态性分析方法。

揭示了一种测定已知单核苷酸多态性的新方法；针对待测基因模板，设计特异性引物分别向两个不同的方向扩增，控制另外两条分别与特异性引物配对的外围引物扩增效率，使整个PCR反应体系在野生型或者纯合突变型标本检测时只有一种型特异性PCR产物，在杂合标本检测时有两种PCR产物，明确区分野生型/杂合型/突变型。

本发明为临床检测提供了一种结果稳定、重复性好、适用机型广的SNP分析方法。

申请人：上海透景生命科技有限公司
地址：201203 上海市浦东新区上海浦东张江高科技园区松涛路646号3楼
国籍：CN
代理机构：上海专利商标事务所有限公司
代理人：陈静
更多信息请下载全文后查看。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

现代生物医学进展 Progress in Modern Biomedicine 2009Vol.9No.14·技术与方法·应用基于适配器连接介导的等位基因特异性扩增法检测LRRK2基因的单核苷酸多态性*孙晓如1卜莹2丁新生3汪维鹏2丁海霞3丁一冰1邓黎丽2王枫3周国华2黄乐群1（1南京大学医学院江苏南京210093；2华东医学生物技术研究所江苏南京210002；3江苏省人民医院神经内科江苏南京210029）摘要目的：应用基于适配器连接介导的等位基因特异性扩增法（Adapter Ligation-mediated Allele-specific Amplification ，简称ALM-ASA ）技术，检测与帕金森病（PD ）发病相关的LRRK2基因中的4个SNP 位点（6055G>A,7153G>A ，4321C>T 和2264C>T ），探讨该法用于筛查帕金森病相关SNP 位点的可行性，研究多个SNP 位点同时检测的准确性和可靠性。

方法：运用ALM-ASA 法原理，改进使用多重PCR 法代替单一预扩增法，使用4对引物在单管中预扩增含所待测SNP 位点的四段片段，通过酶切、酶连和PCR 特异性扩增检测判断SNP 的类型。

经PCR 体外定点突变实验制备的相应位点的突变阳性片段，检验方法的准确性和可靠性。

结果：采用该法成功测定了20名PD 病人和20名健康中国人的LRRK2基因中最受关注的4个SNP 位点的多态性。

并随机对其中10分样本的检测结果以测序法检测进行验证，结果完全一致。

结论：ALM-ASA 法极大提高了PCR 反应的特异性，是一种准确、可靠，且费用低廉的SNP 筛查方法，可推广应用于临床和实验室进行与PD 有关的单核苷酸多态性的筛查检测。

关键词：ALM-ASA 法，LRRK2，单核苷酸多态，多重PCR ，中图分类号：R741文献标识码：B 文章编号：1673-6273（2009）14-2716-05Adapter-ligation Mediated Allele-specific Amplification (ALM-ASA)for Multiplex SNP Genotyping of LRRK2*SUN Xiao-ru 1,BU Ying 2,DING Xin-sheng 3,WANG Wei-peng 2,DING Yi-bing 1,DING Hai-xia 3,DENG Li-li 2,WANG Feng 3,ZHOU Guo-hua 1,2,HUANG Le-qun 1（1College of medicine,Nanjing University,Nanjing,Jiangsu,210093,P.R.China;2Huadong Research Institute for Medicine and Biotechnics,Nanjing,Jiangsu,210002,P.R.China;3Jiangsu People's Hospital,Nanjing,Jiangsu,210029,P.R.China ）ABSTRACT Objective:To apply a new method named as adapter-legation mediated allele-specific amplification (ALM-ASA in short)for multiplex single nucleotide polymorphism (SNP)genotyping of 1eucine rich repeat kinase 2(LRRK2)in Parkinson's disease (PD)patients.Four SNPs loci 6055G>A （G2019S ）,7153G>A （G2385R ），4321C>T （R1441C ）and 2264C>T （P755L ）in LRRK2gene were selected as targets for investigation.Methods:The ALM-ASA method was applied to the genotyping with a slight modification,such as multiple DNA fragments containing SNPs of interest were preamplification instead of one fragment with all SNPs.By comparing with the positive samples artificially prepared from the PCR-based site-directed mutagenesis,the accuracy and reliability of the method was testified.Results:The four SNPs in the samples of 20patients and 20healthy were successfully typed.The results were in agreement with those by Sanger's DNA sequencing method.Conclusion:ALM-ASA is an accurate and efficient method for LRRK2SNP typing with the advantages of simple set-up,low sample consuming,and lower running cost.It will be very powerful for screening the SNPs in the LRRK2gene associated with PD in clinical research.Key words:Adapter-ligation mediated allele-specific amplification;1eucine rich repeat kinase 2;single nucleotide polymorphism;multiplex PCRChinese Library Classification:R741Document code:BArticle ID:1673-6273（2009）14-2716-05*基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.30270368）通讯作者：黄乐群，Email ：huanglq@ （收稿日期：2009-05-05接受日期：2009-05-31）帕金森病（Parkinson's disease,PD ）是当今发生最为广泛的神经退行性疾病,已成为严重影响人类健康的重要疾病之一。

据最近的统计资料显示，我国55岁以上老年人帕金森病的发病率约为1%，给社会和病人家庭带来了极大的经济与精神负担。

随着家族遗传性PD 的致病基因a-synuclein 、Parkin 、DJ-1和PINK1的相继克隆，遗传因素在PD 发病机制中的作用越来越受到重视。

而家族性帕金森病8型(PARK8)的致病基因，即亮氨酸富集区重复激酶2（1eucine rich repeat kinase 2，LRRK2）基因，由于其变异在散发性和家族性PD 人群中均有发现，逐渐引起了广泛的关注[1]，成为研究PD 发病机制的热点。

LRRK22716··现代生物医学进展 Progress in Modern Biomedicine2009Vol.9No.14表1用于LRRK2基因中4个SNP位点测定实验用引物及其相应的扩增产物长度Table1The primers used for typing four SNPs in LRRK2gene and the corresponding lengths of amplification productsSNPs引物名Primer name引物序列（5'-3'）Primer sequence(5'-3')扩增长度Product length(bp)预扩增引物PrimersFor Pre-Amplification 7153G>A7273F CAATTCAGAATGGTTAGGGAAG635 7273R GACACTGTGACAGAACTATGTC6055G>A6055F AGGGACAAAGTGAGCACAGA918 6055R TGGGAACTAAGAAAGGGAGG4321C>T4321F TGCCACCTAAAAGGGTGAAG550 4321R AAGTGAGTTGCTCACTTCTC2264C>T2384F ATGCTTGTCTTGAGGAGCTC883 2384R CTTAAGGTCCCTCAAACTGG等位基因特异性引物Allele-Specificprimers 7153G>A7153G(A)AAAAGTGCACGCAGTCTATTAGaCC(T)b307 6055G>A6055G(A)TGCAAAGATTGCTGACTtCG(A)383 4321C>T4321C(T)ACAGGGGAAGAAGAAGCcCG(A)171 2264C>T2264C(T)TTCAGTAAGAGTTCCACCAATTaGG(A)576体外定点突变引物PrimersforartificialAllelemutation 7153G>A2385p1AAGTAACCAAAAGTAAGTAAAG2385p3GTCTATTAGTCTACAGAGTTTTTCAc2385p2ACTCTGTAGACTAATAGACTGCGT2385p4TAGAGCAGATAATCCTGGGGC 6055G>A2019p1CACTTATCAGATTTGACCCT2019p3GAGCAATGCTGTAGTCAGCA2019p2TGCTGACTACAGCATTGCTC2019p4AGCACTGGCCCCATAACTGC 4321C>T1441p1GAAGATGGGAAAGGAAAACTAT1441p3AGAAGCGCAAGCCTGGA1441p2CCTCCAGGCTTGCGCTT1441p4TCAGTATCCCAGAAACGGTC 2264C>T755p1CTAACCCACCCTGAACACAT755p3TTCCACCAATTTGAGACTGC755p2GTCTCAAATTGGTGGAACTC755p4TTGCAATATCTTTGGCTTAA基因位于染色体12q12，全长7584个碱基，共有51个外显子，编码一个含2527个氨基酸的大分子蛋白。