结核病的实验室诊断方法及评价
结核病的实验室诊断方法及评价
耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，
1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，
2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。
耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。
1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。
2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。
3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。多种以PCR 为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐
药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。
结核病的实验室诊断方法及评价
(一)标本的采集
1．痰标本采集新发病人应在抗结核药物治疗前留取痰标本。治疗中的病人应停药2～3天后留取痰标本。病人于清晨漱口后，留取3～5ml合格的痰标本(深咳后吐出的黏液痰、脓样痰、干酪样痰、褐色血样痰或含少量新鲜血液的血痰)，遇到唾液或口永，应重新留取。至少采集3次。WHO推荐的采集容器为国际通用的螺旋盖痰瓶、可密封塑料盒或蜡纸盒。痰容器上应标明病人姓名、编号、检查项目和容器序号。
2.胃冲洗液幼儿不会吐痰，常将痰液咽下，故可用清晨空腹胃洗出液，直接涂片染色或进行结核杆菌培养，连续作三次可提高培养阳性率。胃液结核杆菌检出率以浸润性肺结核和干酪性肺炎为最高，其次为粟粒型肺结核。胃液、痰液或其他分泌物中结核杆菌检查，有时对诊断有决定性意义。
3.支气管肺泡灌洗和支气管冲洗支气管肺泡灌洗和支气管冲洗液至少5ml并以无菌容器盛装，以用于检验。
4.病灶组织或干酷块等先用组织研磨器磨碎后再行涂片。
5．尿液留全量夜尿，静置4或5小时后，弃上清液，取沉淀部分尿液10ml，3000rpm．离心30min，取沉渣涂片。
6.体液或脑脊液无菌操作收集体液或脑脊液，放置冰箱或室温24h，待薄膜形成后
涂片。也可将脑脊液离心沉淀，3000rpm，离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片。
(二)试验方法及评价
1．细菌学诊断方法
(1)涂片检查法：包括直接涂片法、荧光染色涂片法和集菌涂片珐。痰液、脓液可直接涂片。用萋尔-尼尔逊染色法(Ziehi-Neelsen)简称萋
尼染色法，若镜检找到抗酸性杆菌，则可能是结核杆菌。此法简便、快速，技术要求低，无需特殊仪器且能当天出结果，十分经济，符合我国国情。但其敏感性差，一般需5000～10000条菌／ml才能得到阳性结果；特异性差，各种分枝杆菌均可着色，要进一步鉴定是否为结核分枝杆菌；不能区分死菌与活菌。
【萋尼氏染色法】
①涂片：取经95％乙醇擦拭脱脂过的干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻璃片(玻片不能重复使用)，于玻片背面的左端1／3处以蓝色或黑色记号笔(玻璃铅笔)编号。用接种环挑取痰标本的脓样，干酪样部分约0.05～0.1ml，于玻片正面的右侧2／3处，均匀涂沫成10mm×20mm的卵圆形痰膜，自然干燥后待检。
②试剂：
⊙碱性复红乙醇染色储存液：
碱性复红液：8克碱性复红溶于95％乙醇100ml中。
5％石碳酸水溶液：5克石碳酸溶于100ml蒸馏水中。
③染色步骤；
【荧光染色法】
①试剂：
染色剂z金胺“O”0．1g溶于95％乙醇10ml，加5％石炭酸90ml。
脱色剂：3％盐酸乙醇液。
复染剂：0.5％高锰酸钾水溶液。
②染色步骤：
③镜检与报告方式：在暗色背景下，抗酸杆菌呈黄绿色或橙色荧光。必须用40×物镜确认菌体形态，应具有萋-纳氏抗酸染色镜经检验后，方可应用荧光染色法，注意勿过读或漏判。荧光染色后涂片应在24h内检查，遇需隔夜时，置4℃保存，次日完成镜检。
物镜20×检查结果按下列标准报告：
阴性(-)：0条／50视野
可疑(+)；1～3条／50视野
阳性(1+)：l1～99条／50视野
(2+)：1～9条／每视野
(3+)：10～99条／每视野
(4+)：≥100条／每视野
物镜40×检查细菌细胞形态。
(2)常规培养法：结核分枝杆菌培养阳性是确诊结核病的“金标准”。改良罗氏培养法是目前较为成熟的分离培养方法，根据结核杆菌生长缓慢，菌落干燥、颗粒状、乳酪色像菜花状，菌体染色抗酸性强等特点判断是否为结核杆菌。如菌落、菌体染色都不典型,则可能为非典型分枝杆菌，应进一步作鉴别试验。此法培养时间长，不适于快速检测结核杆菌，且
阳性率也只有30％～40％，使大量结核病人漏诊或误诊。同时各种分枝杆菌均可生长，也需进一步鉴定是否为结核分枝杆菌。
⊙培养结果报告方式：
抗酸杆菌培养阴性：斜面无菌落生长。
抗酸杆菌培养阳性(1+)：菌落生长占斜面面积的1／4。
抗酸杆菌培养阳性(2+)：菌落生长占斜面面积的1／2。
抗酸杆菌培养阳性(3+)：菌落生长占斜面面积的3／4。
抗酸杆菌培养阳性(4+)：菌落生长布满全斜面。
抗酸杆菌培养阴性应以“(培养阴性)”报告。
菌落生长不足以斜面面积1／4时，实报菌落数。
(3)快速培养法：①BactecMGIT960分枝杆菌快速培养、药敏检测系统的基本原理是，其所使用的培养瓶底部含有包被于树脂上的荧光显示剂，由于该显示剂为氧抑制性，当分枝杆菌生长使氧消耗后，荧光显示剂被激活而发出荧光。检测系统每隔60分钟连续测定培养管内荧光强度，来判断管内分枝杆菌生长情况。②BacTALERT3D培养系统：是另一类分枝杆菌快速培养、药敏检测系统，也可用于普通细菌的培养。其原理是所使用的培养瓶底部，有颜色感应器，当分枝杆菌在瓶中生长，有CO2产生时，颜色感应器由绿色变为黄色。系统自动连续检测数据输入计算机，根据计算结果自动显示有无分枝杆菌生长。
此法无放射性，显著缩短培养时间，且操作简便、自动化强，还可进行快速菌型鉴定。但液体培养基中不能观察菌落形态，仪器与试剂价格较贵。
(4)液体变色培养基(MBRedox系统)：该系统由改良米氏7H9培养基、促生长添加剂(血清、复合维生素等)、抗生素混合物PACT(多黏菌素B、两性霉素B、茶啶酸、甲氧苄胺嘧啶)和氧化还原显示器(即无色四鎓盐)组成。促生长添加剂可加速分枝杆菌的生长和甲臜(formazan)的形成。其原理是当分枝杆菌在此培养基生长时，通过氧化还原系统，使培养基中的无色四唑鎓盐还原成粉红色、红色或紫色甲臜。由于甲臜不溶于水．以颗粒形式分泌到细胞表面，分枝杆菌菌落就变成了用肉眼可见的红或紫色，取培养液涂片，染色镜检。此法操作简便，培养时间短，肉眼观察结果，无需特殊仪器，无放射性污染，还可用于分枝杆菌的药敏试验和菌种鉴定。但阳性率还不够高，结果观察存在主观性。
(5)噬菌体裂解试验：由于耻垢分枝杆菌噬菌体是一种DNA病毒，能特异感染相应的活的分枝杆菌，并在菌体内迅速增殖?裂解菌体，释放出的子代噬菌体，又可感染随后加入的指示细胞(也是一种分枝杆菌)，并使指示细胞裂解，在培养平板上出现噬菌斑。根据噬菌斑的有无，即可确定待检标本中是否含有相应的活的分枝杆菌。此方法简便、快速，不需特殊仪器；特异性和灵敏度较高；
检测的是活菌，但传染性小；可相对定量可测定药物敏感性。
其主要步骤为：①标本前处理：同常规培养法(若用菌株则勿需此步)，经前处理后的标本于Middlebrook7H9培养基中(含有改良的OADC营养添加剂)37℃温育24h。②噬菌体浸染：取0.5ml上述处理后的样品(或菌液)，加入0．1ml分枝杆菌噬菌体，震荡混匀，37℃孵育1b。③中止浸染：于上述浸染液中加人0.1ml杀毒剂，彻底混匀，室温作用5min，加入5mlMiddlebrook7H9培养液和1ml指示细胞。
④浇注平皿和培养：将上述混合培养液与5ml溶化的琼脂共同倾注于无菌平皿中，旋转混匀，静置成形后，于37℃培养18～24h。每次检测同时设空白对照、嘴菌体对照、杀毒剂对照、指示细胞对照和阴性
及阳性对照。⑤结果观察：在各对照组结果正确的条件下，观察试验样品结果。阳性结果可见有大小和数量不等的噬菌斑出现(彩图2)，或许多嘴菌斑相互融合成透明状；阴性结果可见指示细胞在琼脂培养基中均匀生长．无噬菌斑出现。
2．常用的免疫学诊断方法
(1)酶联免疫吸附试验(enzymeLinkedimmunosorbentas-say，ELISA)：ELISA是结核抗体。
研究和应用报道最多的实验方法。
①ELISA间接法：其基本原理是吸附在固相载体上的结核抗原可与待检标本中的结核抗体结合，形成抗原-抗体复合物，后者与酶标记的抗人IgG结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，酶使底物显色。颜色的深浅与待检标本中的结核抗体含量成正比。本法主要用于测定结核抗体。
②双抗体夹心ELISA：其原理是吸附在固相载体上的结核抗体可与待检标本中的结核抗原结合，形成抗体-抗原复合物，后者与酶标记的结核抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，酶使底物显色，颜色的深浅与待检标本中的结核抗原含量成正比。本怯主要用于特异性结核抗原的测定。
③抗原竞争ELISA：其原理是吸附在固相载体上的结核抗体，可与标本中的待检结核抗原及同时加入的酶标的结核抗原发生竞争结合，形成抗体抗原和抗体-酶标抗原两种复合物，后者可使酶作用的底物显色，颜色的深浅与待检标本中结核抗原的含量成反比。本法主要用于小分子抗原的测定。
(2)生物素-亲和素-酶免疫测定法(biotin-avidin-system，BAS-酶免法)：基本原理类似于ELISA，只是用BAS来标记酶，而不是用抗体或抗原标记酶。BAS有三种基本测定方法，分别称ABC法(avindin-biotin-complex)。BA法(biotin-avidin)和BAB法(bridged-avdin-biotintechnique)。前二种方法主要用于结核抗体或抗原的测定，BAB法主要用于免疫组化和免疫病理中，操作较为繁琐。
(3)斑点酶免疫渗透试验(dotimmunoenzymefiltrationassav，
DIEFA)：是在酶免疫结合试验基础上发展起来的一种固相标记免疫测定技术。其原理是利用微孔膜的可滤过性，使反应溶液自膜上迅速通过，从而完成抗原、抗体的快速测定。本法包被所需的抗原量少，预先包被、封闭、干燥后可长期保存备用。敏感性和特异性与ELISA法相当。但操作更简单，反应更快速，价格较便宜，结果只需肉服观察，无需特殊仪器，重复性好。
(4)斑点免疫金结合试验
①斑点免疫金渗透试验(dotimmunogoldfiltrationassay，DIGFA)：基本步骤为：
本法用胶体金标记抗人IgG，由于胶体金本身呈红色，不需再加显色底物，阳性反应即为红色斑点。比ELlSA法减少了加入底物和终止液的步骤，操做更为简便快速；本法在可滤过性膜上进行抗原、抗体反应，反应时间仅为3～5min；金标试剂比酶标试剂稳定，室温保存时间较长。
②斑点免疫层析试验(dotimmunochromatographicassavDICA)：DICA的反应物与DIGFA基本相同，反应物固定在一狭长的微孔膜上，制成单一试剂形式，反应利用膜的毛细管作用进行。微孔膜A端含有干燥的金标抗人IgG，中段点有特异性结核抗原，末段点有人IgG。仅需少量待检血清(或其他体液标本)滴在A端，并加人数滴稀释液，使膜中的金标抗人IgG溶解，若待检标本中含有结核抗体特异性IgG即与金标抗人I90结合形成复合物，并随液体向前方移动，至膜的中段时即与结核抗原结合，形成抗原抗体金标抗体复合物，出现红色条带为阳性结果。如待检样品中不含结核抗体，则在测试区不出现条带。液体继续往前移动，并在末段的试剂质控区与正常人IgG结合，形成Igo 金标抗人IgG复合物，出现红色条带，证明试剂反应系统正常。DICA 测定方法简便、快速，在结核抗体检测中受到广泛关注。
(5)免疫印迹技术(immunoblotting或Westernblot)；是高分离SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与高敏感性酶联反应相结合的一种检测技术。包括SDS-PAGE、蛋白质转印和固相酶免疫测定三步。检测原理是蛋白质样品经过SDS-PAGE分离后，通过转移电
泳至固相膜上，并保持其原有的物质类型和生物学活性不变，然后利用抗原-抗体特异性反应进行检测。通过该技术可以了解抗原抗体反应的数目、被识别的抗原电泳迁移率以及抗原抗体反应的强度，从而有助于抗体联合检测和新抗原鉴定的研究。目前，此技术已转化为产品，只进行后半步酶联免疫反应，即可检出待检标本中所含的多种结核杆菌多肤抗原成分的特异性抗体。此法敏感性和特异性很高，是很有发展前景的测定技术，已广泛用于科研，在临床诊断活动性结核病人也有很高的价值。
3．分子生物学诊断
(1)核酸探针(nuclearacidprobe)：分枝杆菌的核酸探针有四种主要类型：cDNA或rRNA探针、全染色体DNA探针、克隆的DNA或PCR扩增片段探针及寡核甘酸探针等。此法特异性强，可以鉴定不同种群的分枝杆菌，有助于肺结核的诊断和鉴别诊断，但其敏感性低，价格昂贵，不适用于日常临床诊断工作。
(2)聚合酶链反应(poLymerasechainreation，PCR)：主要根据DNA复制原理，其过程类似于体内细胞分裂时DNA半保留复制过程。其扩增的每一循环，包括模板变性、引物退火及延伸三个步骤。PCR 技术关键是设计一对特异性DNA引物，该引物所引导的DNA 扩增序列，应是结核杆菌独有的，且是结核杆菌的保守序列，这样才能保证检测结果的特异性。PCR的灵敏度高，可达1个结核杆菌。能早期诊断结核菌血症，在结核杆菌感染的早期，特别是在结核病灶通过血源性外传播时，外周血中存在极少量的结核杆菌时，通过PCR 就可以检测到结核杆菌。检测时间短，仅需2～4h。目前存在的最大问题是假阳性率和假阴性率较高，造成假阳性的最主要原因是实验室污染。
(3)DNA序列测定：不仅能够用于突变的检测，而且能够确定突变的部位与性质，因此是检测基因突变的最理想方法，也是判断突变的“金标准”和评价其他方法的参考方法。DNA序列测定有多种方法．但PCR-DNA序列测定简便、快速，是最常用的测定方法，已在结核分枝杆菌耐药基因研究中，得到广泛应用。随着DNA测序技术的自动化、规模化、商品化，以及成本的降低，为今后分枝杆菌基因序
列的信息研究以及分枝杆菌菌种鉴定提供了便利条件。
(4)基因芯片技术：又称DNA芯片技术，是近年发展起来的进行大规模遗传多态性检测的新方法，是目前分子生物学最前沿的方法。原理是将多种探针分子固定于支持物上，与标记样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，获取样品分子的数量和序列信息。测定耐药性的主要步骤为：①制备测定耐药性的基因芯片；②获待测样品DNA并进行PCR扩增和标记：③扩增产物与点样制备的芯片进行杂交、显色；④扫描检测、数据处理、结果判定。该法基于核酸杂交的技术，同时将大量探针固定于支持物上，所以一次可以对样品大量序列进行检测和分析，它有技术操作简单、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广等特点。但基因芯片的制备比较复杂，成本较高，仪器设备也较贵，不适用于临床标本的检测。目前，基因芯片技术已在结核分枝杆菌的基因分型与菌种鉴定、耐药性测定及基因组比较分析研究中得以应用，其中尤以耐药性测定最为引人关注。
细胞因子检测
主要包括酶联免疫吸附法（ELISA）和固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）两种。
结核分枝杆菌感染人体后，刺激免疫细胞产生保护性细胞因子，其中最主要的是IFN-γ。通过检测IFN-γ浓度可对结核分枝杆菌潜伏感染及结核病的诊断提供参考。目前主要应用于结核性浆膜炎的诊断。
细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT计算机分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。
流式细胞术用于结核分枝杆菌药物敏感性试验的原理和步骤
FCM用于结核分枝杆菌药物敏感性试验所采用的细胞染色法是乙酰乙酸荧光素（FDA）染色法。FDA是一种非极性非荧光物质，它能通过主动转运和被动扩散的方式穿透分枝杆菌的细胞壁和细胞膜。活的分枝杆菌胞质中非特异性酯酶能够迅速水解外来的FDA成为游离荧光素，游离荧光素在菌体内蓄积易被流式细胞仪测定；而死菌的活性酯酶减少，不能或仅能水解少量的FDA，产生很少的游离荧光素。FCM通过测量荧光信号的改变，判定活菌或死菌，从而用于结核分枝杆菌药物敏感性试验。
将一定量的结核分枝杆菌菌悬液加入到一定浓度抗结核药物的液体培养基，37℃培养24h （或48h）；同样数量的结核分枝杆菌菌悬液加入到不含抗结核药物的液体培养基中，37℃培养24h（或48h）作为质控；取上述菌悬液加入到混有FDA的PH7.4的PBS中，37℃静置30min后，加入到FCM的样品管进行检测，利用FCM随机软件对每min细胞数（标记的结核分枝杆菌数）和平均荧光强度（标记的结核分枝杆菌荧光强度）两项参数进行分析，从而对结果进行统计分析。
蛋白芯片在结核分枝杆菌研究中的应用
现有的结核蛋白芯片是以微孔滤膜为载体，将结核分枝杆菌的特异性抗原如阿拉伯甘露糖（LAM），38Kda蛋白和16Kda蛋白等固定在其表面，利用微孔滤膜的渗透、浓缩、凝聚作用，捕捉被检样品中的特异性抗体，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，再以免疫金作为标记物而直接在膜上显色形成紫红色的斑点。显色后通过芯片识别系统进行分析，判定结果用于该类细菌感染的临床辅助诊断。其特点是可对多种结核分枝杆菌抗原之抗体进行同时筛查，方便、快速而又有较高的特异性与敏感性，对于痰涂阴性、无痰的、肺外结核病人的检出，更显示其优越性。
噬菌体生物扩增法检测
Bactec TB960分枝杆菌全自动快速培养系统
◆1996 年美国Becton Dickinson 公司研制。
◆原理：用硅树脂将荧光底物包埋在专用的7H9 培养管底部，当
检测标本经前处理接种于该培养管后，如有分枝杆菌生长时，氧分子被消耗，培养基的氧化还原电势降低，激发底物产生荧光，经扫描自动显示以生产指数GI 表示的测定结果，连续观测，生长指数升高到一定程度时报告结果，一般需1-42天。
◆优点：简便、快速，可进行药敏试验和初步菌种鉴定，无放射性污染。
◆缺点：仪器价格昂贵；需专门进口专利液体培养基，费用较高。
◆用于分枝杆菌培养，4种一线药物药敏试验和初步菌种鉴定。
◆BacT/Alert 3D 全自动快速结核分枝杆菌培养检测系统
◆是生物梅里埃公司的产品。原理是当检测标本经前处理接种于专用的7H9 培养管后，如有分枝杆菌生长时，分枝杆菌生长过程中代谢产生CO2，导致pH 值改变，传感器颜色从绿色变为黄色，仪器每10 分钟自动连续地检测、报告结果。
◆优点：简便、快速，既能用于分枝杆菌培养，也可用于普通细菌培养，可进行药敏试验和初步菌种鉴定，无放射性污染。
◆缺点：仪器价格昂贵；需专门进口专利液体培养基，费用较高。
结核分枝杆菌(MTB)耐药突变基因检测试剂盒
技术先进性
◆
从分子水平进行病原体的检测，代表了病原体检测的发展方向。
◆将PCR技术的高灵敏度, 反向斑点杂交技术的高特异性和膜芯片技术的高通量三种成熟技术的优势有效结合，使产品更加先进。
◆国内第一个覆盖四个一线抗结核药物耐受性检测的快速基因诊断产品。
◆产品特点
◆可直接用痰样进行检测，无需培养。
◆检测通量大：一次性检测对四种一线抗结核药物的耐受性，
◆检测时间短：8h内获得检测结果。
◆检测基因突变的结果准确，与测序结果符合率达99%以上。
临床意义
◆提供结核病人的耐药信息，指导临床医生合理用药，保证治疗效果及减少耐药菌株的扩散◆极大缩短耐药检测的时间（传统的药敏培养大约需要6周时间），有利于结核病的及时预防和治疗
◆结果准确可靠。从MTB耐药基因的突变来检测其耐药性，避免了临床药敏培养法中常见的假阴性
结核T细胞检测,开单科室都在这
结核T细胞检测，开单科室都在这 结核病是由分枝杆菌感染引起的一种慢性传染性疾病。结核分枝杆菌主要通过空气传播，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最常见。结核病患者常见发热，盗汗，疲惫乏力，精神萎靡，体重减轻，食欲不振以及咳嗽，咯血（肺结核）等临床症状。 近年来，检验医学得到了飞速发展，许多基础医学领域的成果通过检验医学的桥梁成功转化到了临床应用工作中，结核病实验室的诊断新技术也不断涌现，作为结核病免疫学诊断的T细胞检测也得到了广泛应用。 细胞免疫是结核菌感染后机体的主要免疫形式。人体内的T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细胞，结核病患者外周静脉血中存在结核分枝杆菌特异的效应T细胞，这些T细胞在体外受到结核分枝杆菌特异性抗原刺激后可分泌细胞因子Y-干扰素，利用酶联免疫实验检测并定量分析Y-干扰素的浓度，判断是否存在结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应，进而判断患者结核分支杆菌感染情况。 T细胞可用于以下几个方面： 1结核潜伏感染检测； 2活动性结核病诊断； 3密切接触者及高危人群筛查（医护人员，HIV患者，风湿患者）； 4菌阴肺结核，肺外结核，儿童结核辅助诊断； 5结核病疫情监测和流行病学调查； 6疑似结核病的鉴别.
TB-IGRA对临床诊断的意义主要集中在以下几个方面： 1.大幅提高结核感染的检出能力，可用于肺结核等结核感染的辅助诊断，特别是对于痰涂阴性肺结核的辅助诊断； 2.使用高特异性抗原，可用于非结核杆菌肺部感染、肺炎等疑似病例与肺结核的鉴别诊断； 3.使用全血进行测试，克服痰涂、菌培和分子检测肺外结核取样难的问题，可有效检出肺外结核； 4.检测结果定量分析，可用于抗结核治疗效果评估以及潜伏性结核感染的监控； 5.可用于免疫抑制剂治疗、生物制品治疗、血液透析患者等临床治疗前后, 以及两周以上不明原因发热病人的结核感染排查。 TB-IGRA在不同临床科室的具体应用： 1.感染科/呼吸科 ①用于不明原因发热病人的结核排筛； ②肺部疾病鉴别诊断：非结核杆菌肺部感染、肺癌、肺炎等疑似病例与肺结核的鉴别诊断； ③抗炎治疗效果不佳的患者，胸痛怀疑结核性胸膜炎患者的结核排查； ④HIV患者的结核感染筛查。 2.结核科 ①肺结核与肺外结核的辅助诊断，尤其是"菌阴"肺结核患者的辅助诊断：涂片阴性，但咳嗽、咳痰等症状大于2周的患者结核感染筛查；咳血、肺部阴影患者
肺结核实验室诊断方法创新研究
肺结核实验室诊断方法创新研究 肺结核是一种常见的传染病，严重影响了人们的健康和生活质量。早期诊断和治疗对 于疾病的控制和防治具有重要意义。为了提高肺结核的诊断水平，不断创新和发展实验室 诊断方法是非常必要的。本文主要介绍肺结核实验室诊断方法创新研究的相关内容。 一、传统实验室诊断方法 1.痰涂片法：痰涂片法是一种传统的肺结核诊断方法，其原理是通过显微镜观察痰样 本中的结核分枝杆菌，从而诊断肺结核。但是，该方法的缺点是需要高度技术人员，且存 在较高的漏诊率和误诊率。 2.结核菌抗原检测：结核菌抗原检测是通过检测患者血清或痰液中的结核菌抗原来诊 断肺结核，其优点是快速、简单、易于操作，但其准确性有待提高。 3.结核菌DNA检测：结核菌DNA检测是通过PCR技术检测痰中的结核菌DNA，因其快速、敏感、特异性高等优点，已经成为肺结核的重要检测手段之一，但该方法的局限性是对操 作人员有较高的技术要求。 以上三种方法都有一定的缺陷，如漏诊、误诊等，所以需要不断创新和发展实验室诊 断方法。 1.核酸纳米探针技术：该技术是基于纳米技术和核酸技术的结合，能够检测低浓度的 结核分枝杆菌，具有快速、灵敏度高、特异性强等优点，是肺结核的新型检测手段。 2.蛋白质组学分析：蛋白质组学分析是一种全面研究生物体内蛋白质表达和调控的方法，可以发现新的生物标志物，从而提高肺结核的诊断准确性和鉴别诊断能力。 3.微流控技术：微流控技术是最近几年发展起来的一种新型技术，通过微小化、可控 制的流体流动来实现生物分析的高通量和高灵敏度，可用于快速、准确地检测肺结核病原体。 4.支持向量机算法：支持向量机算法是一种人工智能算法，能够分类和预测数据，已 被应用于医学领域，可以通过数据挖掘发现新的生物标志物，为肺结核的诊断和治疗提供 更准确的数据支持。 三、结语 随着生物技术的发展和人工智能算法的应用，肺结核的实验室诊断方法正不断创新和 发展，其准确性和效率不断提高，为病人提供更好的医疗服务。但是，肺结核的诊断和治 疗需要综合考虑症状、体征、影像学检查和实验室检查等多方面因素，以获得更准确的诊 断和更有效的治疗。
奶牛结核病检测方法
奶牛结核病检测方法 奶牛结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可以影响奶牛的健康和生产能力，还可以通过食用患有结核病奶牛的牛奶和肉类传播给人类。因此，对奶牛结核病进行及早的检测和防控非常重要。下面将介绍几种常用的奶牛结核病检测方法。 一、皮内试验 皮内试验是目前最常用和经济实用的奶牛结核病检测方法之一。这种方法通过在奶牛的皮肤下注射结核菌抗原，观察注射部位是否产生特异性的变应反应来判断奶牛是否感染结核菌。结果的判断是根据注射后48~72小时观察注射部位是否有明显的硬结和红肿，硬结直径大于10mm者为阳性反应，表明该奶牛可能感染有结核菌。需要注意的是，皮内试验属于间接试验，存在一定的假阴性和假阳性的可能性，因此在实际应用中需要与其他检测方法相结合来判断奶牛结核病的感染情况。 二、血清学检测 血清学检测是通过检测奶牛血液中特异性抗体的存在来诊断奶牛结核病。常用的血清检测方法包括血液凝集试验、酶联免疫吸附试验和胶体金试验等。这些方法的原理是将感染结核菌的奶牛的血清与结核菌抗原进行反应，然后通过不同的检测方法观察血清的凝集、发色等反应，判断是否存在结核菌的感染。相比于皮内试验，血清学检测方法具有操作简单、准确性高等优点，但也存在着一定的假阳性和假阴性的可能性，因此也需要与其他方法相结合来判断奶牛结核病的感染情
况。 三、结核菌培养 结核菌培养是通过在适当的培养基中培养样本中的结核菌，然后观察菌落的生长情况和形态特征来判断奶牛是否感染结核菌。这种方法是目前诊断结核病的“金标准”，对确定结核病感染的确诊具有重要意义。但是，结核菌培养的过程需要较长时间，通常需要培养4-6周才能得到结果，因此不太适合作为常规的奶牛结核病筛查方法。此外，结核菌培养的操作较为复杂，需要较高的实验室技术和设备条件。 四、核酸检测 核酸检测是通过检测奶牛体内结核菌的核酸（基因）来判断是否感染结核菌。这种方法的优点是操作简便、结果快速，对于早期结核病感染的检测具有较高的灵敏度和特异性。目前，常用的核酸检测方法包括聚合酶链式反应（PCR）和实时荧光定量PCR等。这些方法可以通过奶牛体液（如血液、尿液等）或检测牛体表分泌物（如奶液、鼻液等）中的结核菌核酸来进行检测，可以作为常规的奶牛结核病筛查和确诊方法。 综上所述，奶牛结核病的检测方法主要包括皮内试验、血清学检测、结核菌培养和核酸检测等。这些方法各有优缺点，可以相互结合使用，以提高奶牛结核病的检测准确性和有效性。对于诊断结果阳性的奶牛，应及时隔离并进行后续的治疗
结核病 分子生物学检验方法
结核病分子生物学检验方法 结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，其传播途径主要为空气飞沫传播。结核病在全球范围内仍然是一个严重的公共卫生问题，因此早期的诊断和治疗非常重要。分子生物学检验方法是一种快速、准确的结核病诊断方法，本文将对其进行详细介绍。 分子生物学检验方法是通过检测结核分枝杆菌的核酸来诊断结核病。与传统的培养分离方法相比，分子生物学检验方法具有更高的灵敏度和特异性。目前常用的分子生物学检验方法包括聚合酶链反应（PCR）和核酸杂交技术。 PCR是一种通过体外扩增目标DNA序列的技术，它可以将微量的目标DNA扩增至足够的数量进行检测。在结核病的分子生物学检验中，PCR可以通过扩增结核分枝杆菌的特异性基因序列来检测其存在。常用的靶基因包括IS6110、16S rRNA和hsp65等。IS6110是结核分枝杆菌特有的序列，在结核分枝杆菌中存在多个拷贝，因此可以提高检测的灵敏度。16S rRNA和hsp65是结核分枝杆菌的保守基因，通过扩增这些基因可以进一步确认结核分枝杆菌的存在。 核酸杂交技术是一种通过标记的探针与目标核酸序列的互补配对来检测目标核酸的方法。在结核病的分子生物学检验中，核酸杂交技术可以通过将结核分枝杆菌的核酸序列与标记的探针进行杂交来检
测结核分枝杆菌的存在。常用的核酸杂交技术包括荧光原位杂交（FISH）和线性探针杂交（LPA）等。FISH是一种将荧光标记的探针与靶细胞中的核酸序列进行杂交的方法，通过观察荧光信号的强度和位置可以判断结核分枝杆菌的存在。LPA是一种将线性标记的探针与目标核酸序列进行杂交的方法，通过检测标记的探针与目标核酸序列的杂交产物可以判断结核分枝杆菌的存在。 分子生物学检验方法在结核病的诊断中具有许多优点。首先，分子生物学检验方法可以快速获得结果，通常在几小时内就可以完成检测。其次，分子生物学检验方法具有高度的灵敏度和特异性，可以检测到非常低浓度的结核分枝杆菌。此外，分子生物学检验方法还可以对结核分枝杆菌的耐药性进行检测，从而指导临床上的治疗选择。 然而，分子生物学检验方法也存在一些限制。首先，分子生物学检验方法对样本的质量要求较高，如果样本中的核酸存在严重的降解或者污染，可能会导致检测结果的偏差。其次，分子生物学检验方法对设备和技术的要求较高，需要专门的实验室和培训有素的操作人员。此外，分子生物学检验方法的成本较高，不适用于资源匮乏的地区。 分子生物学检验方法是一种快速、准确的结核病诊断方法。通过PCR和核酸杂交技术可以检测结核分枝杆菌的存在，并可以对其耐
结核病实验室检测流程标准
结核病实验室检测流程标准 结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，其传染性强，严 重威胁人类健康。为了及时发现和诊断结核病，实验室检测是必不可 少的一环。本文将从标本采集、实验室检测和结果判读三个方面，介 绍结核病实验室检测流程标准。 一、标本采集 结核病的标本采集是实验室检测的第一步，其质量直接影响后续检测 结果的准确性。标本采集应在严格的无菌条件下进行，采集的标本应 包括痰液、胸腔积液、尿液、脑脊液等。在采集痰液时，应让患者深 呼吸数次，然后咳出痰液，避免口腔分泌物的污染。采集胸腔积液时，应在穿刺前进行消毒，并在穿刺后立即将标本送至实验室。采集尿液时，应让患者在清晨第一次排尿时采集，避免尿液的稀释。采集脑脊 液时，应在穿刺前进行消毒，并在穿刺后立即将标本送至实验室。 二、实验室检测 结核病的实验室检测主要包括涂片法、培养法、PCR法等。涂片法是 最常用的检测方法，其操作简单、快速，但灵敏度较低。培养法是检 测结核分枝杆菌的“金标准”，其灵敏度高，但需要较长的培养时间。PCR法是一种新兴的检测方法，其灵敏度高、特异性强，但需要较高 的技术水平和设备支持。实验室检测应在严格的无菌条件下进行，避 免标本污染和交叉感染。检测结果应及时记录和报告，确保患者能够
及时接受治疗。 三、结果判读 结核病的实验室检测结果应根据临床表现和其他检查结果进行综合判读。涂片法和PCR法的阳性结果可以初步诊断结核病，但需要进一步 的确认。培养法的阳性结果可以确诊结核病，但需要排除其他细菌感染。实验室检测结果应及时通知临床医生，以便制定合理的治疗方案。 综上所述，结核病实验室检测流程标准包括标本采集、实验室检测和 结果判读三个方面。标本采集应在严格的无菌条件下进行，实验室检 测应遵循相应的操作规范，结果判读应综合考虑临床表现和其他检查 结果。只有严格按照标准操作，才能确保结核病的及时发现和诊断， 保障人民群众的健康。
结核病诊断常用检验项目简介及意义
结核病诊断常用检验项目简介及意义 一．结核病诊断项目及意义。 1、涂片抗酸染色找抗酸杆菌： 方法简单，快速，特异性较高，成本低廉，已广泛应用。阳性一般可确诊结核病，并证明其有传染性。但其灵敏度较低，每毫升标本中含量在5000—10000条菌以上才可检出，故肺结核中约有2/3为菌阴肺结核，绝大部分肺外结核也为阴性。如用浓缩集菌抗酸染色或萤光染色可提高灵敏度，提高检出率。利用BALF检查-支气管肺泡灌洗液检查又称为“肺的液体活组织检查或肺的液性活检”，涂片平均阳性率为33.9%，培养阳性率为50.3%。 2、结核杆菌培养检查： 结核杆菌培养检查是目前结核病诊断的“黄金标准”，如病人标本中检出结核菌，可100%确诊为结核病，并且具有传染性。培养出来的结核杆菌可用来进一步做药敏试验，为结核病流行病学及临床治疗提供用药依据。其理论上可检出一条菌，实际工作中只有约1/3肺结核病人为阳性，且用时较长，需30天左右，加上药敏试验需60多天。 3、结核杆菌快速培养： 利用萤光检测原理使结核菌培养与药敏实验总共只需20天左右时间，比传统结核杆菌培养法缩短了40多天时间，且阳性率提高10—20%以上，相对于BACTEC460来说，无放射性污染，实现了结核菌“快速培养”。其不足是费用较高。 4、分子生物学诊断： TB-DNA-PCR检查即结核杆菌基因检测，其基本原理是利用DNA在体外反复“克隆”复制，在短时间内2—3小时，DNA可复制到原来的百万倍。以此来检查结核杆菌DNA诊断结核病，其方法具有快速、特异、灵敏度高的特点，但定性PCR易出现假阳性，限制了其临床应用。 二.结核病辅助诊断项目及意义。
结核病的实验室诊断方法
结核病的实验室诊断方法 结核病实验室检查主要有；涂片染色显微镜检查、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定、分枝杆菌基因分型、分枝 杆菌血清学及核酸扩增检测等。细菌学检查 细菌学检验结果的准确性首先取决于标本的质量。正确地采集、转送 标本，是直接影响检验结果的重要因素和取得准确结果的前提。各种标本(痰液、血液、伤口分泌物和各种感染组织等)采集时应充分考虑到选择恰 当合理的时问，考虑到可能存在的病原菌的性质，按要求采集标本，这样 可使标本包含细菌，并为后续检验步骤打下良好的。合格的痰标本在低倍 镜视野里上皮细胞应<10个，白细胞数应>25个。 涂片染色显微镜检查根据我国结核病防治规划的要求，对咳嗽、咳 痰>13周或有咯血或血痰的肺结核可疑症状者，应留取3份痰标本(夜间痰、清晨痰和即时痰)进行痰涂片抗酸染色检查。即时痰为病人就诊时咳 出的痰液：清晨痰为清晨深咳出的痰液；夜间痰为就诊前1天晚睡前咳出 的痰液。留取的痰液标本常规涂片后，进行要尔－尼尔逊氏染色法 (ziehl-Neelen)染色。 分枝杆菌分离培养结核分枝杆菌是兼性需氧菌，最适生长温度为37℃，最适pH为6.5～7.2。分枝杆菌分离培养检查法，是结核病确诊最 可靠的方法。是获得纯培养物进行菌种鉴定、药物敏感性试验以及其他生 物学研究的。 当前，我国普遍采用改良L-J(改良罗氏)培养基来分离培养结核分枝 杆菌。通常情况下，当每1ml标本中微生物含量达102～3CFU(菌落形成 单位)时，即可培养阳性。分枝杆菌快速培养检查是使用分枝杆菌快速培
养仪(MIGT、BacT/A1err、ESP)，通过测定细菌生长代谢检测分枝杆菌生 长情况的方法。 在进行分枝杆菌快速培养检查时，标本接种前的祛污染处理，必须严 格按照系统说明书中给定的方法进行。孵育检测过程中系统报告阳性时， 相应标本的培养液必须首先进行抗酸染色镜检，发现抗酸菌后方可发出阳 性报告。 分枝杆菌药物敏感性试验分枝杆菌药物敏感性试验对于结核病人合 理的药物选择、合适的药物剂量以及针对耐药病人的预防控制具有积极的 作用。结核病耐药性监测可以为评估制定国家结核病控制规划和控制策略 提供科学依据。 分枝杆菌菌种鉴定目前报道的分枝杆菌种类已有100多种。经抗酸染 色镜检确定为抗酸菌的培养阳性菌株，应该先接种改良罗氏(L-J)培养基 进行增菌传代后进行传统方法的菌种鉴定。 传统方法进行分枝杆菌菌种鉴定，需要经过硝基苯甲酸(PNB)生长试验、28℃生长试验、耐热触酶试验，观察记录细菌的生长速度、菌落形态 和菌落颜色确定该菌株属于结核分枝杆菌复合群还是NTM。 血清学检测 涂片染色显微镜检查方法有一定的局限性，因为它对处于相对进展状 态的结核病诊断具有较强的特异性，但其灵敏度在不同实验室间有所差异。另外，涂片染色显微镜检查需要病人重复送3次痰，这导致有些时候病人 的依从性不良，并且涂片染色显微镜检查对涂阴病人、儿童以及肺外结核 病不能够给予诊断，在涂片染色显微镜检查过程中，如果操作不当也可能 导致实验室人员受到感染。
结核杆菌的三种实验方法的应用评估
结核杆菌的三种实验方法的应用评估 目的比较痰涂片法、荧光定量PCR法和结核抗体检测法对结核病的诊断意义。方法选取2014年7月～10月在我院诊疗疑似或确诊患者172例，进行涂片抗酸染色、荧光（PCR）检测和采集血样进行结核抗体检测。结果172例检样中，抗酸染色痰液标本阳性例只有20例阳性率为11.6%。荧光PCR法阳性率55例，阳性率31.2%，结核抗体阳性例为87例；阳性率为50.6%。结论三种方法中，以结核抗体阳性率最高，荧光PCR法次之，抗酸染色法阳性率最低，如果三种方法联合运用，相互佐证，可提高准确性。 标签：结核杆菌；检测方法 结核杆菌又称分枝杆菌，是引发结核病的病原菌，可能对全身的各大器官造成侵害，临床中以肺结核最为常见。结核杆菌细胞含有大量分枝菌酸，染色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌，结核杆菌是引起结核病的病原菌，可侵犯全身器官，但以肺结核为多见。结核病至今仍为重要的传染病，近年来，因艾滋病、吸毒等社会原因及免疫制剂的应用，其发病呈上升趋势。鉴定结核杆菌的方法有很多[1]。本研究应用痰涂片染色法、PCR-荧光法、结核分枝杆菌抗体检测，对172例标本同时进行比较和评价。 1资料与方法 1.1一般资料收集自2014年7月～10月在我院诊疗疑似或确诊的患者标本172例。所有患者均通过痰涂片抗酸结核杆菌检验、胸部X线片、临床表现以及结核菌素试验等诊断为肺结核。涂片法和荧光PCR为痰标本。嘱患者留取晨痰2～5ml（结核患者需停抗结核药3d）。结核抗体检测则采静脉血2ml。 1.2方法 1.2.1涂片染色镜检是临床常用的简易快速的检查方法：取痰或其他已外理好的标本0.1ml，于载玻片上均匀涂抹成2cm×2.5cm椭圆形范围，以自然干燥和火焰固定后，进行抗酸染色，采用珠海贝索生物技术有限公司的结核染色液。染色步骤：①石碳酸复红溶液染色20min；②5%盐酸酒精脱色3min；③亚甲基蓝溶液染色30S。 1.2.2 PCR-荧光法采用实时荧光定量PCR法试剂：试剂盒为中山大学达安基因公司产品。 方法：①取患者咳出的深部痰，痰液中加入4倍体积4 %NaOH液化痰液，30 min后吸1.5 ml置EP内。②在金属浴内100℃（3～5 min）12000 r/min，弃上清液。③加入生理盐水约1.5 ml混匀振荡，离心弃上清液。④重复洗涤1次。 ⑤加入40 ml DNA提取液在金属浴100℃10 min。⑥12000 r/min离心5 min标本处理完毕。⑦离心取上清2 ul至PCR反应管内，反应管置定量PCR扩增仪内，
结核病实验室诊断技术介绍
1．结核分枝杆菌鉴定方法 1. 1萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查 目前萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查是我国结核病实验室使用最为普遍的方法，其操作简单快捷，特异性高，设备要求低，但是灵敏度较低，不能及时发现病人。 1.2 发光二极管荧光显微镜（LED荧光显微镜） 发光二极管荧光显微镜管利用二极管光源，延长了显微镜使用寿命，不需要暗室，且价格低廉，可以提高涂片的阳性检出率。目前在国内应用评估结果显示灵敏度较明场显微镜明显提高，已在部分区县开始使用。 1.3 交叉引物恒温扩增结核病诊断技术 在恒定温度下，特殊的引物和特异性探针在酶的作用下，反应体系在一个密闭的反应管内反应。扩增反应一般不超过一个小时，最短半小时。目前应用玻璃化试剂，稳定性好，便于运输。目前在国内区县级应用评估。 1.4 夹层杯结核病诊断方法 将痰标本（或其它标本）用专用消化灭活液充分消化，完全暴露并保留抗酸杆菌，通过自动离心涂片机（或半自动制片染色机）对消化后的标本进行充分集菌。直接在夹层杯装置中进行抗酸染色，取出基片或膜片置于普通显微镜进行观察。 夹层杯法操作方便快捷，便于标准化操作，通过消化灭活，安全性改善，阳性检出率也比直接涂片法大大提高。 夹层杯的装置有沉降式和虑过式，适用于不同工作量的医疗机构。 1.5 环介导等温扩增 方法采用2对引物在等温条件下即可完成DNA的扩增，扩增结果通过肉眼观察荧光进行判定，诊断是否为结核病。同时整个反应体系采用封闭系统减少了工作区域扩增子的污染，整个反应过程只需一个小时即可完成，通过肉眼观察荧光判读结果。 2．结核分枝杆菌培养方法 2.1 固体培养
培养是结核病诊断的精标准，也是获得分离菌株开展耐药检测的前提，我国结核病实验室最常用的是固体罗氏培养法，包括简单法和中和离心法。 虽然培养是诊断的精标准，但是花费时间长，需要4-8周时间。 2.2 液体培养 液体培养通过添加生长刺激剂，改变检测方法提高检测灵敏度等方式缩短了阳性报告时间。 目前应用的有BACTEC-快培、MGIT-快培和Alert 3D-快培法，虽然快速液体培养法缩短了报告时间，但是其价格昂贵且污染率高，限制了其广泛应用。目前国内应用主要集中在结核病专科医院。 3．药物敏感性试验 3.1 固体药物敏感性试验 药物敏感性试验是耐药结核病诊断的主要依据，在规范化治疗治疗中起着重要作用，不仅有助于筛选有效的抗结核药物，还可以了解耐药菌株的流行情况，为抗结核药物的合理应用提供实验依据。 目前我们国家结核病实验室使用的药敏方法有直接法和间接法，间接法最常用的方法有绝对浓度法药敏试验和比例法药敏试验。 绝对浓度发药敏试验时60年代以来结核病实验室特别是医院的实验室用于结核分枝杆菌药敏试验的常用方法，其原理是接种同一浓度的菌液在两支不同浓度的含药中性改良罗氏培养基上，计数对照培养基和含药培养基上细菌生长菌落的数量，根据含药培养基上菌落生长的数量，确定测试菌株对该药的耐药性。 比例法药敏试验是1996年世界卫生组织在我国开展耐药监测以来广泛在结核病实验室用于耐药性检测的方法。其原理是接种两种不同浓度的菌液在两支同一浓度的含药中性改良罗氏培养基上，计数对照培养基和含药培养基上细菌生长菌落的数量，计算耐药百分比，确定测试菌株对该药的耐药性。 无论是比例法还是绝对浓度法，都需要1个月时间报告药敏结果。 3.2 液体药物敏感性试验 液体药物敏感性试验通过对细菌培养代谢产物的检测，提高了检测灵敏度，缩短了报告时间。常用的BACTEC系统和MGIT系统，一般在结核病专科医院应用。
结核分枝杆菌的实验室检测方法学评价及耐药情况研究
结核分枝杆菌的实验室检测方法学评价 及耐药情况研究 摘要:目的:对结核分枝杆菌的实验室检测方法学评价及耐药性进行分析。 方法：筛选我院在一年之间抽取的120例结核病患者的痰液共360份进行研究，进行涂片镜检、罗氏固体培养、BACT/ALERT3D60液体培养及Genexpert分子检测 等4种实验室检测，观察检测结果及药敏实验结果。结果：虽然Genexpert分 子检测阳性率与液体培养阳性率相似，但分子检测时间更快，使用Genexpert分 子检测所需时间更短(P<0.05)；结核分支杆菌对氧氟沙星的耐药性最高。结论: 通过对结核分支杆菌进行实验室检测发现，Genexpert分子检测对结核分枝杆菌 的诊断具有重要价值，同时结核分枝杆菌对临床上经常使用的抗结核药物均有一 定的耐药性，值得引起重视。 关键词：结核分支杆菌；检测方法；耐药 Methodological evaluation of laboratory test and study on drug resistance of Mycobacterium tuberculosis Xiao Huixia, Wang Furui, Wang Xiaoping, Liu Jing, Chen Min, Tian Xusheng Reference Laboratory of Tuberculosis, The Fourth People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Yinchuan 750021, China Abstract: Objective: To evaluate the laboratory testing methodology and analyze the drug resistance of Mycobacterium tuberculosis. Method: a total of 360 samples of sputum extracted from 120 tuberculosis patients in our hospital within one year were screened for study. Four laboratory tests were conducted, including smear microscopy, Roche solid culture, BACT/ALERT3D60 liquid culture
结核杆菌试验结果判断方法
结核杆菌试验结果判断方法结核病是一种影响全球范围的慢性传染病，其主要致病菌为结核杆菌。为了诊断结核病患者，临床医生常常会进行结核杆菌试验。然而，正确判断结核杆菌试验结果对于准确诊断和治疗结核病患者至关重要。本文将详细介绍结核杆菌试验结果判断的方法，以帮助医生准确解读患者的结核杆菌试验结果。 一、结核杆菌试验种类及原理 结核杆菌试验包括常规结核菌素试验以及现代分子生物学技术所开发的分子检测试验。常规结核菌素试验是通过皮肤注射结核菌素，观察注射部位皮肤变化情况来判断患者是否感染结核菌。而分子检测试验则通过检测患者体液、组织等样本中的结核菌DNA或RNA来快速确认结核菌感染情况。 二、常规结核菌素试验结果判断方法 1. 通过直接观察注射部位皮肤反应来判断常规结核菌素试验结果。注射部位皮肤发生红斑或硬结反应通常表明患者免疫系统对结核菌素具有敏感性，可能已感染结核菌。 2. 量化测定注射部位皮肤反应的大小，一般采用厚度或直径测量方法。常用的计量方式包括银规、牛规等，测量结果可根据相关参考值进行判断。 3. 结合患者的临床症状以及其他辅助检查结果来判断试验结果。例如，患者有典型的结核病症状，并且CT、X光等影像学检查结果显示典型结核病表现，则可以初步判断为结核菌感染。 三、分子检测试验结果判断方法 1. 分子检测试验结果通常通过荧光信号或者DNA条带的出现与否来判断。设备会输出分子检测结果的荧光信号或者电子数据，医生根据设备手册或者相关技术标准进行解读。 2. 结合设备输出的数据进行定量判断。通常，分子检测试验设备会提供一个参考范围，医生可根据患者的数据与参考范围进行比较，从而判断是否感染结核菌。 3. 结合患者的临床症状和其他实验结果进行综合判断。例如，分子检测试验结果为阳性，患者有结核病典型症状，且在影像学检查中发现肺部结核病表现，则可以初步判断为结核杆菌感染。 结核杆菌试验结果判断方法对于准确诊断和治疗结核病患者至关重要。常规结核菌素试验依靠观察注射部位皮肤变化以及量化测定来判断结果，还可结合临床症状和其他辅助检查结果进行综合判断。分子检测试验则通过荧光信号或者DNA条带的出现与否来判断结果，并可以结合设备输出的数据和患者的临床症状进行综合判断。正确解读结核杆菌试验结果有助于早期发现结核菌感染并及时采取治疗措施，从而保障患者的健康。 本文详细介绍了结核杆菌试验结果判断方法。通过常规结核菌素试验和分子检测试验两种方法，医生可以准确判断患者是否感染结核菌。然而，正确解读结核杆菌试验结果一定需要结合患者的临床症状和其他辅助检查结果，以获得更准确的诊断。通过有效的结核杆菌试验结果判断方法，我们能够提高结核病的早期诊断率，为患者提供更好的治疗和护理。 加兰他敏衍生物及制备方法和用途加兰他敏（Galanathmin）是一种敏感神经炎药物，常用于治疗神经炎症状、糖尿病神经病变以及疼痛等症状，具有一定的镇痛作用。针对其生物及制备方法和用途，本文将进行详细描述。
三种检测结核分枝杆菌方法的应用评价
三种检测结核分枝杆菌方法的应用评价 摘要目的评估荧光二极管（LED）直接涂片法、酸性罗氏培养法、Bactec MGIT 960培养法检测结核分枝杆菌临床应用价值。方法317例临床确诊结核病患者痰样本，每例痰样本均分为3份，分别采用LED直接涂片法、酸性罗氏培养法和Bactec MGIT 960培养法进行检测，比较三种方法培养阳性率，以及阳性率较高的两种检测方法培养所需时间、污染率。结果317例痰液标本中，Bactec MGIT 960培养法、酸性罗氏培养法阳性率均高于LED直接涂片法阳性率，差异具有统计学意义（χ2=97.71、44.69，P＜0.01）；Bactec MGIT 960培养法阳性率显著高于酸性罗氏培养法，差异具有统计学意义（χ2=11.80，P＜0.01）。酸性罗氏培养法和Bactec MGIT 960培养法的检出时间分别为33.0 d（25.0～40.0 d）、14.0 d（9.0～18.0 d），比较差异有统计学意义（Z=-19.601，P＜0.01）。317例痰液标本中，酸性罗氏培养法污染率为4.7%（15/317），Bactec MGIT 960培养法污染率为5.0%（16/317），比较差异无统计学意义（χ2=0.03，P>0.05）。结论Bactec MGIT 960培养法可以显著提高培养阳性率、缩短培养时间。 关键词结核分枝杆菌快速培养；Bactec MGIT 960系统；酸性罗氏培养 据世界卫生组织报告2014年全球共有150万人因结核病死亡。我国传染病监测信息系统肺结核报告发病数近几年均位居甲、乙类传染病的第二位。结核病细菌学检查是结核病诊断和治疗方案的主要依据。然而现有的结核病实验室诊断方法远不能满足临床诊治的需要，建立快速、敏感、特异的诊断方法，对于结核病防治工作具有重要意义[1]。Bactec MGIT 960系统培养是结核杆菌快速培养的新技术，采用荧光二极管直接涂片（简称LED直接涂片法）及酸性罗氏培养法和Bactec MGIT 960快速培养三种检测方法对确诊的结核患者的痰液标本进行检测，比较评价三种检测方法的应用价值。现报告如下。 1 材料与方法 1. 1 材料收集河南省安阳市结核病防治所2016年1～6月317例结核病确诊患者合格痰液标本，每例样本均分为3份，同时做LED直接涂片法、酸性罗氏培养、Bactec MGIT 960快速培养。 1. 2 仪器与试剂美国BD公司Bactec MGIT 960全自动分枝杆菌培养药敏仪；山东海尔CLASSⅡTYPEA2型生物安全柜，上海森信实验仪器有限公司DRP-9802恒温培养箱，安徽中佳科学仪器有限公司MC-3518高速离心机，涡旋振荡器，2 ml无菌吸管。Bactec MGIT 960全自动分枝杆菌培养基、分枝杆菌生长指示管及添加剂、杂菌抑制剂均是美国BD公司提供；酸性罗氏培养基和LED直接涂片法染色试剂为珠海贝索生物技术有限公司产品，所有试剂和培养基均在有效期内使用。 1. 3 LED直接涂片法严格按照《结核病实验室诊断技术培训教程》要求进行[2]。
肺结核活动性判断规范及临床应用专家共识》(2020)要点
肺结核活动性判断规范及临床应用专家共 识》(2020)要点 肺结核活动性判断规范及临床应用专家共识》（2020）要点结核病是传染性疾病领域死亡人数第一位的疾病。中国肺结核疫情十分严峻，是全球第二大结核病高负担国家，2018年新发肺结核患者82.3万例。结核分枝杆菌病原学检查阳性是诊断肺结核的金标准，但我国仍有大量病原学阴性的肺结核患者。活动性判断作为肺结核诊疗工作中不可或缺的环节，主要解决肺结核“治不治疗”和“停不停药”的问题。对病原学阳性肺结核进行活动性判断相对容易，但对病原学阴性肺结核则需要结合临床表现、治疗史和影像学等多种手段，才能做出最终判断。 背景 一直以来，我国尚未建立肺结核活动性判断的科学评价体系，肺结核过诊过治和漏诊漏治的现象时有发生，影响了医疗质量，加重了医疗负担。建立肺结核活动性判断的临床综合评价体系变成可行之事)当务之急。活动性判断的对象 一、肺结核患者治疗前需要进行活动性评价 二、肺结核患者疗程结束时需要进行活动性评价 肺结核活动性评价办法
1、临床病症评价 1.初诊患者,出现临床症状是患者就诊的常见原因，可将其作为判断肺结核活动性的依据之一。咳嗽、咳痰≥2周，可合并有痰中带血或咯血；出现全身结核中毒症状，如盗汗、乏力、间断或持续午后低热、以及食欲不振、体质量减轻等，以上症状往往提示肺结核具有活动性。部分患者可无症状而在体检时发现肺部病变，需要结合影像学及相关检查进行肺结核诊断及活动性判断。 2.疗程竣事的患者,多半患者病症消失，细菌学检查阴转，影象学表现为肺部病灶持续稳定。少数患者由于肺部不可逆的组织损伤或并发其他肺部疾病，即便存在咳嗽、咳痰、喘息、咯血等病症，亦不能将其作为活动性肺结核的判别依据，需仔细甄别。 二、治疗史评价 1.疗程竣事的患者,需要系统地进行治疗史评价，包括抗结核化疗方案的药物组成和疗程、患者依从性和耐受性)细菌学及药物血药浓度等。 2.化疗不彻底和治疗不规律的患者,需要调整治疗和管理方式，确保完成疗程后再行活动性评价，同时观察细菌学和影象学的静态变化。3、实验室评价 一）病原学评价
结核病的实验室诊断方式及评价
耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性， 1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件大体具有即将投入运行， 2）日常培育及涂片用的生物安全柜滤膜已超出利用年限，工作人员生物安全得不到保障，应按期予以改换。 耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。因此其基础是培育，只有培育出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是不是为耐多药结核分枝杆菌。 BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方式;比例法以是不是能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐利用的方式;后四种仪器方式则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢进程指示细菌生长状况。 2.处于研究探索阶段的测定方式:此类方式很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培育基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。 3分子生物学方式对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。基因突变是引发抗结核药物耐药性的最主要的原因。多种以PCR为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方式在实验室或临床取得开展。这些方式具体包括： 芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方式虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺点，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。 结核病的实验室诊断方式及评价 (一)标本的收集 1．痰标本采集新发病人应在抗结核药物治疗前留取痰标本。治疗中的病人应停药2～3天后留取痰标本。病人于清晨漱口后，留取3～5ml合格的痰标本(深咳后吐出的黏液痰、脓样痰、干酪样痰、褐色血样痰或含少量新鲜血液的血痰)，遇到唾液或口永，应重
最新：综合医院结核分枝杆菌感染实验室检查共识最全版
最新：综合医院结核分枝杆菌感染实验室检查共识(最全版) 综合医院结核分枝杆菌感染(结核病)的病原学诊断一直是业界焦点。编写组专家对综合医院结核分枝杆菌感染(结核病)的微生物学检查进行了讨论，撰写了专家共识，并对一些关键问题给出了推荐。本文包括涂片、培养、药敏试验等技术内容，希望能为临床处置、实验室工作提供合理、实用的帮助。 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB )是经典致;, 引起肺结核和肺外感染。结核病是目前全球感染性疾病死亡的主要原因。我国是〃结核病大国〃，初诊患者很多在综合医院就诊，但结核病在综合医院的病原学诊断、药敏试验等却不尽如人意。中国医疗保健国际交流促进会临床微生物与感染分会、中华医学会检验医学分会临床微生物学组、中华医学会微生物学和免疫学分会临床微生物学组组织专家撰写本共识, 供综合医院结核病病原学检查参考。 一、术语 (—)结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex , MTBC) 该菌是细长、直或稍弯曲、两端圆钝的杆菌，长约1-4 μm ,宽约0.3~0.6 μm ,抗酸染色阳性，可致结核病。结核分枝杆菌复合群包括MTB s牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡内蒂分枝杆菌和田鼠分枝杆菌等。非结核分枝
杆菌（non-tuberculous mycobacteria , NTM ）是指分枝杆菌属中除结核分枝杆菌复合群及麻风分枝杆菌以外的菌种。 （二）活动性结核病 MTBC感染人体后,处于活动期，患者有结核病相关的临床症状和体征，有MTB 感染的病原学、病理学、影像学等检查证据。 （三）潜伏性结核感染（latent tuberculosis infection , LTBI） 机体感染MTBC后出现持久免疫应答但未发生活动性结核病的一种临床状态，临床上既无活动性结核病的症状、体征和明显的实验室检查异常，也无活动性结核病的影像学证据等。目前尚无公认的LTBI诊断方法。 （四）肺外结核病 结核病变发生在肺脏以外的器官和部位，可能伴/不伴非特异性全身症状。如淋巴结、骨、关节、泌尿生殖系统、消化系统、中枢神经系统等部位。 （五）多重耐药结核病（multidrug resistant tuberculosis , MDR-TB ） MTB 领域指该菌同时对异烟月井和利福平耐药。该菌所致疾病为MDR-TB o （六）广泛耐药结核病（extensively drug-resistant tuberculosis , XDR-TB ）MTB领域指该菌对利福平和任何氟瞳诺酮类药物以及贝达奎林和利奈嘤胺中的一种具有耐药性。该菌所致疾病为XDR-TB o
结核病诊断技术
第 2 章实验室检验技术 结核病实验室检查，特别是细菌学检查是结核病确诊和治疗的主要依据。结核病细菌学检验主要包括4项基本技术，即涂片染色镜检、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定。检验人员应依据临床医师检验申请要求并结合实验室的设备和技术条件，负责对标本进行检验，及时、准确地填写检验报告。 近年来，国内、外研究者在分子生物学、分子微生物学及免疫学领域建立了若干快速、敏感、特异的检测新技术，为可疑结核病患者的早期诊断与合理治疗带来了新的希望。列入“规范”的结核杆菌临床基因扩增（PCR）检验技术、 分枝杆菌快速培养及药物敏感性试验技术、免疫学检测技术，因有多种试剂盒（试剂）及分析仪器可供选择，目前尚难制定统一的技术操作规范，故暂定为辅助操作技术。具备开展这些技术项目条件的实验室（或检验科），须经有关主管部门批准后，严格按照相应技术所附的说明书与操作规程实施。 鉴于结核病实验室检查，特别是细菌学检查在结核病控制工作中的重要性，为保障相应检查项目结果的可靠性，要求相应的检查项目必须由经过培训并考核合格的专职人员完成，且开展相应检查的实验室应具备安全操作设施，制定实验室内部质量控制措施，同时接受专业结核病实验室的质量控制督导和培训。 第一节结核茵检验实验室安全操作规则 结核病细菌学实验室必须具有与其服务级别相应的装备，其原则是能满足该级别实验室的需要，使实验室工作人员得到充分的防护，并避免造成环境污染。 1．实验室应有合理布局及合适的单向（外排）通风体系。 2．实验室应配备相应的防护设备，以保护工作人员的安全和实验工作的顺利进行。分离培养、药物敏感性测定、菌种鉴定试验等操作应设有生物安全操作柜或接种间和通风橱等。 3．实验室工作人员应按正确方式进行技术操作，穿戴隔离衣、口罩和帽子等。 4．实验室所有带毒废弃物应灭菌及无害化处理。 5．建立清洁消毒制度，限制非工作人员进入室内，禁止在实验室饮食和吸烟等。 6．进行下列操作时应严格按照技术操作规范，防止产生细菌气溶胶： ①涂片制作；②培养液的倾倒和转移；③高速混合含菌液体；④滴加、接种培养物；⑤吸管稀释和混合菌悬液；⑥取样器和振荡器的使用；⑦细菌细胞超声粉碎；⑧感染动物实验等。