实验六 米氏常数
米氏常数测定(精)
COOCH2 NHCH2OH
HCHO
COOCH2 NH(CH2OH)2
试剂器材
试剂
1. 10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）： 四种不同［S］的酪蛋白标准溶液。 2. 中性甲醛溶液：75mL分析纯甲 醛加15mL 0.25%酚酞乙醇溶液， 以0.1M NaOH滴至微红，密闭于 玻璃瓶中。（自己配制） 3. 0.25%酚酞乙醇溶液： 4. 标准0.1M NaOH溶液。 5.胰蛋白酶溶液（已配好）
液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。
利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出V与 Km值。
注意事项
（1 ）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种， 如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速 逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研 究酶的活力以酶促反应的初速度为准。
此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底 物浓度 之间的定量关系。
双倒数作图法测定Km值： 1 Km 1 1 v V [S] V
胰蛋白酶的性质 胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精 氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解， 产生自由氨基端。
氨基的测定
甲醛滴定法
COOCH2 NH2
HCHO
实验十六
底物浓度对酶促反应速度的影响 ——米氏常数的测定
目的要求
（1）了解底物浓度对酶促反应的影响。
（2）掌握测定米氏常数Km的原理和方法
实验原理
Km定义： Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时 所对应的底物浓度。
Km的意义
Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同，同
一种酶与不同底物反应Km值也不同。
米氏常数实验报告
米氏常数实验报告米氏常数实验报告引言：米氏常数是物理学中的一个重要常数，它描述了光在真空中的传播速度。
在本次实验中，我们将通过测量光的传播时间和光程差来确定米氏常数的数值。
通过这个实验，我们将更深入地了解光的性质和光在空间中的传播规律。
实验目的：本实验的目的是通过测量光的传播时间和光程差来确定米氏常数的数值，并验证光在真空中的传播速度是否恒定。
实验器材：本实验所需的器材包括：激光器、分光镜、反射镜、光电探测器、计时器等。
实验步骤：1. 首先，我们将激光器置于实验室的一端，并将其打开。
确保激光器产生的光束是稳定的。
2. 接下来，我们将分光镜放置在激光器的光路中，并调整其角度，使得光束被分光镜分为两束相等的光束。
3. 将两束光束分别引导至反射镜，并使其分别反射回来。
4. 在光束返回的路径上，我们将安装光电探测器，并将其与计时器相连。
5. 开始实验时，我们同时启动激光器和计时器，并记录下光束从激光器发出到光电探测器接收到的时间。
6. 重复实验多次，取平均值作为最终的测量结果。
实验结果：通过多次实验测量，我们得到了光的传播时间和光程差的数据。
根据这些数据，我们可以计算出米氏常数的数值。
讨论与分析：在本次实验中，我们得到了光的传播时间和光程差的数据，进而计算出了米氏常数的数值。
通过比较实验结果与已知的米氏常数数值，我们可以验证光在真空中的传播速度是否恒定。
此外，本实验还可以用于研究光在不同介质中的传播速度。
通过将光束传播到不同介质中，我们可以测量光的传播时间和光程差，并计算出不同介质中的米氏常数。
这有助于我们更深入地了解光在不同介质中的传播规律。
结论：通过本次实验，我们成功地测量了光的传播时间和光程差，并计算出了米氏常数的数值。
实验结果与已知的米氏常数数值相符，验证了光在真空中的传播速度是恒定的。
此外，本实验还为研究光在不同介质中的传播速度提供了一种方法。
总结：米氏常数实验是一项重要的实验，通过测量光的传播时间和光程差，我们可以确定光在真空中的传播速度。
生化实验六 过氧化氢酶米氏常数的测定
过氧化氢酶米氏常数的测定
生命科学学院11级拔尖班
111070094 张茜一、实验目的
1.了解米氏常数的测定方法
2.学习提取生物组织中的酶
二、实验原理
1.实验中的反应
H2O2被过氧化氢酶分解出H2O 和O2, 未分解的H2O2用K MnO4在酸性环境中滴定, 根据反应前后的浓度差可以算出反应速度:
2H2O2酶
−→2H2O + O2
2KMnO4+5H2O2+3H2SO4 −→2MnO4+K2SO4+8H2O+5O2
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶, 以1/v ∼1/[S]作图求K m.
2.米氏反应动力学
米氏方程(Michaelis-Menten Equation):
1 / 4
三、实验试剂
1. 0.02mol/L 磷酸缓冲溶液(pH=7.0): 实验室提供.
2. 酶液: 称取马铃薯5g, 加缓冲液10mL, 匀浆过滤.
3. 0.01107mol/L 高锰酸钾.
4. 0.098mol/L H2O2.
5. 25%H2SO4.
四、实验操作
取6 只锥形瓶, 按表1 的顺序加入试剂.
先加好过氧化氢和蒸馏水, 加酶液后立即混合, 依次记录各瓶的起始反应时间.
反映到达5min 立即加入硫酸终止反应, 充分混匀. 用 0.0109mol/L 的 KMnO4 溶液滴定瓶中剩余的过氧化氢至微红色, 记录消耗的高锰酸钾体积.
五、实验结果与讨论
1.
表2: 实验结果和计算结果
K m = 斜率/截距=0.03479
4 / 4。
【米氏常数】 米氏常数测定实验的报告.docx
【米氏常数】米氏常数测定实验的报告.docx米氏常数是一个经验参数，它是用于测量基质和溶质之间相互作用的重要参数。
米氏常数的测定涉及到溶质和基质的相互作用，主要是通过溶解度进行测定。
下面就是本实验的报告。
实验背景米氏常数是用来描述溶质在溶液中浓度度量的非线性关系的参数。
米氏方程如下：Ksp = [A+]^m [B-]^n其中Ksp是溶解度积常数，[A+]和[B-]分别表示电离度为1的正离子和负离子的浓度，m和n分别为正离子和负离子在配位物中的摩尔数。
溶解度积（或离解平衡常数）是可以直接从溶解度数据中获得的参数，这些参数是根据溶解度测量推导出来的，通常采用天平法或者滴定法进行测量。
实验目的本实验的目的是测定铅酸盐的米氏常数，用溶解度法测定铅酸盐的溶度积常数，并根据米氏方程计算米氏常数。
实验原理铅酸盐在水溶液中的离解方程式：PbSO4(s) ⇆ Pb2+(aq) + SO42-(aq)溶解度积常数是根据溶解度求出的：对于低溶度度超取6.5，我们软件系统一压根对孔直接忽略其离子反应方程中的y。
实验流程1. 准备1 L的稀铅酸溶液（2 × 10-5 mol/L）2. 取0.2 mL的稀铅酸热解，目测重量大概是0.03 g左右。
3. 将稀铅酸加入100 mL的无铅纯水溶液中，然后调整pH值，使稀铅酸与水达到最大的平衡浓度。
4. 记录溶解度数值，并计算铅酸盐的溶解度积常数。
实验结果1. 初始重量为0.03 g的铅酸盐溶解后，其溶解度为5.5 × 10-5 mol/L。
2. 根据铅酸盐的溶解度计算溶解度积常数Ksp为3.025 × 10-9。
3. 根据米氏方程Ksp = [Pb2+][SO42-]，计算出米氏常数为1.79。
米氏常数测定实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握米氏常数（Km）及其与最大反应速度（Vmax）的关系。
2. 通过实验测定酶的米氏常数，了解酶与底物之间的亲和力。
3. 学习并掌握酶促反应动力学的基本原理和实验方法。
二、实验原理米氏常数（Km）是酶的特征性常数，表示酶与底物结合的亲和力。
在一定的实验条件下，酶促反应的初速度（v）与底物浓度（[S]）之间的关系可用米氏方程表示：\[ v = \frac{V_{max} [S]}{Km + [S]} \]当底物浓度很低时，酶促反应速度与底物浓度成正比，随着底物浓度的增加，反应速度逐渐加快，但增速逐渐减慢。
当底物浓度增加到一定程度时，反应速度达到最大值（Vmax），此时酶已全部被底物饱和。
本实验采用分光光度法测定酶的米氏常数。
实验中，通过改变底物浓度，测定不同浓度下酶促反应的初速度，根据米氏方程绘制v/[S]对1/[S]的曲线，通过线性回归分析求出曲线的斜率和截距，进而计算出Km和Vmax。
三、实验材料与仪器材料：1. 酶制剂（如蔗糖酶、淀粉酶等）2. 底物溶液（如葡萄糖溶液、淀粉溶液等）3. 碳酸盐缓冲液4. 4-氨基安替比林5. 铁氰化钾6. 0.1 mol/L NaOH溶液7. 葡萄糖标准溶液仪器：1. 分光光度计2. 移液管3. 移液器4. 恒温水浴5. 试管6. 比色皿四、实验步骤1. 制备酶溶液：将酶制剂溶解于适量的碳酸盐缓冲液中，调节pH值至最适值，稀释至一定浓度。
2. 制备底物溶液：将底物溶液稀释至不同浓度，备用。
3. 测定酶促反应初速度：a. 将不同浓度的底物溶液分别加入试管中，加入适量的酶溶液。
b. 将试管放入恒温水浴中保温一段时间。
c. 取出试管，立即加入适量的4-氨基安替比林和铁氰化钾，充分混匀。
d. 在分光光度计上测定溶液的吸光度，记录数据。
4. 数据处理：a. 以底物浓度[S]为横坐标，酶促反应速度v为纵坐标，绘制v/[S]对1/[S]的曲线。
b. 对曲线进行线性回归分析，求出曲线的斜率和截距。
米氏常数名词解释生物化学
米氏常数名词解释生物化学
米氏常数是生物化学中一个重要的参数，用于描述酶催化反应
速率的特性。
它也被称为酶的米氏常数、Michaelis-Menten常数或Km值。
米氏常数是由酶底物与酶结合形成酶底物复合物的速率常数。
它是一个测量酶底物复合物形成和解离速率之间平衡的指标。
米氏
常数的单位通常是摩尔/升。
米氏常数的数值越小，表示酶对底物的亲和力越强，底物与酶
结合形成酶底物复合物的速率越快。
反之，米氏常数越大，表示酶
对底物的亲和力越弱，底物与酶结合形成酶底物复合物的速率越慢。
米氏常数与酶底物复合物形成速率以及酶底物复合物解离速率
密切相关。
它在酶动力学研究中起到了至关重要的作用，可以帮助
我们理解酶催化反应的速率限制步骤以及酶与底物之间的相互作用。
米氏常数的测定通常需要进行一系列实验，通过测量不同底物
浓度下酶催化反应的速率来确定。
通过绘制米氏常数与底物浓度的
关系曲线，可以得到酶对底物的亲和力以及酶的催化效率。
总之，米氏常数是生物化学中用于描述酶催化反应速率特性的重要参数，它能够帮助我们理解酶底物相互作用以及酶催化反应的速率限制步骤。
酶的米氏常数测定实验报告
酶的米氏常数测定实验报告背景酶是一种生物催化剂，能够加速化学反应的速率。
酶的活性常常通过测定其米氏常数来评估，米氏常数也被称为酶的催化效能常数。
米氏常数能够反映出酶与底物之间的亲和力以及酶对底物的催化速率。
米氏常数（Km）表示在酶浓度不变的情况下，酶对底物的亲和力。
它是底物浓度达到一半时的酶活性的浓度。
Km值越小，说明酶与底物结合的亲和力越大，反之亦然。
在本次实验中，我们选择使用酸性磷酸酯酶作为模型酶，它催化对硫酸酚酸酯的水解反应。
通过测定酶的活性随底物浓度变化的情况，来确定酶的米氏常数。
实验设计实验材料•酸性磷酸酯酶提取物•磷酸二氢钠溶液•氯化亚铁(III)溶液•硫酸酚酸酯溶液•无水醋酸溶液•pH 7缓冲溶液实验步骤1.准备一系列不同浓度的硫酸酚酸酯溶液（如0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM等），并标记每个溶液的浓度。
2.分别向多个试管中加入相同体积的pH 7缓冲溶液、酸性磷酸酯酶提取物和不同浓度的硫酸酚酸酯溶液，混合均匀。
3.将试管放入恒温水浴中，保持温度稳定。
4.在0、5、10、15等不同时间点，取出一部分反应液，立即加入冰冷的无水醋酸溶液停止反应。
5.加入氯化亚铁(III)溶液以生成可检测的产物。
6.使用分光光度计测定反应液的吸光度，根据吸光度与产物浓度的线性关系，得到各个时间点的反应速率。
7.根据浓度和时间的关系，绘制酶活性随底物浓度变化的图谱。
8.根据实验数据，计算出酶的米氏常数。
分析通过实验数据的收集和处理，我们得到了酶活性随底物浓度变化的曲线图。
根据实验结果，我们可以进行如下分析：1.绘制酶活性随底物浓度变化的图谱，可以观察到反应速率随着底物浓度的增加而增加，但当底物浓度达到一定水平时，反应速率趋于饱和，不再显著增加。
这可能是由于酶与底物结合的位点有限，或者由于酶的饱和度导致的。
2.根据实验数据，我们可以使用米氏方程来计算酶的米氏常数。
米氏方程可以表示为：其中V是反应速率，Vmax是最大反应速率，[S]是底物浓度，Km是米氏常数。
六、脲酶米氏常数简易测定2010(精)
米氏常数的意义
• 由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时, 即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。 • 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物 浓度。 • 因此,米氏常数的单位为mol· L-1。 • 不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常 数。 • Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的 缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。 • Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度 小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化 活性高。 • 通过Km值的测定，可鉴定酶的各种底物，Km值最小者为酶 最佳底物，即天然底物。
充分摇匀，室温下静置5min，过滤，另取5支试管，同上编号，加入以下试剂 滤液（ml） 双蒸水（ml） 显色液（ml） 1 2 0.75
迅速摇匀，用分光光度计在420nm下测定各管A值。
4.2 数据处理
• 各管在420nm测定OD420nm值。 • 由于光密度（OD420nm）与显色，显色与底物浓度成正比， 反应时间均为15min。故以1/A取代1/V为纵坐标作图。 • 测定所用单位为Km单位g· L-1 。 • 由1/A对1/[S]作图，求得回归方程，计算α-淀粉酶催化 可溶性淀粉溶解的米氏常数Km。
V max [ S ] V Km [ S ]
• 其中，V为酶促反应速度；Vmax为最大反应反应速度（与V 的单位相同, mol· L-1· min-1）； [S]为底物浓度（mol· L-1）； Km为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一 半时的底物浓度,即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。 • 在酶促反应中，底物在低浓度情况下，反应相对于底物是 一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于 中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应 向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度[S] 逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。下图为 米氏方程的模拟作图：
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• 试剂：
10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）、中性甲醛溶 液 、 0.25% 酚 酞 加 50% 乙 醇 溶 液 、 标 准 0.1M NaOH溶液、胰蛋白酶溶液
(一)V-S曲线
❖ 在低底物浓度时, 反应速度 与底物浓度成正比，为一 级反应。
V初 V max
❖ 底物浓度增大与速度的增 加不成正比,为混合级反应.
❖ 当底物浓度达到一定值， 几乎所有的酶都与底物结
合后，反应速度达到最大
值（V max），此时再增
加底物浓度，反应速度不 再增加，表现为零级反应。
底物浓度对酶促反应初速度的影响
实验步骤
1．取50mL三角瓶4个，加入5mL甲醛与1滴酚 酞（pH8-10），以0.1M标准NaOH滴定至 微红色，4个瓶颜色应当一致，编号。
2．量取40g/L酪蛋白50mL，加入一150mL三 角瓶，37℃保温10分钟，同时胰蛋白酶液也 在37℃保温10分钟，然后吸取5mL酶液加到 酪蛋白液中。（同时计时！）充分混合后立即 取出10mL反应液（定为0时样品）加入一含 甲醛的小三角瓶中（1号）加10滴酚酞；以 0.1M NaOH滴定至微弱而持续的微红色。在 接近终点时，按耗去的NaOHmL数，每mL加 一滴酚酞，再继续滴至终点，记下耗去的 0.1M标准NaOH mL数。
低
（二）米氏常数
实验原理
• 酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方 程来表示：
Vmax [S] V= Km + [S]
• v──反应初速度（微摩尔浓度变化/min）； • Vmax──最大反应速度（微摩尔浓度变化/min）；
• ［S］──底物浓度（mol/L）； • Km──米氏常数（mol/L）。
本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白 为例，采用Linewaeaver―Burk 双倒数作图法测定Km值。胰蛋白 酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L精氨酸或者L-赖氨酸）的羧基所 形成的肽键水解。水解时有自由 氨基生成，可用甲醛滴定法判断 自由氨基增加的数量而跟踪反应， 求得初速度。
-1/Km
-4
0.8
0.6
1/v
实验六
底物浓度对酶促反应速度的影响 —米氏常数的测定
实验目的
1.了解底物浓度对酶促反应的影响。
酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响 酶反应速度的各种因素的科学。
影响酶反应速度的因素有： 底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂、抑制剂等。
2.掌握测定米氏常数Km的原理和方法。
实验原理
底物浓度对酶促反应速度的影响
实验步骤
3.在1分钟、2分钟、6分钟时，分别取出10mL 反应液，加入2号、3号、4号小三角瓶，同上 操作，记下耗去NaOH mL数。
以滴定度（即耗去的NaOH mL数）对时间 作图，得一直线，其斜率即初速度为V40（相 对于40g/L的酪蛋白浓度）。
4.然后分别量取30g/L、20g/L、10g/L的酪蛋 白溶液，重复上述操作，分别测出V30、V20、 V10。 利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出 Vmax与Km值。
0.4
0.2
1/Vmax
0.0
-2
0
2
4
6
1/[S](1/mmol.L-1)
8 10
曼尼希反应（Mannich反应）
❖ 曼尼希反应，也称作胺甲基化反应，是含有活泼氢的化合物 （通常为羰基化合物）与甲醛和二级胺或氨缩合，生成β-氨 基（羰基）化合物的有机化学反应。甲醛是最小的含氧有机 物，具有较高的反应活性，可以和带有—OH（羟基）、— SH（巯基）、—NH2（氨基）基团的分子发生亲核加成反 应，最终甲醛作为亚甲基（—CH2—）的提供者，与上述基 团中的两个基团反应，使自由的分子链被甲醛交联起来
思考题
1.试述底物浓度对酶促反应速度的影响。 2.在什么条件下，测定酶的Km值可以作为
鉴定酶的一种手段，为什么？ 3.米氏方程中的Km值有何实际应用？
实验原理
• 这个方程表明当已知Km及Vmax时，酶反应速度与
底物浓度之间的定量关系。Km值等于酶促反应速度 达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度。不同 的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也 不同。
• Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值 大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大。测 Km值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的 Km值在0.01～100mmol/L。
米氏常数的测定
基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的 直线方程，再用作图法求出Km。
例：双倒数作图法（Lineweaver-Burk法） 米氏方程的双倒数形式：
➢ 米氏常数Km的测定：
取米氏方程式的倒数形式：
斜率=Km/Vmax
1.0
1 Km 1 1
= +
V Vmax [S] Vmax
实验步骤
（1）实验表明，反应速度只在最初一段时间内 保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速 度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低， 产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反 应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。 因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。
（2）本实验是一个定量测定方法，为获得准确 的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误 差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进 行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的 加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时 间。
酶的Km在实际应用中的意义
❖ 鉴定酶：通过测定Km，可鉴别不同来源或相同来 源但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同 反应的酶是否是属于同一种酶。
❖ 判断酶的最适底物（天然底物） 。 ❖ 计算一定速度下底物浓度。 ❖ 了解酶的底物在体内具有的浓度水平。 ❖ 判断反应方向或趋势。 ❖ 判断抑制类型。