腺病毒操作资料说明
腺病毒载体操作手册中文版解析
腺病毒载体操作手册中文版解析腺病毒载体操作手册中文版AdEasyTM操作手册目录缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒操作手册
Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作手册(Version 2.0)上海吉凯基因技术有限公司 二〇〇九年二月地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 1 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒实验系统腺病毒是一种的线型双链 DNA 无包膜病毒， 它的 DNA 和核心蛋白形成的内核， 蛋白外壳 是直径约 80nm 的正二十面体，由 240 个六 面体和 12 个位于正二十面体顶部的五面体 构成。
Genechem 重组腺病毒系统是将携带外源基 因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的 包装质粒共转染 HEK293 细胞， 通过 Cre/loxP 系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。
重组腺病毒能够表达较大的外源基因片段， 感染分裂和非分裂细胞，具有广泛的宿主。
GFP-adenovirus 感染的代表细胞――腺病毒可以感染绝大多数细胞TCA8113SGC-7901NRKPC-3Huh-7GliaRabbit Mesenchymal Stem CellsHuman Mesenchymal Stem CellRat Cardiac Fibroblasts地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室 电话：86-21-51320189 网址： 邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 2 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作过程一, 注意事项:1. 操作病毒时请尽量使用生物安全柜。
吉玛重组腺病毒操作手册说明书
如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************吉玛重组腺病毒操作手册GenePharma Recombinant Adenovirus Operation Manual2017 年 6 月如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：**************************E-mail：************************目录一、产品简介 (4)二、腺病毒载体优势 (4)三、生物安全性 (5)3.1安全性 (5)3.2实验室安全措施 (5)四、流程描述 (6)五、材料与仪器 (7)5.1实验材料 (7)5.1.1细胞株 (7)5.1.2质粒 (7)5.1.3试剂 (8)5.2实验耗材及仪器 (8)5.2.1耗材 (8)5.2.2仪器 (9)六、具体步骤 (9)6.1细胞培养 (9)6.1.1活细胞计数 (9)6.1.2细胞株的冻存 (9)6.1.3细胞复苏 (10)6.1.4细胞传代 (10)6.2病毒包装 (10)6.3病毒收集 (11)6.4病毒扩增 (12)6.5病毒纯化 (12)6.6病毒重悬和保存 (13)6.7病毒滴度检测 (13)七、使用方法 (14)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************重组腺病毒在细胞水平使用 (14)7.1病毒滴度复核（有限稀释法测定） (14)7.2靶细胞感染预实验 (16)7.3正式试验 (18)八、运输和储存 (18)九、常见问题及解决方案 (19)十、吉玛案例 (20)十一、附录 (21)如有疑问欢迎垂询上海电话：************-8009苏州电话：*************-8042E-mail：************************** E-mail：************************一、产品简介腺病毒(Adenovirus，Adv)是一种线性双链DNA 病毒。
腺相关病毒操作手册--汉恒生物
汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 1汉恒生物---腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector ，AAV ）简介腺相关病毒属微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。
AA V 的基因组约 4700bp ，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有 3 个启动子(P5、P19 和 P40) 和 2 个开放阅读读框(ORF)，rep 和 cap ，如图 1 所示。
rep 编码 4 个重叠的多功能蛋白，即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40，其中 Rep78 与 Rep68 参与 AA V 的复制与整合，Rep52 和 Rep40 具有解螺旋酶和 ATP 酶活性，与 Rep78、Rep68 共同参与单链基因组的复制；cap 编码的 VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在 AA V 病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图 1. AA V 基因组结构二、腺相关病毒的优点1. 安全性高：迄今从未发现野生型A A V 对人体致病，重组A A V 基因组序列上去除了大部分的野生型A A V 基因组元件，进一步保证了安全性；2. 免疫原性低：AA V2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA 技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；三、重组腺相关病毒载体系统简介汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 2AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System ）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。
ips操作指南-腺病毒版本
IPS操作指南第四版IPS操作指南--腺病毒版本IPS简介：iPS细胞是通过基因转染技术（gene transfection）将某些转录因子导入动物或入的体细胞使，体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonic stemcell,ESC）细胞样的多潜能细胞。
现在大多是通过病毒携带特定的转录因子进入体细胞内，来获得多能性干细胞。
2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。
他们把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。
用Retrovirus、Lentivirus诱导IPS成功的例子已经非常多，但是由于retrovirus和lentivirus的基因组整合性，往往伴随基因组的破坏与癌化。
用Lentivirus和retrovirus 建立的IPS子宫移植繁衍而成的克隆鼠往往都伴随着肿瘤的高发生率。
Adenovirus（腺病毒）是一类滴度极高，不整合基因组，可以简单实现高效感染的病毒载体，近年来以Adenovirus介导的IPS诱导已被证实成功且安全。
一、实验材料腺病毒OSKM四因子：Ad-OCT4、Ad-SOX2、Ad-KLF4和Ad-c-MYC；病毒扩增细胞：293A细胞；ES Feeder细胞：MEF（C57）。
二、实验仪器和耗材（一）实验仪器二级安全柜、37度培养箱、4度冰箱、液氮储存器、倒置显微镜、低温离心机。
耗材PBS、无菌水、明胶粉、DMEM培养基、FBS、非必须氨基酸、β-巯基乙醇、胰酶、血清替代物（SR）、mTESR1、T75培养瓶、无菌水、15ml离心管、50ml离心管，巴氏管等。
三、ips诱导方法（一）Feeder细胞1、Feeder细胞的分离（MEF）取妊娠13.5-14.5d的孕鼠，在无菌情况下取出胎鼠，去除鼠头，尾，四肢及内脏，然后用PBS进行冲洗。
miRNA腺病毒操作手册-推荐下载
miRNA腺病毒操作手册miRNA简介MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。
MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。
MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。
MiRNAs 来源于具有60-80 个核苷酸茎环结构的microRNA 前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。
MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。
ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。
microRNA前体腺病毒简介重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。
腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。
首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。
第二，病毒滴度高。
第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。
第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。
ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。
E1 基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。
由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。
pMir-microRNA precursor 是基于microRNA 前体表达系统的质粒。
microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。
为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。
腺相关病毒操作手册
腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）简介腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。
AA V的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有3个启动子(P5、P19和P40)和2个开放阅读读框(ORF)，rep和cap，如图1所示。
rep编码4个重叠的多功能蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，其中Rep78与Rep68参与AA V的复制与整合，Rep52和Rep40具有解螺旋酶和ATP酶活性，与Rep78、Rep68共同参与单链基因组的复制；cap编码的VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在AA V病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图1.AA V基因结构二、腺相关病毒的优点1.安全性高：迄今从未发现野生型AA V对人体致病，重组AA V基因组序列上去除了大部分的野生型AA V基因组元件，进一步保证了安全性；2.免疫原性低：AA V2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3.宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4.表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5.物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；（汉恒--AAV包装）三、重组腺相关病毒载体系统简介AAV是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。
在AAV Helper-Free System中，生产具有感染性的AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（如：E2A，E4等基因）大部分由pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。
腺病毒包装操作手册
汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1：汉恒生物腺病毒载体附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒） 附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*非常重要*）1) 腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2) 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3) 操作病毒时需要特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净。
4) 接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5) 如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。
6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。
7) 实验完毕后请用香皂清洗双手。
➢腺病毒储存与稀释的注意事项1）腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于 4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于 -80 ℃ 。
注：a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴度测定方法）。
2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于 4℃保存(一周内使用完最佳)。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
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腺病毒操作资料说明
1、AdEasy™ Adenoviral Vector System.pdf：这是过表达腺病毒（用于基因过表达）的操作说明书，作为操作指南；
2、AD-293 Cells.pdf：腺病毒包装细胞说明书，作为操作指南；
3、病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定方法，作为操作指南；
4、病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定方法，作为操作指南；
5、Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf：这是过表达腺病毒（用于基因过表达）的操作说明书，作为操作指南；
6、腺病毒扩增和纯化手册.pdf：腺病毒扩增和纯化方法，作为理论学习
7、腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染.doc：腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染操作指南；
8、C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf：磷酸钙转染方法；。