低温碱性蛋白酶高产菌株的选育与发酵条件研究
高产碱性蛋白酶菌株的筛选及酶学性质的研究
高产碱性蛋白酶菌株的筛选及酶学性质的研究高产碱性蛋白酶菌株的筛选及酶学性质的研究摘要：蛋白酶是一类广泛存在于生物体中的酶类，其具有多种功能。
碱性蛋白酶是一类pH值适宜碱性环境下活性较高的蛋白酶，应用广泛。
本研究旨在筛选出一株高产碱性蛋白酶的菌株，并对其酶学性质进行研究。
引言：蛋白酶在生物体内起着关键的生物调节和代谢调控作用。
碱性蛋白酶是一类活性较高、pH值适宜碱性环境下较为稳定的蛋白酶，被广泛应用于生物工程、制药、食品加工等领域。
因此，筛选高产碱性蛋白酶菌株并对其酶学性质进行研究具有重要意义。
材料与方法：本研究选取了富含烟碱的土壤样品作为实验用菌株的来源。
首先进行了初步筛选，将土壤样品分别接种于含有碱性蛋白酶基质的琼脂平板上，并在适宜的培养条件下进行孵育。
随后，对形成菌落的菌株进行二次筛选，通过培养基的碱性蛋白酶活性测定，筛选出活性较高的菌株，并进行进一步培养。
结果：经过初步筛选和二次筛选，从富含烟碱的土壤样品中分别筛选出了两株高产碱性蛋白酶的菌株。
其中，菌株A的碱性蛋白酶活性达到了每毫升1000 U，菌株B的碱性蛋白酶活性为每毫升800 U。
讨论：这两株高产碱性蛋白酶的菌株在富含烟碱的土壤样品中被筛选出来，表明烟碱可能对菌株具有诱导产碱性蛋白酶的作用。
此外，本研究所筛选出的菌株的蛋白酶活性较高，这对于蛋白质降解和利用具有积极的意义。
酶学性质：对菌株A和菌株B分别进行了酶学性质的研究。
结果表明，这两株菌株的碱性蛋白酶在pH 9.0的条件下具有较高的活性，其酶活性逐渐下降，当pH值低于7.0时基本失活。
在温度方面，菌株A的蛋白酶活性在40°C达到最高值，而菌株B的最适温度为45°C。
进一步的研究发现，菌株A的蛋白酶受到金属离子Cu2+的抑制，而菌株B的蛋白酶对Cu2+较为稳定。
结论：本研究成功筛选出两株高产碱性蛋白酶的菌株，并对其酶学性质进行了研究。
结果显示，这两株菌株的碱性蛋白酶具有较高的活性，适应性较强。
一株高产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及发酵条件的优化
作者简介： 崔洪霞 （ 】 ９ ７ ７ 一 ） ，女，黑龙江 尚志人，博： 士，副教授 ，主要研究方 向为微生物与生化药学，Ｅ ｍａ ｉ ｌ ：ｈ ｘ ｃ ｕ ｉ ＠ｙ ｓ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． Ｃ ／ Ｉ 。
一
株 高产碱性蛋 白酶海洋细菌 的筛选及 发酵条件 的优化
崔洪 霞 。 ’ ，李春 林 ，钱 龙 ，孙 滢 ，周艳艳 ，史云柯
（ １ ． 燕 山大学 环境 与化 学工程学 院，河北 秦 皇岛 ０ ６ ６ ０ ０ ４ ；２ ． 河北省应用化 学重点 实验 室，河北 秦皇 岛 ０ ６ ６ ０ ０ ４ ；３ ． 燕山大学 里仁学院 ，河北 秦皇 岛 ０ ６ ６ ０ ０ ４ ）
酶 的 强 弱顺 序 为 ：ｐ Ｈ 值 、培 养 时 间 、接 种 量 、装 液 量 ，菌 株 Ｓ ＤＬ ９在 较 佳 发 酵 条 件 下 的发 酵 液 的 最 大 酶 活 力 达 １ ９ ７ ． ５ ８ Ｕ／ ｍＬ。本 研 究 表 明 从 秦 皇 岛海 域 可 以获 得碱 性 蛋 白酶 高产 菌株 ，丰 富 了菌 种 资源 。
关键词：碱 性蛋 白酶；筛选 ；海泥 ；菌株 Ｓ ＤＬ ９ 中图分类号：Ｑ９ ３ ９ 文献标识码 ：Ａ ＤＯＩ ：１ ０ ． ３ ９ ６ ９ ￣ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ７ — ７ ９ １ Ｘ ． ２ ０ １ ３ ． ０ １ ． ０ １ ５
０ 引言
近 年来 ， 碱 性蛋 白酶 由于与传 统 的化 学催化剂 相 比具有 催化 能力强 、底物专 一性 高等优 点，已被 广泛 应用于制 革 、银回收 、医药 、食 品、饲 料 、化 学工业 、废物 处理等生产 及行业 。其最 早发现 于 猪胰 脏 中， 而 １ ９ ４ ５年又 发现于地 衣芽孢 杆菌 中 ， 开辟 了微生 物碱性 蛋 白酶 的来源 。 在碱 性蛋 白酶的
高产碱性蛋白酶低温菌的筛选及发酵
(1.School of Marine Science and Technology, Harbin Institute of Technology at Weihai, Weihai 264209; 2.Qingzhou Branch of Weifang Tobacco Co., Ltd of Shandong, Weifang 262500)
Abstract: In this study, an effective protease-producing bacterium, named Pseudoalteromonas sp. AN64 by 16S rDNA analysis, was screened from 123 antarctic strains. Growth condition tests showed that strain AN64 cultured at pH7.0~8.0 and 10 ℃ could produce the highest protease activity with carboxymethylcellulose as carbon source and peptone as nitrogen source. After 5 days culture under optimum conditions, the protease activity could reach 0.48 U/mL which was 1.8 times of the initial. Studies on the partial enzyme characters of crude protease showed that the protease had a temperature optimum 30 ℃ and a optimum pH of 9.0, and was a cold-active and alkaline enzyme. Key words: antarctic bacteria; alkaline protease; screening; ferment; enzymatic properties
碱性蛋白酶生产菌的育种及其液态发酵条件的研究
碱性蛋白酶生产菌的育种及其液态发酵条件的研究李祖明;李鸿玉;荣瑞芬;白志辉;王童;叶磊;厉重先;李丽云;李京霞【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2008(029)005【摘要】以短小芽孢杆菌1.894(Bacillus pumilus 1.894)为出发菌株,经紫外诱变育种,得到了产碱性蛋白酶较高的新菌株2080;并对其液态发酵条件和部分酶学特性进行了研究.结果表明,其较优的培养基组成为:菜粕1.5 %,干酪素1 %,D-果糖1%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O 0.02%,CaC12·2H2O 0.01%,pH 8.5;接种后,30℃,发酵84 h,酶产率可达4.04×106U/L.该酶的最适pH为10,最适温度为50℃,分别在pH 8-10和30℃～45℃范围内较稳定.【总页数】5页(P19-23)【作者】李祖明;李鸿玉;荣瑞芬;白志辉;王童;叶磊;厉重先;李丽云;李京霞【作者单位】北京联合大学师范学院,北京,100011;北京联合大学师范学院,北京,100011;北京联合大学师范学院,北京,100011;中国科学院生态环境研究中心,北京,100085;北京联合大学师范学院,北京,100011;北京联合大学师范学院,北京,100011;北京联合大学师范学院,北京,100011;北京联合大学师范学院,北京,100011;北京联合大学师范学院,北京,100011【正文语种】中文【中图分类】TS2【相关文献】1.碱性蛋白酶产生菌黄假单孢菌的分离、鉴定和产酶条件研究 [J], 刘文斌2.D-核糖生产菌的原生质体诱变育种及其发酵条件的研究 [J], 陈宁;李颖;刘淑云;张克旭3.产红色素真菌Monascus sanguineus的液态发酵条件研究 [J], 何亚涛;刘俊林;郑青波;柳玉瑛;罗琨映;高丹丹4.地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究：I.碱性蛋白酶高产菌的筛选及产酶条件初探[J], 胡承;彭勇5.白耙齿菌F036液态发酵产纤维素酶条件优化及纤维素酶酶学性质初步研究 [J], 肖瑶;杨建远;张炳火;王萍兰;杨云仙;查代明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及其发酵条件优化
产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及其发酵条件优化宋明徽;丛丽娜;王红英;姜启晨【期刊名称】《大连工业大学学报》【年(卷),期】2013(032)006【摘要】从大连海域的海参肠道中筛选得到一株产碱性蛋白酶较高的海洋细菌HS-A156,经形态学和16S rDNA序列分析初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(GenBank检索号KC166863).对菌株HS-A156的酶学性质进行初步研究,结果表明该菌株所产蛋白酶最适作用pH为9.0,在pH 8.o～11.0性能稳定;最适作用温度为40℃,在25～45℃具有良好的热稳定性.同时对该菌株产酶发酵培养基和发酵条件进行优化,确定了最适产酶培养基组成为葡萄糖1.5％、牛肉膏1.0％、酵母粉2.0％、CaCl20.05％;最佳发酵条件培养基初始pH 8.0、发酵温度30℃、接种量3％.经过优化后菌株HS-A156产碱性蛋白酶的酶活力达到538 U/mL,比优化前的产酶量提高了3.7倍.【总页数】5页(P404-408)【作者】宋明徽;丛丽娜;王红英;姜启晨【作者单位】大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034【正文语种】中文【中图分类】TS254.1;Q939.97【相关文献】1.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定 [J], 黄志强;林白雪;谢联辉2.海洋细菌产低温碱性蛋白酶菌株的筛选研究 [J], 吕明生;陈静;王淑军;陆兆新3.一株产低温碱性蛋白酶海洋细菌Pseudoalteromonas flavipulchra HH407的筛选与生长特性 [J], 李丹;陈丽;李富超;王淑军;李华钟4.一株产黄色素海洋细菌的筛选、鉴定及其发酵条件优化 [J], 王晓磊;荆康明;赵翠兰;刘洋;谢一方;唐薇;叶瑶蓓5.海洋细菌产低温碱性蛋白酶菌株的筛选研究 [J], 吕明生因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
低温碱性蛋白酶高产菌株的选育与发酵条件研究
低温碱性蛋白酶高产菌株的选育与发酵条件研究全桂静;尹黎献【期刊名称】《沈阳化工大学学报》【年(卷),期】2011(025)002【摘要】利用实验室保藏的枯草芽孢杆菌为出发菌株,采用紫外诱变进行选育,得到1株低温碱性蛋白酶的高产菌株,编号为B.Sub3.采用摇瓶液体发酵方式,考察碳源、氮源等营养条件及温度、发酵时间等发酵条件对发酵的影响,结果表明以上因素对低温碱性蛋白酶的生产均有影响.在单因素基础上设计4因素3水平的正交实验,确定B.Sub3的最佳发酵条件为：葡萄糖5 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母粉3 g/L,pH=8.0,接种比例为5%,50 mL三角瓶装液量为20 mL,32℃发酵28 h,发酵液的低温蛋白酶活力为2 231 U/mL【总页数】5页(P117-120,143)【作者】全桂静;尹黎献【作者单位】沈阳化工大学环境与生物工程学院,辽宁沈阳110142;沈阳化工大学环境与生物工程学院,辽宁沈阳110142【正文语种】中文【中图分类】TQ920.1【相关文献】1.海洋细菌Pseudoalteromonas flavipulchra HH407产低温碱性蛋白酶的发酵条件和酶学性质研究 [J], 吕明生;王淑军;李华钟;李丹;陈丽;房耀维2.低温碱性蛋白酶高产菌株的选育与发酵条件研究 [J], 全桂静;尹黎献3.紫外诱变原生质体选育碱性蛋白酶高产菌株的研究Ⅲ.诱变株的选育及其产酶条件的研究 [J],4.舟山海域一株产碱性蛋白酶海洋放线菌的鉴定、选育及发酵条件的初步研究 [J], 李鹏;苗增良;王健鑫5.紫外诱变原生质体选育碱性蛋白酶高产菌株的研究──1出发菌株的筛选及产酶条件的研究 [J], 冯清平;沈剑敏;高燕因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
土壤中高产蛋白酶菌株的筛选鉴定及发酵条件优化
土壤中高产蛋白酶菌株的筛选鉴定及发酵条件优化耿芳;杨绍青;闫巧娟;刘军;龚思怡;江正强【摘要】从海南土壤中筛选得到一株高产蛋白酶的菌株,并对其进行菌种鉴定、产蛋白酶发酵条件优化及蛋白酶分子质量测定.经筛选,得到一株高产蛋白酶的菌株,编号为CAUH83,蛋白酶活力达到126 U/mL.通过形态观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析,鉴定菌株CAUH83为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens).通过单因素试验优化,确定该菌株产蛋白酶的最优发酵条件:大豆粉3.0％、蔗糖3.0％、初始pH 6.0、培养温度30 ℃、培养时间48 h.在此优化发酵条件下,该菌株产蛋白酶酶活力达到1 932.3 U/mL,较优化前提高15.3倍.通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和酶谱分析表明该蛋白酶分子质量约51 kDa.%A strain with high yield protease was isolated from soil sample of Hainan. The identification, fermentation conditions optimization and molecular mass of the strain were determined. After screening, a strain CAUH83 with high yield protease was obtained and the enzyme activity was 126 U/ml. Through morphological observation, physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis, strain CAUH83 was identified asSerratia marcescens. The optimal fermentation conditions were optimized by single factor experiments as follows: soybean flour 3.0％, sucrose 3.0％, initial pH 6.0, culture temperature 30 ℃ and time 48 h. Under the optimal conditions, the highest protease activity of the strain was 1 932.3 U/ml, which increased 15.3 times higher than that of before optimization. The molecular mass of the protease was about 51 kDa by SDS-PAGE and protease zymogram analysis.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2018(037)004【总页数】6页(P66-71)【关键词】粘质沙雷氏菌;筛选鉴定;蛋白酶;发酵条件优化【作者】耿芳;杨绍青;闫巧娟;刘军;龚思怡;江正强【作者单位】中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学工学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083【正文语种】中文【中图分类】TS201.3蛋白酶(protelytic enzymes,EC 3.4)是催化肽键水解的一类酶,在食品、饲料、医药、化工等行业有着广泛的应用［1］。
蛋白酶高产菌株的筛选鉴定与酶学特性研究
蛋白酶高产菌株的筛选鉴定与酶学特性研究赵晓艳;曾志驰;穆丽丽;邓悦;王飞【摘要】以酪蛋白水解圈为筛选标记，在以酪蛋白为唯一氮源的平板上，从土壤中分离筛选到3株高产蛋白酶的菌株，经形态学鉴定和16S rRNA分析，将其分别鉴定为Bacillus sp．G1、Bacillus sp．G2、Stenotrophomonas sp．V1。
将这3株菌株的发酵液通过硫酸铵分级沉淀初步纯化后，其比酶活分别为22．21、19．10和16．03 U／mg。
菌株Bacillus sp．G1和Ba-cillus sp．G2所产蛋白酶的最适反应温度和最适反应pH值均为40℃和7．0；菌株Stenotrophomonas sp．V1所产蛋白酶的最适反应温度为70℃，最适酶反应pH值为7．5。
%Three bacteria strains producing protease were screened and isolated from soil by observation of clearing zones on casein agar plates, based on phenotypic and 16S rRNA gene phylogenetic analysis, G1, G2 and V1 were preliminary classed and named as Bacillus sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1.Bacill us sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1 were all aerobic strains.The proteases from Bacillus sp.G1, Bacillus sp.G2 and Stenotrophomonas sp.V1 were purified by the methods of ammonium sulfate precipitation, the specific activities of three proteases were up to 22.21 U/mg, 19.10 U/mg and 16.03 U/mg, respectively.The enzymes from Bacillus sp.G1 and G2 were optimally active at 40℃and in 20 mmol/L phosphate buffered saline buffer( PBS, pH 7.0) , and the alkaline protease from Stenotrophomonas sp.V1 was optimally active at 70℃and in 20 mmol/L PBS buffer ( pH 7.5) .【期刊名称】《江西农业学报》【年(卷),期】2016(028)004【总页数】7页(P32-38)【关键词】蛋白酶;筛选;鉴定;酶学特性;Bacillus sp.G1;Bacillussp.G2;Stenotrophomonas sp.V1【作者】赵晓艳;曾志驰;穆丽丽;邓悦;王飞【作者单位】江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045;江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045【正文语种】中文【中图分类】TQ925.2蛋白酶(Protease, EC 3.4)属于水解酶类,是最重要的三大工业用酶之一,销售额约占全球酶制剂市场的60%[1],被广泛应用于食品、酿造、医药、纺织、皮革、日用化学、洗涤剂、饲料以及水产加工等多个行业,在我国国民经济的发展中起着重要的作用[2]。
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第25卷第2期沈阳化工大学学报Vol．25No．22011．06JOURNAL OF SHENYANG UNIVERSITY OF CHEMICAL TECHNOLOGYJun．2011收稿日期：2010－09－03作者简介：全桂静（1975－），女，辽宁沈阳人，讲师，硕士，主要从事资源微生物的筛选和发酵研究．文章编号：2095－2198（2011）02－0117－04低温碱性蛋白酶高产菌株的选育与发酵条件研究全桂静，尹黎献（沈阳化工大学环境与生物工程学院，辽宁沈阳110142）摘要：利用实验室保藏的枯草芽孢杆菌为出发菌株，采用紫外诱变进行选育，得到1株低温碱性蛋白酶的高产菌株，编号为B．Sub 3．采用摇瓶液体发酵方式，考察碳源、氮源等营养条件及温度、发酵时间等发酵条件对发酵的影响，结果表明以上因素对低温碱性蛋白酶的生产均有影响．在单因素基础上设计4因素3水平的正交实验，确定B．Sub 3的最佳发酵条件为：葡萄糖5g /L ，蛋白胨5g /L ，酵母粉3g /L ，pH =8.0，接种比例为5%，50mL 三角瓶装液量为20mL ，32ħ发酵28h ，发酵液的低温蛋白酶活力为2231U /mL．关键词：低温碱性蛋白酶；枯草芽孢杆菌；选育；优化中图分类号：TQ920.1文献标识码：A 低温碱性蛋白酶是一类最适温度为15ħ，最适pH 值为碱性的蛋白酶，主要应用于加酶洗涤剂，在制革、丝绸等工业有广泛的用途［1］．目前加酶洗涤剂中主要添加的是中温碱性蛋白酶，其最适温度一般都在50ħ以上，而自来水的温度一般都在30ħ以下，洗涤时必须采用加热的水，给日常生活造成不便．若洗衣粉中加入低温蛋白酶，则可直接用自来水洗涤，既方便又节约能量．在能源紧缺的地区，一般都不会用温水洗涤，添加低温碱性蛋白酶的洗涤剂将有很好的应用前景和市场潜力［2］．微生物低温碱性蛋白酶的研究主要在近20年，产低温碱性蛋白酶的微生物主要集中在一些极端环境中，如深海的水和泥，深海的鱼和贝，以及冰川、高山、南极和北极的水和泥中，，主要有假单胞菌属（Pseudomonas ）、芽孢杆菌属（Bacil-lus ）、黄杆菌属（Flavobacterium ）、异单胞菌属（Alteromonas ）等［3－5］．选育优良生产菌株是提高低温碱性蛋白酶产量、降低成本的主要条件．本文由性状优良的枯草芽孢杆菌出发［6－8］，选育低温碱性蛋白酶高产菌株，并对发酵条件进行初步优化．1材料与方法1.1材料1.1.1菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ），购于中国普通微生物学保藏中心，实验室传代保藏．1.1.2培养基配方［2，9］富集培养基（g /L ）：蛋白胨10，酵母膏5，牛肉膏5，pH =8.5．酪蛋白培养基（g /L ）：干酪素10，琼脂20，pH =10．种子培养基（g /L ）：NaCl 5，牛肉膏3，蛋白胨10，pH =7.2 7.4．发酵培养基（g /L ）：蛋白胨5，酵母粉3，葡萄糖5，pH =8.5．1.2实验方法1.2.1菌种诱变用3mL 无菌水洗下培养24h 的枯草芽孢杆菌斜面上的细胞，倒入含玻璃珠的无菌三角瓶中充分振荡将细胞打散，制成单细胞悬液．将菌悬液置于无菌培养皿，在15W 紫外灯的诱变箱中诱变120s ［10］，加入3mL 加倍牛肉膏蛋白胨液体培养基混匀，用黑纸包裹培养皿，118沈阳化工大学学报2011年于37ħ恒温培养箱中培养2h，取菌悬液划线于酪蛋白培养基平板上，于20ħ下恒温培养48h．1.2.2菌种复筛用接种环取一环初筛得到的菌株，接种于装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30ħ、180r/min，恒温振荡培养48h，进行蛋白酶活力测定．1.2.3粗酶液活力测定发酵液于低速离心机4000r/min离心10 min，去除细菌细胞，收集上清液作为粗酶液进行酶活性测定．低温碱性蛋白酶活性采用紫外法测定［2，11］．对照氨基酸标准曲线换算出酪氨酸的量［12］．酶活力的定义为20ħ、pH=8.0条件下，每分钟催化酪蛋白生成1μg酪氨酸所需的酶量为一个单位U［11］．1.2.4低温碱性蛋白酶生产条件的研究营养条件研究：以常用糖类及无机、有机含氮化合物分别作为碳源和氮源，50mL三角瓶中装20mL液体培养基按5%比例接种，在30ħ，180r/min的条件下恒温振荡培养24h，测定酶活．发酵条件优化：在确定营养条件基础上，考察各种因素对低温碱性蛋白酶生产的影响，以优化发酵条件．正交实验设计：根据单因素实验结果，设计4因素3水平的正交实验，见表1．正交实验的验证实验：按以上正交实验结果的最优配比进行发酵重复实验．表1正交实验因素水平表Table1Factors and levels of orthogonal test 水平m（蛋白胨）/g pH t/ħ装液量/mL1 2.07.528152 2.58.030203 3.08.532252结果与讨论2.1低温碱性蛋白酶生产菌株的筛选经紫外诱变后得到10株产低温碱性蛋白酶的菌株，经过5次传代后得到4株性状比较稳定的菌株．液体发酵24h，测定蛋白酶活力，结果见图1．由图1可知3号菌株产酶的能力最强．选择3号菌株作为出发菌株，将菌株编号为B．Sub3．图1初筛菌株的蛋白酶活力Fig．1Proteases of early screening strains2.2产酶条件的优化2.2.1碳源对产酶的影响培养基的碳源种类对产酶有一定的影响，不同碳源对产酶的影响见图2．从图2可以看出：以葡萄糖为碳源时发酵液的酶活力最高；以甘油为碳源时产酶量最低．图2碳源对产酶的影响Fig．2Effect of carbon source on the productivity of enzyme 2.2.2氮源对产酶的影响考察蛋白胨、硫酸铵、牛肉膏、硝酸钾及酪素等不同含氮物质对发酵产酶的影响，结果见图3．由图3可知：不同氮源对产酶的影响不大，产酶的最佳氮源为蛋白胨，酪素次之，牛肉膏最低．图3氮源对产酶的影响Fig．3Effect of nitrogen source on the productivityof enzyme第2期全桂静，等：低温碱性蛋白酶高产菌株的选育与发酵条件研究1192.2.3pH值对产酶的影响确定最佳碳源和氮源后，考察pH值对产酶的影响，结果见图4．由图4可以看出：pH值对菌株产酶的影响较大，产酶的最佳pH值为8.0，酶活可以达1896U/mL，在pH值为7.0时细菌的产酶最差，酶活仅为1500U/mL．在pH值为5.5 7之间时，酶活随pH值的增大而减小，pH 值在7 7.5时酶活随着pH值的增大而增大，当pH值达到8.5时，不适应菌株的生长，所以酶活有所降低．图4初始pH值对产酶的影响Fig．4Effect of initial pH on the productivity of enzyme 2.2.4温度对产酶的影响利用确定的培养基条件，接种后分别在20ħ，25ħ，30ħ，35ħ，40ħ下发酵培养，培养24h后测定其酶活．结果见图5．从图5可以看出温度对产酶的影响较大．产酶的最佳温度为30ħ，酶活为2240U/mL．在温度为25ħ时酶活最低，酶活为2195U/mL．图5温度对产酶的影响Fig．5Effect of temperature on the productivity of enzyme 2.2.5发酵时间对产酶的影响将上面确定的培养基分别置于30ħ下摇床培养20h、22h、24h、26h、28h、30h，测定其酶活，结果见图6．由图6可以得出产酶的最佳发酵时间为28h，发酵时间为30h时酶活最低．发酵时间低于28h，酶活随着发酵时间的增大而增大，当发酵时间高于28h时，蛋白酶的酶活又降低．原因是发酵时间过少细菌还未达到稳定期，处在延滞期或者指数期，细胞内的初生代谢产物还未达到最大值，产酶量也未达到最大值．发酵时间过长，培养基中的营养物质消耗殆尽，细菌将分解蛋白酶等物质为其提供能量，细胞内分解代谢大于合成代谢，导致酶活降低．图6发酵时间对产酶的影响Fig．6Effect of fermentation time on the productivityof enzyme2.2.6正交实验结果根据单因素实验结果，以葡萄糖为碳源，蛋白胨为氮源，进行4因素3水平的正交实验来确定最佳培养基，正交实验结果如表2所示．表2正交实验结果Table2Results of orthogonal test水平A B C Dm（蛋白胨）/gpH t/ħ装液量/mL酶活力/（U·mL－1）1 2.07.5281519202 2.08.0302020723 2.08.5322516644 2.57.5302519765 2.58.0321521206 2.58.5282020687 3.07.5322020208 3.08.0282519609 3.08.530151804K11980197219841948K22056296419642064K31928192820201952R12012848108由表2可知，A2B2C3D2为优化组合，酶活可达到2120U/mL；由极差R可以看出，培养基的初始pH值对产酶的影响最大，其次分别为蛋白胨浓度，装液量，温度．适合B．Sub1发酵生产低温蛋白酶的培养基配方为葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，pH=8.0；发酵条件为32120沈阳化工大学学报2011年ħ，50mL三角瓶装液量为20mL发酵32h．2.2.7正交实验的验证实验结果按上述正交实验最优配比：0.5%的蛋白胨，pH=8.0，温度为32ħ，装液量为20mL/50 mL三角瓶，进行4组平行实验，结果见表3．由表3可知：在此条件下蛋白酶的最高活力是2231U，最低的为2149U，说明选育得到的菌株性能比较稳定．目前，低温碱性蛋白酶的研究较少，与枯草芽孢杆菌发酵生产碱性蛋白酶［8］相比，发酵液的酶活力相当或略高，具有深入研究的价值．表3正交实验验证实验结果Table3Results of the demonstration test aboutorthogonal test水平酶活/（U·mL－1）1223122205321493结论通过诱变筛选，共得到5株低温碱性蛋白酶的生产菌株．利用250mL摇瓶液体发酵完成复筛，得到产低温碱性蛋白量最高的一株枯草芽孢杆菌，且将其命名为B.sub3．该菌株的最佳产酶培养基配方为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，pH 值为8.0；发酵条件为：50mL三角瓶中装20mL 液体培养基，接种比例为5%，培养温度为32ħ，培养时间为28h，发酵液中低温碱性蛋白酶活力可以达到2231U/mL．参考文献：［1］薛林贵．我国碱性蛋白酶的应用及研究发展［J］．微生物学通报，1997，24（6）：370－371．［2］万琦，陆兆新，高宏．低温碱性蛋白酶菌株的筛选及产酶条件的研究［J］．微生物学杂志，2002，22（5）：16－18，24．［3］杨胜远，陆兆新．微生物低温碱性蛋白酶的研究进展［J］．食品与发酵工业，2004，30（4）：93－98．［4］张锐，曾润颖．极端微生物产碱性蛋白酶菌株的筛选及产酶条件的研究［J］．微生物学通报，2001，28（4）：5－9．［5］吕明生，陈静，王淑军，等．海洋细菌产低温碱性蛋白酶菌株筛选研究［J］．江苏食品与发酵，2004（1）：7－10．［6］马明，杜金华．枯草芽孢杆菌酶在工业生产中的应用［J］．山东科学，2006，19（3）：36－38．［7］邱秀宝，程秀兰，袁影．嗜碱性芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究［J］．微生物学通报，1988，15（3）：101－104．［8］姚刚，程建军，孙鹏，等．枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的研究［J］．食品科学，2009，30（23）：347－351．［9］那淑敏，余茂效．一株产碱性蛋白酶菌株的选育及其发酵条件的研究［J］．微生物学报，1988，28（3）：129－133．［10］鞠华伟，江连洲，王秋京，等．高产碱性蛋白酶枯草芽孢杆菌菌株选育及其水解条件的研究［J］．食品工业科技，2007，28（8）：109－111．［11］张龙翔，张庭芳，李令媛，等，生化实验方法和技术［M］．2版．北京：高等教育出版社，1996：177－178．［12］房丽华，张健，仲伟珍，等．海洋低温碱性蛋白酶的刺激性研究［J］．海洋水产研究，2000，21（4）：94－101．［13］Gerday C，Aittaleb M，Arpigny J L，et al．Psychro-philic Enzymes：A Themodynamic Challenge［J］．Biochi．Biophy．Acta，1997，1342（2）：119－270．［14］Hoshino T，Ishizaki K，Sakamoto T，et al．Isolation of a Pseudomonas Species from Fish 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Protease-producing Strainand Its Enzyme-producing ConditionQUAN Gui-jing，YIN Li-xian（Shenyang University of Chemical Technology，Shenyang110142，China）Abstract：The strains of producing Low-temperature alkaline protease were breeded and the conditions of fermentation were studied．The initial strains were Bacillus subtilis，which was preserved in microbiolo-gy laboratory．Strains were breeded by UV mutagenesis，and one strain was obtained，labeling B．Sub3．The nutrition conditions were examined and the results showed that the composition of the fermentation medium was glucose5g/L，peptone5g/L，yeast power3g/L，pH8.0．The conditions of fermentation were optimized，and the results showed that the optimal fermentation condition was5%inoculation a-mount in10mL of medium filled in50mL flasks for28h．The production of breeding strains was consid-erable，and the activity of low-temperature alkaline protease reached2231U/mL at this optimal fermenta-tion condition．Key words：low-temperature alkaline protease；Bacillus subtilis；breeding；optimization。