无菌培养基灵敏度验证
培养基的灵敏度测试
培养基的灵敏度测试培养基的灵敏度测试是其质量控制的一个重要检测部分。
方法如下：1.用于菌数计数的半固体琼脂培养基促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培养基均应进行灵敏度检查（促菌生长检查）。
取预先制备好的琼脂培养基平皿3~5个，用表面涂布法每块平板表面接种30~100个试验菌，同时用已知质量保证的同型号培养基平皿3~5个（如较著名的如MERCK，DIFICOL产品）做对照试验，待培养基表面的菌液被琼脂培养基吸干或风干后，将培养皿倒置于培养箱的使用温度下培养48~72小时，（也可采用浇碟法进行）取出培养后的平皿点计菌落数。
样品培养基上的微生物数量应不得低于对照培养基上微生物生长数量的70%。
否则，需重新检查，或该培养基被视为不符合促生长要求。
2.用于控制菌检查的富集培养基的促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培养基均应进行灵敏度检查。
每100ml培养基内分别接入试验菌小于100cfu，每个菌种接种两瓶培养基，将接过种的培养基置于指定条件下培养。
应在16~18小时后可明显观察到培养基内有微生物生长，则证明此培养基合格。
原则上无论是采用脱水培养基还是按相关处方配制的培养基，一旦制成成品培养基，则应对每个配制批号培养基进行促菌生长（灵敏度检查）试验，以考察培养基的质量。
按脱水培养基的生产批号做灵敏度检查是基于培养基的灭菌程序已经经过验证。
如果实验室使用的是商购的成品培养基，供应商应随培养基提供相应批次的培养基质量检测报告，报告包括培养基的PH值、无菌检查结果和促菌生长（灵敏度）试验结果等项目。
建议在使用某一新的成品培养基（新供应商或新培养基品种）时，应至少考察三个不同批次的培养基质量，只有三批质量均合格方可使用该培养基。
微生物限度检查用成品培养基一旦初试确认合格后，可审查供应商的质检报告，而不必每批再作无菌检查和灵敏度检查，但半年应至少检查一次，以复核其质量。
用于无菌检查试验的每批培养基，均必须按规定进行灵敏度检查试验，此规定同样适用于实验室自行配制的培养基。
培养基质量检查方法
空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。
5．记录保存：
质检部保管5年。
6.相关操作规程
6.1．电热鼓风干燥箱操作规程
6.2．HWS-12型电热恒温水浴锅操作规程
6.3．生化培养箱操作规程
6.4．YX手提式压力蒸汽消毒器操作规程
6.5．净化工作台操作规程
7．相关记录
7.1.微生物检验用培养基性能试验记录
编制：
日期：
审批：
日期：
批准：
日期：
有限公司
文件编号
版号
A.0
微生物检验用培养基性能试验方法
页次
生效日期
2020/01/02
液，孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含孢子数小于100 cfu的孢子悬液。
4.3.3培养基接种
取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支,分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌菌片各2支,每支接种量为1ml(含菌10～100 cfu)，另1支不接种作为空白对照，30～35℃培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支,分别接种白色念珠菌、黑曲霉各2支,每支接种量为1ml(含菌10～100 cfu)，另1支不接种作为空白对照，23～28℃培养5天。逐日观察结果。
(5)白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98001〕
(6)黑曲霉(Aspergillus niger)〔CMCC(F)98003〕
4.3.2菌液制备
接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，23～28℃培养24～48小时；上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含菌数小于100 cfu（菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶
无菌检验方法验证
无菌检验方法验证无菌检查方法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法！至于无菌检查具体有哪些验证方法呢？下面就随店铺一起来了解下吧！无菌检验方法验证无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。
前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。
如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。
再验证，指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。
通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。
前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。
供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点，尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。
(一)具体的验证方法如下：1. 菌种的选择无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌 [CMCC(B)64 941]代表厌氧菌、大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌 [CMCC(F)98 003]代表霉菌。
2. 菌液的制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35 ℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23~28℃培养24~48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
培养基的灵敏度测试
培育基的灵敏度测试培育基的灵敏度测试是其质量掌握的一个重要检测部分。
方法如下：1.用于菌数计数的半固体琼脂培育基促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培育基均应进行灵敏度检查（促菌生长检查）。
取预先制备好的琼脂培育基平皿3~5个，用表面涂布法每块平板表面接种30~100个试验菌，同时用已知质量保证的同型号培育基平皿3~5个（如较闻名的如MERCK,DIFICoL产品）做对比试验，待培育基表面的菌液被琼脂培育基吸干或风干后，将培育皿倒置于培育箱的使用温度下培育48~72小时，（也可采纳浇碟法进行）取出培育后的平皿点计菌落数。
样品培育基上的微生物数量应不得低于对比培育基上微生物生长数量的70%。
否则，需重新检查，或该培育基被视为不符合促生长要求。
2.用于掌握菌检查的富集培育基的促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培育基均应进行灵敏度检查。
每100ml培育基内分别接入试验菌小于100cfu,每个菌种接种两瓶培育基，将接过种的培育基置于指定条件下培育。
应在16~18小时后可明显观看到培育基内有微生物生长，则证明此培育基合格。
原则上无论是采纳脱水培育基还是按相关处方配制的培育基，一旦制成成品培育基，则应对每个配制批号培育基进行促菌生长（灵敏度检查）试验，以考察培育基的质量。
按脱水培育基的生产批号做灵敏度检查是基于培育基的灭菌程序已经经过验证。
假如试验室使用的是商购的成品培育基,供应商应随培育基供应相应批次的培育基质量检测报告，报告包括培育基的PH值、无菌检查结果和促菌生长（灵敏度）试验结果等项目。
建议在使用某一新的成品培育基（新供应商或新培育基品种）时，应至少考察三个不同批次的培育基质量，只有三批质量均合格方可使用该培育基。
微生物限度检查用成品培育基一旦初试确认合格后，可审查供应商的质检报告，而不必每批再作无菌检查和灵敏度检查，但半年应至少检查一次，以亚核其质量。
用于无菌检查试验的每批培育基，均必需按规定进行灵敏度检查试验，此规定同样适用于试验室自行配制的培育基。
培养基灵敏度检验记录
空 （白 不对 接 种）
白色念珠 菌
黑曲霉
空白对照 （不接种）
1
2
3
4
备注: 培5 养结 果阳性用“+”
培养皿编号 24H菌落数 48测试
1
2
3
结果判定(Result):
检 测/
复核/日 期:
生效日期：2016年05月18日
2.2
取每管装量9ml的TSB培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空 白对照，培养5天，逐日观察结果并记录.
3. 培养情况
培养仪器 培养箱编号
生化培养箱
校验有效期至
培养温度
30℃～35℃
23℃～28℃
天数
菌种 金黄色葡萄球 菌
铜绿假单胞 菌
枯草芽孢杆 菌
生孢梭 菌
KANGGU
嘉兴康谷医用材料有限公司
产品描述
培养基灵敏度检查记录
批号
QMR-098-00
数量
生产商
检测依据
2010版中国药典
检测日期
1. 检金测黄用色菌葡种萄球 菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌 生孢梭菌
白色念珠菌
黑曲霉
2. 程序
2.1
取每管装量为12ml的TSB培养基9支，分别接种小于100cfu 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢 杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天，逐日观察结果并记录.
药品无菌检查法——培养基灵敏度检查法
药品无菌检查法培养基灵敏度检查法1•菌种(1)藤黄微球菌(Micrococcus Luteus)[CMCC(B)28001](2)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941](3)白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]2•操作(1)取藤黄微球菌的营养琼脂斜面和白色念珠菌的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物,分别用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液；将生孢梭菌不含琼脂的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物，吸入无菌离心管，离心，弃去上清液, 菌体用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液。
分别取上述菌悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至与细菌浊度标准管相同的浓度，然后作10倍系列稀释，制成1ml中含10~ 100个菌并计数。
(2)将藤黄微球菌、生孢梭菌的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物，白色念珠菌的真菌培养基的新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液作10倍系列稀释,制成1ml中含10~100个菌并计数。
将藤黄微球菌的上述(1)或(2)的稀释菌液各1ml,分别接种至每管装量为9ml的需气菌、厌气菌培养基3管，生孢梭菌的上述(1)或(2)的稀释菌液各1ml,分别接种至每管装量为12ml的需气菌、厌气菌培养基3管，白色念珠菌的上述(1)或(2)的稀释菌液各1ml,接种至每管装量为9ml的真菌培养基3管,以未接种的培养基作对照，按规定的温度培养5天并逐日记录结果。
3.结果判定以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵敏度检查符合要求。
对照用菌液1.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌液取金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内, 在30〜35C培养16〜18小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10〜100个菌。
2.生孢梭菌(Clostridium sporogeneS菌液取生孢梭菌［CMCC(B)64941］的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳，接种至相同培养基内，在30~35C培养18〜24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10〜100个菌。
培养基灵敏度试验
计数培养基适用性检查记录
环境温度
C 湿度
%
仪器型号及编号： 立式灭菌器
型号：LMQ.R 3260B 编号：H085
霉菌培养箱 型号：MJ-160B-Z 编号:
电热恒温干燥箱 型号：202-3AB 编号：H001 菌液制备： 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，
置30~35C 培养24~48小时后，用0.9%无菌氯化
钠溶液制成每1ml 含菌数为50~100cfu 的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养
若被检培养基上的平均菌落数与对照培养基上的平均菌落数相比大于
70%,且菌落形态大小应与
对照培养基上的菌落一致，判该培养基适用性检查符合规定。
结论：
复核人:
基上，置 20~25 C 培养5~7天加入3~5ml 含0.05% 孢子洗脱。
然后，吸出孢子悬液至无菌试管中，用含 溶液制成每
1ml 含孢子数50~100cfu 的孢子悬液。
阳性对照菌液：
白色念珠菌[CMCC (F ) 98 001] 编号： 检查方法：
取5个无菌平皿，吸取白色念珠菌、黑曲霉菌各 种菌作为空白对照， 立即倾注对照玫瑰红钠琼脂培养基 同时，用被检培养基同法操作。
(ml/ml )聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将 0.05% ( ml/ml )聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠 黑
曲霉[CMCC(F)98 003] 编号：
检验人:。
培养基灵敏度及适用性检查操作规程
1. 目的：通过培养基适用性检查，确保购买的培养基符合实验要求。
2. 范围：本规程适用于技术质量部实验员对培养基适用性的检查。
3. 职责：质量部实验员负责执行此规程。
4. 内容：4.1 检验依据：《中华人民共和国药典》2015版4.2 试验用具：烧杯、三角瓶、酒精灯、接种环、平皿、试管、吸管、移液枪、滴管、电子天平、电热恒温培养箱、生化培养箱或恒温恒湿培养箱、单人净化工作台、高压蒸汽灭菌器、微生物限度仪、漩涡混合器、试验菌种、检查用培养基等。
4.3 无菌培养基适用性检查：本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。
4.3.1 培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基（培养基的配制按《培养基配制操作规程》配制）。
4.3.2 稀释液、冲洗液及其制备方法稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
a) 0.1%无菌蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调节pH值至7.1±0.2，分装，灭菌。
b) pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g，无水磷酸氢二钠5.77g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.00g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。
c) 根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液（如0.9%无菌氯化钠溶液）。
如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。
4.3.3 无菌性检查：每批培养基随机取不少于5支（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。
4.3.4 灵敏度检查4.3.4.1 菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ）〔CMCC（B）10 104〕枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F）98 001〕黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC（F）98 003〕4.3.4.2 菌液制备a) 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时；b) 接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养24～48小时，上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。
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××公司
无菌检查用培养基适用性验证资料
文件编号：YZ-GC -004
1.验证目的：为证明硫乙醇酸盐流体培养基、营养肉汤、改良马丁培养基适合于细菌，真菌的无菌检查，特制定本验证方案。
2.参照标准：2005版中国药典二部附录XI H无菌检查法。
3.验证项目：
硫乙醇酸盐流体培养基、营养肉汤、改良马丁培养基灵敏度检查。
4.验证小组
4.试验材料：
4.1. 被验证培养基：
品名：硫乙醇酸盐流体培养基
规格：批号：生产厂家：
品名：营养肉汤培养基
规格：批号：生产厂家：
品名：改良马丁培养基
规格：批号：生产厂家：
4.2. 仪器设备：
4.2.1. YM50立式压力蒸汽灭菌器
4.2.2. SW-CJ-2F双人净化工作台
4.2.3. JC101型电热鼓风干燥箱
4.2.4.JY-B型生化培养箱(23～28℃)
4.2.
5.PHX-DHS-40x50恒温培养箱(35～37℃)
4.3. 稀释剂：
0.9%无菌氯化钠溶液
4.4. 验证用培养基：
4.5. 验证用菌株：
5.菌液制备：
5.1.取经培养18~24小时的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤新鲜培养物1ml加入到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至小于100cfu∕ml的菌悬液备用。
5.2.取经培养24~48小时的白色念珠菌的改良马丁培养物1ml加入到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至小于100cfu∕ml的菌悬液备用。
6.菌液计数：（每种菌液接种2个平皿）
分别取上述制备的金黄色葡萄糖球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌各1ml加入培养皿，每种菌液平行做2皿，注入不超过45℃营养琼脂培养基15~20ml，置30～35℃培养箱培养二天，取上项制备的白色念珠菌菌液1ml加入培养皿，平行做2皿，注入不超过45℃的玫瑰红钠琼脂培养基约15~20ml，置23～28℃培养箱培养三天。
7.无菌培养基的无菌性检查
7.1培养基的配制
硫乙醇酸盐流体培养基的配制：取硫乙醇酸盐流体培养基29.25g，加1L蒸馏水，加热煮沸使其完全溶解，摇匀分装到试管中，每只试管装量12ml。
营养肉汤培养基的配制：取硫乙醇酸盐流体培养基18g，加1L蒸馏水，加热搅拌使其完全溶解，摇匀分装到试管中，每只试管装量12ml。
改良马丁培养基的配制：取改良马丁培养基28.5g，加1L蒸馏水，加热搅拌使其完全
溶解，摇匀分装到到试管中，每只试管装量9ml。
7.2培养基的培养
硫乙醇酸盐流体培养基和营养肉汤培养基置于30~35℃的培养箱中培养14天；改良马丁培养基置于23~28℃的培养箱中培养14天℃，每天观察培养基浑浊情况。
表1培养基的无菌性检查表
注：“+”为生长，“-”为不生长
7.培养基灵敏度检查
7.1.硫乙醇酸盐流体培养基等灵敏度检查至少应进行3次独立的平行试验。
7.2培养基的配制
硫乙醇酸盐流体培养基的配制：取硫乙醇酸盐流体培养基29.25g，加1L蒸馏水，加热煮沸使其完全溶解，摇匀分装到试管中，每只试管装量12ml。
营养肉汤培养基的配制：取硫乙醇酸盐流体培养基18g，加1L蒸馏水，加热搅拌使其完全溶解，摇匀分装到试管中，每只试管装量12ml。
改良马丁培养基的配制：取改良马丁培养基28.5g，加1L蒸馏水，加热搅拌使其完全溶解，摇匀分装到到试管中，每只试管装量9ml。
7.3.培养基接种
取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu/ml的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu/ml的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。
逐日观察结果。
7.4.结果判断
空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。
表2培养基灵敏度检查表
注：“+”为生长，“-”为不生长
8 验证周期：同种培养基的不同批号，不同生产厂家均应进行适用性验证9结论：
无菌检查用培养基适用性验证报告书
无菌培养基的适用性检查记录
培养基：1.硫乙醇酸盐流体培养基批号：_______________ 检验日期：
2.硫乙醇酸盐流体培养基批号：_______________ 检验日期：
3.改良马丁培养基批号：_______________ 检验日期：
一、培养基的无菌性检查
培养温度：硫乙醇酸盐流体培养基℃改良马丁培养基℃
注：“+”为生长，“-”为不生长
二、培养基的灵敏度检查
1.菌液制备：
（1）金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003] 第___代0.9%无菌NaCl溶液至含菌量 CFU/ml （2）枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501] 第代0.9%无菌NaCl溶液至含菌量 CFU/ml （3）铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10104] 第___代0.9%无菌NaCl溶液至含菌量 CFU/ml （4）白色念珠菌[CMCC(F)98001] 第代0.9%无菌NaCl溶液至含菌量 CFU/ml （5）黑曲霉[CMCC(F)98003] 第代0.9%无菌NaCl溶液至含菌量 CFU/ml
2. 检查结果
细菌培养温度____℃ 3天霉菌及酵母菌培养温度____℃ 5天
注：“+”为生长，“-”为不生长
三、结论：
本品按《中华人民共和国药典2005年版（二部）》附录无菌检查法培养基的适用性检查，结果_______________。
检查人/日期：复核人/日期：。