蛋氨酸裂解酶的基因克隆及序列分析

第19卷 第12期医学研究生学报Vo.l19 No.12 2006年12月Journal o fM edical Postgraduates Dec.2006

论 著 蛋氨酸裂解酶的基因克隆及序列分析

马百坤1, 唐晓莹2, 黄惠臣3, 时永辉1

(1.南京军区南京总医院解放军检验医学研究所,江苏南京210002;2.昆山市第三人民医院检验

科,江苏昆山215316;3.张家港市第一人民医院检验科,江苏张家港215611)

摘要: 目的:克隆蛋氨酸裂解酶(M ET ase)中阴道毛滴虫蛋氨酸裂解酶(T V M GL1)基因,探讨重组M ET ase

(r M ET ase)对肿瘤细胞生长的抑制作用。 方法:从培养的阴道毛滴虫提取总RNA,以此为模板,利用RT PCR获取T V M GL1基因,琼脂糖电泳分离纯化所得目的基因并克隆至T V ector,AB I3730自动序列分析仪分析所得基因序列。 结果:PCR产物经琼脂糖电泳,目的基因片段大小与预期大小相符;序列分析所得基因序列为1191bp,

与国外报导的序列相符。 结论:从培养的阴道毛滴虫中成功克隆出T V M GLV1基因,为M ET ase抗肿瘤作用的研究奠定了基础。

关键词: 蛋氨酸裂解酶; 基因克隆; 反转录PCR

中图分类号: Q785 文献标识码: A 文章编号: 1008 8199(2006)12 1063 04*

C loning of L M ethi o nine lyase gene

MA B ai kun1,TANG X iao y i n g2,HUANG H ui chen3,S H I Y ong hui1

(1.Instit u te of M e d ical Laboratory Science of PLA,N anjing GeneralH os p ital of N anjing M ilitar y Co m

m and,PLA,Nanjing210002,J iangsu,China;2.Depart m ent o f Labor atory,K uns han Thir d H os p it a l,K un s han215316,J i a ngsu,China;3.Depart m ent of Laboratory,Zhangjiagang F irst H os p ital,Zhangjiagang 215611,J iangs u,China)

Abstract: Objective:To i d entify,clone,sequence the L M eth i o nine lyase gene fro m Tricho m onas vag i n alis(TV MGL1). M et h ods:To tal RNA w as prepared fro m pri m itive protozoon tricho m onas vagina lis,c DNA frag m ent encoding M eth i o nine l y ase gene w as a m plifi e d by RT PCR using specific pri m ers,

and then w as cloned i n to pGE M T vector.InsertedM ethion i n e lyase gene w as sequenced by AB I3730 DNA Sequencer. Results:Ana l y sis ind icates that the DNA frag m ent is1191base pa irs i n length and has h i g h nuc leoti d e ho mo logy w ith that repo rted previousl y. Conclusion:L M eth i o nine l y ase gene w as successf u ll y cloned.

Key w ords: L M e t h ion i n e lyase; Gene clon i n g; Reverse transcri p ti o n PC R

0 引 言

由于传统的化疗药物无针对肿瘤细胞的特异性,在对肿瘤细胞杀伤的同时,对正常组织细胞也产生非常强的破坏作用。在肿瘤药物的治疗上,目前还缺乏足够特异、有效的手段。蛋氨酸是肿瘤细胞生长所高度依赖的代谢物质,这种依赖性为肿瘤细胞所普遍具有。减少组织对蛋氨酸的摄取,甚至破坏已存在于机体内蛋氨酸的含量,能显著抑制肿瘤细胞的生长[1-3]。蛋氨酸裂解酶(L M et h i o nine l y ase, METase)存在于一些假单胞菌和原虫中,METase能特异性地裂解细胞内外的蛋氨酸。通过分子克隆技术获得重组METase(r M ETase),并对其在抑制肿瘤细胞生长的作用及机制进行深入研究,有望使METase

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*收稿日期: 2006 07 04; 修订日期: 2006 09 21

基金项目: 江苏省医学重点学科基金资助项目(苏卫科教[2001]34)

作者简介: 马百坤(1964 ),男,浙江余姚人,副主任技师,副教授,医学学士,从事医学检验专业。

成为一种特异的肿瘤化疗药物。国外已有r M ETase 成功用于抑制体外培养肿瘤细胞的生长和对肿瘤小鼠活体抗肿瘤疗效的报道[1,4,5],国内至今未见相关研究报道。本研究用RT PCR法成功克隆阴道毛滴虫的METase(L M et h ion i n e Lyase fro m T richo m onas vag i n alis,TV MGL1)基因,DNA序列分析所得基因片段与国外报导的序列相符,为METase基因的体外表达,获得r M ETase以及深入了解M ETase的结构、功能,并对METase在临床抗肿瘤治疗应用价值的研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒 受体菌大肠埃希菌(E sche richia coli,E.coli)DH5 为本室保存菌种;pGE M T Easy V ector(C atalog#A3600)购自Pro m ega公司。1.1.2 工具酶和试剂 限制性内切酶Bam H、N ot和T4DNA连接酶,pfu DNA Po ly聚合酶、总RNA提取试剂盒(SV Total RNA Iso lati o n Syste m, Ca.t#Z3100)和RT PCR试剂盒Reverse Transcri p ti o n Syste m,C a.t#A3500)均为Pro m ega公司产品。DNA纯化回收试剂盒购自北京博大生物技术公司。DNA M arker购自大连Ta K a Ra公司;低分子量蛋白标准购自上海生物化学研究所;异丙基 D 硫代半乳糖苷(isoaropy l beta D thioga l a ctopyranoside,I PTG)购自M erck公司。

1.1.3 主要仪器 扩增仪PE2400Am plifier为美国PE公司产品;H oefer m ini V E型垂直电泳仪为Phar m acia公司产品。

1.2 引物合成 检索GenBank,以阴道毛滴虫TVMGL1编码序列CDS(P UB MED I D:9488680)为参照,用Pri m er5.0软件设计PCR引物,由上海生工合成,序列如下:上游引物(t m gl1F)5! CGGGATC C ATGTCTC AC GAGAGAATGACCCC 3!,引物5!端加入Bam H位点;下游引物(t m g l1R)5! GAAGATCTT TATAAAAGAGC GTC AAGGCCC TG 3!,引物5!端加入Bg l∀位点

1.3 原虫体外培养 阴道毛滴虫取自在本院体检、白带常规涂片检查含阴道毛滴虫但近期未服用抗生素的志愿者;培养基配方由本院微生物室邵海枫主任提供,每100m l培养液中含15%肝浸液10m l、Tryptone SOYA B r o th(OXO I D)2g、葡萄糖0.5g、牛血清15m l、青霉素500万单位,p H调至5.7。于37#条件下培养48h。

1.4 细胞总RNA提取 取1.5m l原虫培养液,2000r/m i n离心2m i n,弃上清。经离心富集的原虫用Pr ogega总RNA提取试剂盒,按操作说明书提取总RNA。

1.5 RT PCR扩增TV MGL1c DNA

1.5.1 逆转录反应 在0.2m l PCR管中加入10!l 所提取的阴道毛滴虫总RNA,于70#加热变性10 m i n后,快速置于冰上,再加入10∃逆转录缓冲液4 !l、25mm ol/L M gC l28!l、10mm o l/L d NTP4!l、RNA酶抑制剂(RN asin)1!l、AMV逆转录酶1!l (30U)、TVMGL1下游引物2!l、DEPC处理水10 !,l总反应体积为40!l。混匀后,置室温下10m i n,于42#逆转录45m i n,94#变性5m in。

1.5.2 PCR扩增 以逆转录反应产物为模板,用pfu DNA聚合酶扩增TV MGL1。PCR条件如下:95#变性2m in,以95#变性45s、58#退火50s、73#延伸150s,进行30个循环;最后73#延伸10m in。1.6 测序载体构建及TV MGL1的核苷酸序列分析

1.6.1 目的基因的分离及加尾 1%的琼脂糖凝胶电泳分离RT PC R所获的TV MGL1DNA片段,用博大DNA回收试剂盒回收胶上切下的目的片段[6]。平端DNA片段经与Taq酶、dATP于70#保温30 m i n,在其片段的3!端添加腺苷酸。

1.6.2 测序载体的构建和鉴定 取2!l经加尾腺苷酸的目的基因片段,与pGE M T E asy载体以3%1的比例用T4DNA连接酶连接,转化E.co li DH5 感受态细胞,并涂布于含氨苄西林的LB培养液培养皿中,37#恒温培养12~16h。随机挑选24个单菌落至5m l含氨苄西林的LB培养液中,37#,200 r/m i n摇菌过夜。碱裂解法提取细菌中的质粒。质粒DNA用Bam H、Bgl∀双酶切鉴定,1.0%琼脂糖凝胶电泳分析酶切片段。

1.6.3 TV MGL1基因序列分析 委托I NV I T ROGE N 和上海生工公司,用美国ABI3730型全自动核苷酸序列分析仪及其配套试剂,对经酶切初步鉴定的2个重组pT TV MGL1载体进行序列分析。

2 结 果

2.1 RT PCR扩增TV MGL1基因 以所获的阴道毛滴虫RNA为模板,用引物t m g l1F、t m g l1R进行RT PC R,获得了1200bp左右的DNA片段,结果见图1。

2.2 测序载体的构建和序列分析 将RT PCR获得的DNA片段与pGE M T E asy Vector连接,转化E.coli DH5 感受态细胞,分别挑取单菌落,提取质粒DNA,并进行B a m H、Bgl∀双酶切鉴定,结果得到9个阳性重组子(pGE M T/TVMGL1)。见图2。

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