芍芪多苷对迟发型变态反应小鼠细胞免疫功能的影响

·444·
中国药理学通报 Ch inese Pha rm acolog ica l B u lletin 2008 Ap r; 24 (4) : 444～8
芍芪多苷对迟发型变态反应小鼠细胞免疫功能的影响
方 笋 ,王 萌 ,赵晓娟 ,陈根林 ,魏 伟
(安徽医科大学临床药理研究所 ,抗炎免疫药理学安徽省重点实验室 , 安徽省中药研究与开发重点研究室 ,抗炎免疫药物安徽省工程技术研究中心 ,安徽 合肥 230032)
IL 22、干扰素 γ( IFN 2γ)的产生 ,从而引起皮肤红肿 、 皮疹和水疱等炎症表现 [ 1, 2 ] 。DNCB 诱导的 DTH 模 型是一种免疫性炎症模型 ,其病理学变化在临床和 组织学上与人类变态反应性疾病相似 ,对研究 T细 胞及其细胞因子在炎症免疫性疾病中的作用有一定 的指导意义 [ 3 ] 。
目前 ,中药和天然药物在治疗免疫性疾病及免 疫调节方面有了很大进展 ,许多中药和天然药物的 活性成分如苷类 、多糖等都有良好的免疫调节作用 。 白芍总苷 ( total glucosides of paeony , TGP) 、黄芪总 皂苷 ( total astragalosides, ASTs)和香菇多糖 ( lentin2 an)等都被证实有确切的免疫调节作用 。 TGP是由 传统中药白芍根部提取的有效部位 ,具有明显的抗 炎免疫调节作用 [ 4 ] 。ASTs是黄芪发挥免疫调节作 用的主要成分之一 , ASTs可以提高细胞免疫 、体液 免疫并促进多种细胞因子的释放 ,作用多为双向调 节 [ 5, 6 ] 。芍芪多苷 ( Shaoqiduogan, SQD G) 是白芍和 黄芪按照一定比例经过现代科学制取工艺精制获得 的中药有效部位 。本文首次研究 SQDG对不同免疫 状态下小鼠迟发型变态反应的作用 ,以探讨其免疫 调节作用的部分机制 。
关键词 :芍芪多苷 ; 迟发型变态反应 ; 胸腺淋巴细胞增殖 ; 白细胞介素 22
迟发型变态反应 ( delayed2type hypersensitivity, DTH )是一种由 T细胞介导的炎症免疫反应 。当皮 肤接触一些小分子半抗原物质如 2, 42二硝基氯苯 (2, 42dinitrochlorobenzene, DNCB ) 、2, 42二硝基氟苯 及唑酮后 ,半抗原可与皮肤蛋白结合形成完全抗原 , 激活对抗原敏感的 T细胞 ,当机体再次接触致敏原 后 ,朗格汉斯细胞 (Langerhans cells, LC)捕获并呈递 抗原给致敏 T细胞 , T细胞活化 ,引发细胞因子如
中国 图 书 分 类 号 : R2332; R 28411; R 329124; R 392111; R 392112; R 59311 文献标识码 : A 文章编号 : 1001 - 1978 (2008) 04 - 0444 - 05 摘要 : 目的 探讨在不同免疫状态下 ,芍芪多苷 ( Shaoqid2 uogan, SQDG)对迟发型变态反应 (DTH )小鼠细胞免疫功能 的作用 。方 法 采 用 2, 42二 硝 基 氯 苯 (DNCB ) 诱 导 小 鼠 DTH模型及环磷酰胺 ( Cy)诱导小鼠免疫低下或亢进模型 。 SQDG予小鼠连续灌胃 7 d。M TT法检测 ConA 诱导的小鼠 胸腺 T淋巴细胞增殖 ,小鼠胸腺细胞增殖法检测 ConA 诱导 的小鼠胸腺 T淋巴细胞培养上清中白细胞介素 2 ( IL 22)的 活性 。结果 在小鼠 DTH模型 , SQDG ( 120 mg·kg- 1 )可降 低耳肿胀 、胸腺指数 、ConA 诱导的胸腺 T淋巴细胞增殖反应 以及 ConA 诱导的胸腺 T淋巴细胞培养上清中 IL 22的活性 。 DNCB 初次致敏当日腹腔注射 ( ip) Cy (150mg·kg- 1 )可以造 成 DTH低下模型 ,致敏前 3 d ip Cy ( 250 mg·kg- 1 )可造成 DTH 亢 进 模 型 上 调 DTH低下模型小鼠耳肿胀 、ConA 诱导的小鼠胸腺 T淋巴细 胞增殖及小鼠胸腺 T淋巴细胞培养上清中 IL 22 的水平 ;且 能明显下调 DTH 亢进模型小鼠上述指标的水平 。结论 SQDG对小鼠细胞免疫具有双向调节的作用 。
DM SO 120μl,在酶标仪上于 490 nm 波长处读每孔 吸光度 ( absorbance, A ) ,结果以 A 均值表示 。 1. 7 ConA 诱导的胸腺 T 淋巴细胞产生 IL 22 测 定 [8]
1. 7. 1 胸 腺 T 淋 巴 细 胞 培 养 上 清 的 制 备 用 DM EM 培养液制备胸腺淋巴细胞悬液 ( 1 ×1010 · L - 1 ) ,于 24 孔培养板中每孔加入细胞悬液 500 μl (终浓度 1 ×109 ·L - 1 ) , 500 μl ConA ( 终浓度 5 mg ·L - 1 ) ,置 37 ℃, 5% CO2 培养箱内培养 48 h 后 ,离 心收集上清 , - 20℃保存待测 。 1. 7. 2 IL 22 活性检测 采用活化的小鼠胸腺细胞 M TT比色法 。 C57 BL /6J 小 鼠断 头处 死 , 无 菌取 胸 腺 。用 DM EM 培养液制备胸腺细胞悬液 ( 2 ×109 · L - 1 ) ,于 96 孔培养板中每孔加入细胞悬液 50 μl (终浓度 1 ×108 ·L - 1 ) , 20 mg·L - 1 ConA 50 μl (终 浓度 5 mg·L - 1 )和不同稀释度的待测样品 100 μl, 同时 设 相 应 浓 度 的 ConA 和 培 养 液 对 照 。放 入 37 ℃, 5% CO2 培养箱培养 48 h,终止培养前 4 h,每 孔加入 5 g·L - 1的 M TT液 10μl,振荡 30 s,再放入 37 ℃, 5% CO2 培养箱继续培养 。结束培养后 1 500 r·m in- 1离心 15 m in, 吸 弃上 清 , 每孔 加入 DM SO 120μl,在酶标仪上于 490 nm 波长处读每孔吸光 度 ,结果以 A 均值表示 。 1. 8 统计学处理 统计数据以 x ±s表示 , 数据分 析采用 SPSS 1010软件 ,组间差异比较采用 F检验 , 两两比较用 Dunnett′t检验 。 2 结果 2. 1 SQD G对小鼠 D TH的影响 与正常组相比 , DTH小鼠各项指标均升高 。 SQDG ( 120 mg·kg- 1 ) 和 Pre (5 mg·kg- 1 )可降低 DTH 小鼠各项指标水 平 , SQDG (60 mg·kg- 1 )可降低胸腺指数 、ConA 诱 导的胸腺 T淋巴细胞增殖反应 ,并呈剂量依赖性降 低 ConA 诱导的胸腺 T淋巴细胞培养上清中 IL 22的 活性 。
1 材料与方法 1. 1 实验动物 昆明种小鼠 , ♂, 6～8 wk龄 , 18～ 22 g; C57BL /6J小鼠 , ♂, 6～8 wk龄 ,用于 IL 22活性 测定 ,购于安徽医科大学实验动物中心 ,皖实动准字 第 01号 。 1. 2 药物和试剂 SQDG,由药材白芍和黄芪按照 4 ∶1,经乙醇回流提取 ,大孔吸附树脂纯化后得到 , 主要含有白芍总苷和黄芪总皂苷 , 二者总纯度 > 50% ,由安徽医科大学临床药理研究所提供 ; 醋酸 强的松片 ( p rednisone acetate tablets, Pre) ,西安制药 厂 ,批号 04112404; 左旋咪唑 (Levam isole, LM S) ,桂 林南 药 股 份 有 限 公 司 , 批 号 060203。用 前 均 以 015%羧甲基纤维素钠溶液溶解 ,配成相应浓度悬浊 液 。环磷酰胺 ( Cyclophospham ide, Cy) ,江苏恒瑞医 药股份有限公司 ,批号 06090821,临用前以 0. 9%氯 化钠溶液配制成所需浓度 ; 2, 42二硝基氯苯 ,上海 试剂一 厂 ; M TT、刀豆蛋 白 A ( Concanavalin A , Co2 nA ) 、小牛血清 , 美国 Sigma 公 司产 品 ; DM EM 液 :
中国药理学通报 Ch inese Pha rm acolog ica l B u lletin 2008 Ap r; 24 (4)
·445·
DM EM 培养粉 1 袋 (美国 Sigma 公司 ) 加 NaHCO3 317 g, 1 ×105 IU · L - 1青霉素 G, 100 mg·L - 1链霉 素 , 100 g·L - 1小牛血清 ,双蒸水 1L 配成溶液 ,过滤 除菌 。二甲基亚砜 (DM SO ) ,上海硫酸厂 。 1. 3 仪器 YJ21450 型医学净化工作台 (苏州净化 设备公司 ) ; Napco 6100 CO2 培养箱 (美国杜邦公 司 ) ; LDR42814低温离心机 (北京医用离心机厂 ) ; EL 301 型酶标仪 (美国 B io2Tek 仪器公司 ) ; JA1003 电子天平 (上海精科仪器厂 ) 。 1. 4 动物模型的建立和测定 [ 7, 8 ] 1. 4. 1 小鼠 DTH 模型 每只小鼠腹部去毛 ,范围 约 3 cm ×3 cm ,并将含 1% DNCB 的丙酮麻油溶液 (1 ∶1, V /V ) 50μl均匀涂抹致敏 ,次日强化 1次 ;正 常组小鼠去毛后涂抹等量无 DNCB 的丙酮麻油溶 液 。致敏 d 5,将 1% DNCB 丙酮麻油溶液 10 μl均 匀涂抹于各组小鼠右耳内外两面进行攻击 ,左耳涂 抹等量无 DNCB 的丙酮麻油溶液 。攻击后 24 h,颈 椎脱臼处死小鼠 ,剪下左右耳壳 ,于耳片外侧 2 /3部 分用打孔器取下直径 8 mm 的耳片 ,置电子天平称 重 ,以左右耳片重量之差为肿胀度 ;同时取小鼠胸腺 及脾脏称重 ,分别以每 10 g小鼠的脾重 (mg)和胸 腺重 (mg)作为胸腺指数和脾指数 。 1. 4. 2 Cy诱导小鼠 DTH 低下模型 于致敏当日 ( d 0) ip Cy 150 mg·kg- 1 ,余步骤同小鼠 DTH 模型 制备 。 1. 4. 3 Cy诱导小鼠 DTH 亢进模型 于致敏前 3 d ip Cy 250 mg·kg- 1 ,余步骤同小鼠 DTH 模型制备 。 1. 5 动物分组及处理 DTH 小鼠随机分正常对照 组 、DTH模型组 、SQDG给药组 ( 30、60 和 120 mg· kg- 1 )和阳性对照组 Pre ( 5 mg·kg- 1 ) ; Cy诱导小鼠 D TH 低下和亢 进 模 型 组 在 上 述 分 组 基 础 上 分 别 加 上 DTH + Cy组 ,两组分别采用 LM S ( 30 m g·kg- 1 ) 和 Pre ( 5 m g · kg- 1 ) 作 阳 性 对 照 药 。用 药 方 案 : DTH 组和 DTH低下组于致敏前 2 d起 , DTH亢进组 自注射 Cy后 2 d起开始灌胃 ,每天 1 次 ,连续 7 d, 模型组 ( DTH 组及 DTH + Cy组 )和正常组分别 ig 等体积溶媒 。 1. 6 ConA诱导的胸腺淋巴细胞增殖反应 [ 8] 将 称重后的胸腺制成细胞悬液 ( 1 ×1010 ·L - 1 ) ,于 96 孔培养板中每孔加入细胞悬液 100 μl (终浓度 1 × 109 ·L - 1 ) , 10 mg·L - 1 ConA 100 μl (终浓度 5 mg ·L - 1 ) ,每个样本设 3 个复孔 。置 37 ℃, 5% CO2 培养箱内培养 48 h ,于终止培养前 4 h,每孔加入 5 g·L - 1的 M TT溶液 10 μl,于振荡器上振荡 30 s,再 放入 37 ℃, 5% CO2 培养箱继续培养 。结束培养后 2000 r·m in- 1离心 15 m in, 吸弃上清后每孔加 入