实用HPLC方法的建立(施超欧)
高效液相色谱方法建立
一般情况下，HPLC分离方法的建立遵循以下步骤：(1)了解样品的基本情况所谓样品的基本情况，主要包括样品所含化合物的数目、种类(官能团)、分子量、pKa 值、UV光谱图以及样品基体的性质(溶剂、填充物等)、化合物在有关样品中的浓度范围、样品的溶解度等。
(2)明确分离目的①是分析组分还是制备样品；②是否已知样品所有成分的化学特性，或是否需做定性分析；③是否有必要解析出样品的所有成分(比如对映体、非对映体、同系物、痕量杂质)；④如需做定量分析，精密度需多高；⑤建立的方法将适用几种样品分析还是许多种样品分析；⑥将使用最终方法的常规实验室中已有哪些HPLC设备和技术。
(3)了解样品的性质和需要的预处理除非样品是适于直接进样的溶液，否则，高效液相色谱分离前均需进行某种形式的预处理。
有的样品需加入缓冲溶液以调节pH值；有的样品含有干扰物质或“损柱剂”而必须将其去除。
此外，为了保证最终的样品溶液与流动相的成分尽量相近，最好用流动相溶解(或稀释)样品。
(4)检测器的选择不同的分离目的对检测的要求不同，如测单一组分，理想的检测器应仅对所测成分响应，而其他任何成分均不出峰。
另外，如果目的是定性分析或是制备色谱，则最好有通用型检测器，以便能检测到混合物中的各种成分。
仪对分析而言，检测器灵敏度越高，最低检出量越小越好；如果目的是用作制备分离，则检测器的灵敏度没必要很高。
应尽量使用紫外检测器(UV)，因为目前一般的HPLC都配有这类检测器，它方便且受外界影响小。
如被测化合物没有足够的UV生色团，则应考虑使用其他检测手段：如示差折光检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
如果实在找不到合适的检测器，才可以考虑将样品衍生化为有UV吸收或有荧光的产物，然后再用UV或荧光检测。
(5)分离模式的选择在充分考虑样品的溶解度、分子量、分子结构和极性差异的基础上，确定HPLC的分离模式。
(6)固定相和流动相的选择在实际分析过程中，确立了分离模式之后，选择合适的固定相与流动相是十分重要的。
HPLC分析方法开发与验证
HPLC分析方法开发与验证HPLC（High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱法）是一种常用的分析技术，广泛应用于药物研发、环境监测、食品检测等领域。
本文将从方法开发和验证两个方面介绍HPLC分析方法。
一、方法开发方法开发是确定分析物检测条件的过程。
以下是HPLC方法开发的步骤：1.确定分析目标：确定待分析的物质以及其化学性质，如分子量、分子结构等，以便选择正确的色谱柱和检测方法。
2.选择色谱柱：根据分析物的特性选择合适的色谱柱，如反相色谱柱、离子交换色谱柱等。
3.优化流动相：选择适当的流动相组成，如有机溶剂和缓冲液的混合物，以实现分离效果的最大化。
4.优化柱温：通过改变柱温度来控制分析物的保留和分离，可以提高分离效果和峰形。
5.选择检测波长：根据分析物的特性选择最佳的检测波长，以最大化检测灵敏度和选择性。
6.确定流速和进样体积：通过改变流速和进样体积来优化分离效果和检测灵敏度。
7.优化pH值：对于离子化合物，通过改变缓冲液的pH值可以改变分离效果。
8.创建方法文件：根据上述优化结果，建立最终的分析方法文件，记录分析条件和步骤。
二、方法验证方法验证是确保分析方法可靠和准确的过程，以下是HPLC分析方法验证的主要内容：1.线性范围：检测浓度在一定范围内的线性关系，通过测定不同浓度的标准品并绘制标准曲线来确定。
2.精密度和重复性：通过重复测定样品的相对标准偏差（RSD）来评估分析方法的精密性。
3.准确度：通过添加已知浓度的标准品到已知浓度样品中并测定含量，评估分析方法的准确性。
4.特异性：分析物是否受其他物质的干扰，通过对混合标准溶液进行测定来评估色谱方法的特异性。
5.检出限和定量限：标准曲线下限和浓度下限的浓度，测定方法的灵敏度。
6.系统适应性：测试HPLC仪器系统的重复性和稳定性，包括波长准确性、峰对称性和分离效果。
7.样品稳定性：评估样品在一定时间和条件下的稳定性，包括溶液稳定性和冷冻/解冻稳定性。
氨甲苯酸注射液有关物质和含量测定hplc法的建立
文章标题：氨甲苯酸注射液的HPLC法测定及相关物质含量分析在医药领域中，药品的质量和有效性直接关系到患者的健康和生命。
氨甲苯酸注射液作为一种重要的药品，在临床上用于治疗一些疾病。
对氨甲苯酸注射液的质量进行分析和监控就显得尤为重要。
本文将重点介绍氨甲苯酸注射液相关物质和含量的HPLC法测定的建立及分析。
1. 氨甲苯酸注射液概述氨甲苯酸注射液是一种常用的止痛药物，主要用于缓解各种疼痛。
其主要成分为氨甲苯酸，以及一些相关的物质。
而这些相关物质的含量对于药品的质量和稳定性有着重要的影响。
2. HPLC法的建立HPLC（High Performance Liquid Chromatography）是一种高效液相色谱法，它具有分离效果好、灵敏度高、重现性好等特点，因此在药品分析领域得到广泛应用。
建立氨甲苯酸注射液相关物质和含量的HPLC法，可以准确、快速地分析出药品中各个成分的含量，保证药品的质量和安全性。
3. 相关物质和含量的分析通过HPLC法，可以对氨甲苯酸注射液中的各种物质进行分离和测定。
比如氨甲苯酸的含量、有机酸的含量、以及其他可能存在的杂质。
这些物质的含量分析可以帮助我们全面了解药品的成分和质量状况。
4. 个人观点和理解对于氨甲苯酸注射液相关物质和含量的HPLC法测定，我认为它可以为药品的质量控制提供一个科学、可靠的分析手段。
通过对药品中各种成分进行定量分析，可以及时发现问题并加以解决，确保患者用药的安全性和有效性。
总结回顾：本文对氨甲苯酸注射液的相关物质和含量的HPLC法进行了探讨。
HPLC法的建立和分析可以帮助我们全面了解药品的成分和质量状况，保障患者的用药安全。
在未来的药品质量控制和科研工作中，HPLC法将会继续发挥重要作用。
通过本文的了解，相信读者对于氨甲苯酸注射液相关物质和含量的HPLC法测定有了更深入的认识和理解。
在以后的工作和研究中，将更加重视药品质量的分析和控制，进一步推动医药行业的发展。
如何建立高效液相色谱法测定有关物质的方法
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t/min
1—1；2—中间体Ⅰ；3—中间体Ⅱ
图3 1与中间体的混合溶液色谱图
参考文献：
[1] 艾建国, 晋 展. 抗抑郁药Duloxetine Hydrochloride[J]. 药 学进展, 2003, 27(3): 188.
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中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007, 38(1)
XIE Mu-feng
(Shanghai Institute for Drug Control, Shanghai 200233)
ABSTRACT: How to establish a HPLC method for determination of related substances in drugs is discussed. The principles of establishment of the chromatographic conditions and some problems in the drawing the quality standard of drugs are exemplified.
中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2007, 38(1)
有关物质的HPLC方法建立
有关物质的HPLC方法建立有关物质特定物质中不是主要组成物，但与成份相关的物质。
有关物质的来源原料药合成过程中带入;制剂过程中产生;或是在贮藏、运输、使用过程中产生。
有关物质的计算方法杂质对照品法@加响应因子（即重量校正因子）计算的自身对照法、@不加响应因子计算的自身对照法@根据不同杂质采用不同方法等。
有关物质的计算方法定量检测和限度检测溶解度考察考察被测物在水、甲醇、乙腈、冰醋酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等几种常用溶剂中的溶解度，判断被测物极性强弱。
紫外光谱绘制考察被测物在水、甲醇、乙腈等常用溶剂的紫外吸收情况，一般选取最大吸收波长作为流动相选择时的检测波长。
几种被测物最大吸收波长不一致时，选取共同吸收较大的波长。
流动相的选择中性成分▪被测物为中性成分时，一般选择甲醇-水、乙腈-水、四氢呋喃-水三种系统。
乙腈-水系统由于粘度小，通常可以得到良好的柱效。
此外，乙腈的紫外末端吸收比甲醇小，在低波长处检测基线波动小，测定误差小。
▪被测物为极性较大的中性成分时，系统中甲醇或乙腈的比例可适当小些。
被测物为极性较小的中性成分时，可适当增大甲醇或乙腈的比例。
碱性成分▪向流动相中加入胺类扫尾剂。
常用三乙胺、二乙胺、乙二胺、正丁胺等。
▪加入反离子，常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠及十二烷基磺酸钠。
高碳数离子对试剂使保留时间过长，可更换低碳数的离子对试剂。
流动相的pH 一般为3-5。
酸性成分▪向流动相中加入少量弱酸，常用甲酸、醋酸。
适用于分离3≤pKa≤7的弱酸。
▪加入反离子，常用的离子对试剂为四丁基季胺盐及四丁基磷酸盐等。
流动相的pH一般为7-7.5。
流动相的要求▪被测物之间分离良好，分离度达到1.5以上。
主成分保留时间以10分钟为宜。
分析时间通常为主成分保留时间的2-3倍。
分析时间过长的可考虑采用剃度洗脱。
检测波长的确定▪以选定的流动相为溶剂，考察被测物的紫外吸收情况。
有DAD检测器的，考察主成分峰纯度，应达到98%以上。
实用高效液相色谱法的建立
液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
转载请注明出处。
色谱分离与在线检测技术已经成为当今分析化学的一门重要学科，而因其衍生出的相关产品也日益丰富。
对色谱工作者来说，在面对具体方法开发中如何获得适当的分离度则成为关注的焦点。
本文仅从网络上的资源收集简要介绍反相液相色谱法的建立思路。
一、 基本术语基本术语读者可跳过本部分内容，直接阅读实例讲解部分在评价色谱分离的品质时，通常用以下相关术语来反映色谱特征（如图1.）：图1. 典型色谱图1. 保留因子(k)：t t t k R −=(1) 用于反映化合物的色谱保留性质，跟化合物性质有密切关系。
如图1，设t R1 =3.65min, t 0 =1.20min, 则峰1的保留因子为：(3.65-1.20)/1.20=2.042. 拖尾因子(T f )液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
转载请注明出处。
aba f W W W T 2+=(2)图2. 典型拖尾峰在理想情况下，色谱峰为高斯型对称峰，其拖尾因子为1.0，但在实际情况中，由于化合物的二次保留等其他因素，色谱峰大多会呈现一定程度的拖尾。
如图2中，该色谱峰的拖尾因子可计算得：{(41.5-37.0)+(37.0-35.0)}/{2*(37.0-35.0)}=1.63.3. 理论塔板数（N ）液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
转载请注明出处。
图3. 峰高与峰宽的关系2(16Wt N R= (3) 或2(54.55.0W t N R= (4) 注意：在上式中W 为图3中的W b ，为基线峰宽(4σ)，W 0.5 为峰高一半处的峰宽W h (2.335σ), 并非峰宽的一半(2σ)。
设图1中峰1的基线峰宽为0.25min, 则塔板数为：16*(3.65/0.25)^2=34104. 分离因子(α)10212t t t t k k R R −−==α (5) 又称两个色谱峰的相对保留值。
实用高效液相色谱法的建立
实用高效液相色谱法的建立液相色谱方法开发（实例讲解）2010? 未经许可，不得复制。
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色谱分离与在线检测技术已经成为当今分析化学的一门重要学科，而因其衍生出的相关产品也日益丰富。
对色谱工作者来说，在面对具体方法开发中如何获得适当的分离度则成为关注的焦点。
本文仅从网络上的资源收集简要介绍反相液相色谱法的建立思路。
一、基本术语基本术语读者可跳过本部分内容，直接阅读实例讲解部分在评价色谱分离的品质时，通常用以下相关术语来反映色谱特征（如图1.）：图1. 典型色谱图1. 保留因子(k)：t t t k R ?=(1) 用于反映化合物的色谱保留性质，跟化合物性质有密切关系。
如图1，设t R1 =3.65min, t 0 =1.20min, 则峰1的保留因子为：(3.65-1.20)/1.20=2.042. 拖尾因子(T f )液相色谱方法开发（实例讲解）2010? 未经许可，不得复制。
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aba f W W W T 2+=(2)图2. 典型拖尾峰在理想情况下，色谱峰为高斯型对称峰，其拖尾因子为1.0，但在实际情况中，由于化合物的二次保留等其他因素，色谱峰大多会呈现一定程度的拖尾。
如图2中，该色谱峰的拖尾因子可计算得：{(41.5-37.0)+(37.0-35.0)}/{2*(37.0-35.0)}=1.63.3. 理论塔板数（N ）液相色谱方法开发（实例讲解）2010? 未经许可，不得复制。
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图3. 峰高与峰宽的关系2(16Wt N R= (3) 或2(54.55.0W t N R= (4) 注意：在上式中W 为图3中的W b ，为基线峰宽(4σ)，W 0.5 为峰高一半处的峰宽W h (2.335σ), 并非峰宽的一半(2σ)。
设图1中峰1的基线峰宽为0.25min, 则塔板数为：16*(3.65/0.25)^2=34104. 分离因子(α)10212t t t t k k R R ??==α (5) 又称两个色谱峰的相对保留值。
HPLC方法建立经验
一.背景我的研究课题是从发酵液中提取一种小分子抗生素，并得到其纯品。
在这个过程中，想用高效液相色谱帮助指导分离，最终开发出用于测定发酵液效价的方法。
要达到这个目的，首先要找到一种合适的分析方法，可以将目标组分与其它杂质分开，并优化到合适的保留时间和良好的峰型。
这其中有一个很大的困难：没有目标组分的纯品，不了解其结构。
在这种情况下，如何选着色谱柱？如何配比流动相？这一切都是摆在我这个新手面前的挑战。
希望此贴能给像我一样刚开始接触HPLC的战友一些经验。
-----------------------------------------------------------------------二.样品介绍我的目标成分（发酵液中的活性成分）是一种小分子抗生素，到目前为止对它有以下了解：1.这是一种小分子物质2.这种物质极性很强，不溶于绝大多数有机溶剂3.这种物质在酸性条件下带正电荷，可能呈碱性在进行高效液相分析之前，发酵液已经经过了预处理，并用大孔树脂、离子交换树脂等在生物显影的指导下进行了初步的分离纯化（事实上到这可能很多朋友都看出来了，这种物质在发酵液里，说明它溶于水的。
可以用离子交换，就是能电离，那么一定极性不低。
如果是行家，可能就不会像我傻乎乎的还用C18+甲醇水摸半个月条件了^-^ ）。
用于上样的样品组成应该不是特别复杂，推测只有一个活性成分，另外活性成分和杂质应该极性都较强。
------------------------------------------------------------------------三.用到的色谱柱和色谱仪1.某品牌C18柱，5μm，4.6×200mm2.极限C18-AQ，5μm，4.6×250mm（Ul timate柱试用体验）Agilent 1100 series，在线脱气机，手动进样器VWD检测器-------------------------------------------------------------------------四.曾经的思路我主修的专业和仪器分析相去甚远，也没有接触过HPLC，这次要完成这个任务，起初还是很盲目的。