1000140药物分析第十一章抗生素1002

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二、鉴别试验
（一）呈色反应 –羟肟酸铁反应 青霉素及头孢菌素在碱性 中与羟胺作用，β-内酰胺环破裂生成羟肟 酸；在稀酸中与高铁离子呈色。 –茚三酮反应（侧链含-氨基酸结构） –与重氮苯磺酸的偶合反应（侧链含酚羟基） –硫酸-甲醛试验
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（二）各种盐的反应 钾、钠离子的火焰反应 有机胺盐的特殊反应（如普鲁卡因青霉 素的重氮化-偶合反应）
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聚合物——HPLC法
聚合物的检查采用分子排阻色谱法。分 子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱 的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、 凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶 （sephadex）和聚丙烯酰胺凝胶 （sepharose）等为填充剂。
现以头孢他啶中头孢他啶聚合物的测定 为例
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1. 色谱条件与系统适用性试验
第十一章 抗生素类药物分析
第一节 概述
特点：化学纯度较低, 同系物多，异构体 多，降解物多，稳定性差。 鉴别方法：生物学法，理化方法 特殊检查项目：异常毒性、热源或细菌内 毒素、降压物质、无菌，组分分析 ，聚合 物等。
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含量测定或效价测定 微生物学法——通过比较标准品与供试 品产生抑菌圈的大小来测定供试品的效 价。其原理恰好与临床应用要求一致， 更能确定抗生素的医疗价值。 对于分子结构复杂、多组分的抗生素， 生物学法是首选的效价测定方法。
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本法的优点： –灵敏、用量小，结果直观 –适用范围广：纯度好的、差的制品，已 知或新发现的抗生素均适用，同一类型 的抗生素不需分离，可一次测定其总效 价。缺点： –操作步骤多，定时间长，误差大等。3
✓ 理化方法 ——适用于提纯的产品以及化学结 构已确定的抗生素
优点：迅速、准确、有较高的专属性。
旋光性： 青霉素族分子中含有三个手性碳原子， 头孢菌素族含有两个手性碳原子，故都 具有旋光性。
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β-内酰胺环的不稳定性： β-内酰胺环是该类抗生素的结构活性中 心，其性质活泼，是分子结构中最不稳 定部分，其稳定性与含水量和纯度有很 大关系。在酸、碱、青霉素酶、羟胺及 某些金属离子（铜、铅、汞和银）或氧 化剂等作用下，易发生水解和分子重排， 导致β-内酰胺环的破坏而失去抗菌活性。
7 N1 O
2
*
CH3
CH3 COOH
6-氨基青霉烷酸
S
RCO HN *7 *6 5 4
AB
头孢菌素族
8 N1 2 3 O
CH2R1
COOH 7-氨基头孢菌烷酸
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酸性： 青霉素和头孢菌素分子中的游离羧基具 有相当强的酸性，大多数青霉素的pKa 在2.5～2.8之间，能与无机碱或某些有 机碱形成盐。
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流动相B—— 0.01%十二烷 基硫酸钠溶液
流动相A——含 3.5%硫酸铵的 0.01mol/L磷酸 盐缓冲液
A高聚物﹤A缔合物
缔合物
自身对照液
高聚物
样品液
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有关物质和异构体
例1 头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查：
–色谱条件与系统适用性试验：要求头孢呋辛酯A， B异构体之间、头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯 △3-异构体之间的分离度R﹥1.5。
–头孢呋辛酯A，B异构体、△3-异构体及E异构体峰 的相对保留时间分别约为1.0、0.9、1.2及1.7和 2.1。
–异构体——供试品色谱图中A异构体峰的面积与A、 B异构体峰的面积和之比应为0.48～0.55。
缺点： 对含有具同样官能团杂质的供试品不适用， 或需采取适当方法加以校正。而且当该法 是利用某一类型抗生素的共同结构部分的 反应时，所测得的结果，往往只能代表药 物的总的含量，并不一定能代表抗生素的 生物效价。
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第二节 β-内酰胺类抗生素
一、化学结构与性质
青霉素族
S
RCO HN
* 6
*5 4
3
AB
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自身对照外标法的原理： 该法是利用特定条件下β-内酰胺类抗生素可
以缔合成与高分子杂质有相似色谱行为的缔 合物，即在Kav=0处K表av=现有为效单分一配系的数色谱峰。 以药物自身为对照品，测定其在特定条件下 缔合时的峰响应指标； 然后改变色谱条件，测定样品，记录样品色 谱图中Kav=0处的高分子杂质峰的响应指标， 按外标法计算，即得样品中高分子杂质相当 于药品本身的相对含量。
（三）色谱法 高效液相色谱法（HPLC） 薄层色谱法（TLC） 中国药典收载的头孢菌素族药物和大多 数青霉素族药物采用HPLC法进行鉴别。
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（四）光谱法 IR——各国药典对收载的β-内酰胺类抗生素几乎均
采用了本法进行鉴别。 该类抗生素共有的特征峰：
– －内酰胺环羰基的伸缩振动（1750～1800） –仲酰胺的氨基、羰基的伸缩振动（3300cm-1±，
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2. 对照品溶液的制备：取头孢他啶对照品 适量，精密称定，加水制成含头孢他啶 100g/1mL的溶液，摇匀。
3. 测定法：取本品适量，精密称定，加水 制成含头孢他啶20mg/1mL的溶液，立 即进样200L，以流动相A为流动相进行 测定，记录色谱图；另取对照品溶液 200L注入液相色谱仪，以流动相B为流 动相，记录色谱图，按外标法计算，本 品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得 过0.3%。
用葡聚糖凝胶G-10（4排0阻～分12子0量m在）10为0填0左充右剂， 玻璃柱内径1.3～1.5cm，床体积50～60mL；
流动相A为含3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓 冲液（pH值7.0），流动相B为0.01%十二烷基 硫酸钠溶液；流速为每分钟1mL；
检测波长为254nm。
以流动相A为流动相，用1mg/mL蓝色葡聚糖 2000溶液进样200L进行测定，理论板数应不低 于900，拖尾因子在0.75～1.5，对照品溶液以流 动相B为流动相，重复进样200L，峰面积值的 相对标准差应小于5.0%。
1525 cm-1±，1680 cm-1±） –羧酸离子的伸缩振动（1600 cm-1±、1410
cm-1±） UV——利用最大吸收波长鉴定法或利用水解产物
的最大吸收波长鉴定法。
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三、特殊杂质的检查
本类抗生素的特殊杂质主要有高分子聚 合物，有关物质，异构体等，一般采用 HPLC法控制其量，也有采用测定杂质的 吸收度来控制杂质量的。