双倒数作图法测米氏常数
蔗糖酶米氏常数的测定
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5
【操作步骤】 1．葡萄糖标准曲线的制定
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6
2．底物浓度和初速度υ测定
① 取试管8支编号，按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入试管，
于37℃水浴中保温10min。一定量酶液同一水浴中保温约10min。
② 于各管中依次按同样间隔(0.5min)加入已保温过的酶液1.0mL，
计时，立即摇匀，在37℃中准确温浴5min。
③ 按同样次序和时间间隔，加入1mL 0.5mol/L NaOH，摇匀，终止
为横坐标，以1/v为纵坐标作图，绘出一条直线，外推至
横轴相交，横轴截距即为-1精/选Kppmt 。
1
v
VMAX
1/2VMAX
Vmax•[S] V=
Km + [S]
Km
底物浓度与反应速度关系曲线
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[S]
2
精选ppt
3
还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应：
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4
【仪器与试剂】
反应。
④ 吸取反应物1.0mL，加入盛有3.0mL 3，5-二硝基水杨酸试剂和
1.0mL水的试管中混匀，放入沸水浴中加热5min，冷却后稀释至
25mL，摇匀，在540nm比色测定A值。
⑤ 以A值对应的葡萄糖量为相对反应速度，以1/[S]为横坐标，1/v
为纵坐标作图，由图求出Km精值选p。pt
7
反应物
生物化学实验问答题
8.双倒数法测定米氏常数的实验中，决定实验成败的因数有哪些？
答：1）实验应在初速度时间范围内进行；2)配置不同浓度的底物溶液浓度时应该用同一母液进行稀释，以保证底物浓度的准确性；3）各种试剂的加入时间，加入量应非常精确；4）要严格控制酶促反应时间做到准确无误；5）要将酶液稀释到恰当的浓度；6）作图要准确。
1.为什么提取酶液应该在0-4°C下进行？测定酶活力时为什么要在40-45°C条件下水解淀粉？
答：应为在0-4°C环境下酶能保持其活性。因为酶的最适温度区间是40-45°C，此时酶的活性最高，测得的酶活力是真正的酶活力。
2.小麦萌发过程中淀粉酶活性升高的原因和意义是什么？
答：温度与空气湿度使酶活力上升。意义：种子萌发产生酶使淀粉水解产生葡萄糖提供能量。
9.测定酶活力应该在酶促反应进程曲线的哪段时间范围内进行？为什么？
答：在初速度范围内进行。因为此时酶表现出最大活力，最能反映出酶的最大活力。
10.空白管中为什么最后才加酶液？你还可以设计出另一种空白管吗？
答：避免酶催化底物反应生成产物。可以先加酶液，再加Na2CO3（aq）,Folin-酚稀释溶液，最后再加磷酸苯二纳溶液。
答：说明其反应速率不断减慢。原因：1）随时间增加，酶活力降低。2）底物的量不断减少，减慢反应速率。3）产物浓度增加导致其反应增大。
6.加入Na2CO3的作用什么？
答：1）酶活力失去活性终止反应。2)为后面显色反应营造碱性环境。
7.为什么要用双倒数作图法而不是直接用米氏曲线来求米氏常数？
答：1）用米氏曲线作图所得Vmax为近似值，所得的Km为近似值不够准确。用双倒数做法作图可以准确计算出Vmax和Km的值；2取消其它试剂对实验结果的影响。
米氏常数测定(精)
COOCH2 NHCH2OH
HCHO
COOCH2 NH(CH2OH)2
试剂器材
试剂
1. 10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）： 四种不同［S］的酪蛋白标准溶液。 2. 中性甲醛溶液：75mL分析纯甲 醛加15mL 0.25%酚酞乙醇溶液， 以0.1M NaOH滴至微红，密闭于 玻璃瓶中。（自己配制） 3. 0.25%酚酞乙醇溶液： 4. 标准0.1M NaOH溶液。 5.胰蛋白酶溶液（已配好）
液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。
利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出V与 Km值。
注意事项
（1 ）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种， 如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速 逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研 究酶的活力以酶促反应的初速度为准。
此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底 物浓度 之间的定量关系。
双倒数作图法测定Km值： 1 Km 1 1 v V [S] V
胰蛋白酶的性质 胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精 氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解， 产生自由氨基端。
氨基的测定
甲醛滴定法
COOCH2 NH2
HCHO
实验十六
底物浓度对酶促反应速度的影响 ——米氏常数的测定
目的要求
（1）了解底物浓度对酶促反应的影响。
（2）掌握测定米氏常数Km的原理和方法
实验原理
Km定义： Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时 所对应的底物浓度。
Km的意义
Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同，同
一种酶与不同底物反应Km值也不同。
Lineweaver-Burk 双倒数作图
米氏方程（Michaelis-Menten Equation）或米曼氏动力学（Michaelis-Menten kinetics）是由Leonor Michaelis和Maud Menten 在1913年提出，是酶学中极为重要的可以描述多种非变异构酶动力学现象、表示一个酶促反应的起始速度V（有些资料中也称为V o）与底物浓度[S]关系的速度方的方程，米氏方程形式如下：
其中，Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度，Km值称为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。
在酶促反应中，底物情况在低浓度下，反应相对于底物是一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度[S]逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。
下图为米氏方程的模拟
作图：
酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测定有多种方法。
比如固定反应中的酶浓度，然后测试几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km和Vmax值。
但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km 或Vmax值是很困难的，因为曲线接近Vmax时是个渐进过程。
因此，通常情况下，我们都是通过米氏方程的双倒数形式来测定，即Lineweaver-Burk plot，也可称为双倒数方程(double-reciprocal plot)：
将1/V 对1/[S]作图，即可得到一条直线，该直线在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为1/Km的绝对值。
示意图如下：。
基础生物化学实验-米氏常数Km
0.4
-1/Km
0.2
1/Vmax
0.0 -4 -2 0 2 4
-1
6பைடு நூலகம்
8
10
1/[S](1/m m ol.L )
实验器材
1、37℃恒温水浴 2、量筒 3、三角瓶 4、碱式滴定管（注意：排尽管内气泡） 5、试管
试剂
1．5% 酪蛋白溶液（pH8.5） 2．4%胰蛋白酶溶液 3．甲醛溶液 (自己稀释) 4．酚酞 5．0.1N NaOH（自己稀释）
注意事项
1、甲醛要稀释 2、酶促反应的时间要精确控制 3、滴定过程中要不断晃动锥形瓶 4、滴定终点的判断：30s内不褪色可视为稳 定。
操作
1、用配好的5%的酪蛋白原液配制7个浓度的酪蛋白 2、4%胰蛋白酶及酪蛋白37℃保温10min 3、取7个三角瓶，每个三角瓶加入甲醛5ml及酚酞10滴 4、酪蛋白试管1反应：加1ml胰蛋白酶混匀，反应5分 钟，将反应液转入三角瓶中，用0.1N的NaOH滴定， 直到获得稳定的粉红色为止。 试管2-7反应同上，计算NaOH量 5、以NaOH消耗的毫升数代表在每种底物浓度下的 V，以1/V对1/［S］作图，求出胰蛋白酶的米氏常数 Km和最大速度Vmax
生物化学实验
Biochemical Experiment 胰蛋白酶米氏常数 （Km）的测定 ——甲醛滴定法
目的要求
z掌握用滴定法测胰蛋白酶的米氏常数 z掌握双倒数作图法计算Km和Vmax
原理
z 本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用双倒数 作图法测定Km值。 z 胰蛋白酶是胰液中的一个酶，它催化蛋白质中碱 性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成 的肽键水解。水解时生成自由氨基。 z 常温下，甲醛能迅速与氨基酸上的氨基结合，形 成羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，使溶液 的酸度增加，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，滴 定终点在酚酞的变色域内(pH9.0左右)。因此，可 用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
酶工程实验报告五(纤维素酶米氏常数—Km的测定)
v = Km + [S ]v ：反应初速度（微摩尔浓度变化/min)V ：最大反应速度（微摩尔浓度变化/min)[S]：底物浓度（mol/L)Km：米氏常数（mol/L)此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。
3.4 双倒数作图法测定Km值：1 Km 1 1v V [S] V1/v对1/[S]作图可得一条曲线，其斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax 。
若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于-1/Vmax。
本实验采用最适pH、最适温度下，测定不同浓度时酶活性。
再根据林贝法作图求出Km值。
3.5 纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其3mLDNS反应终止→沸水浴5min →定容至25ml→测定OD540吸光值G 作双倒数图求Km4.3 实验注意事项本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。
底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。
严格控制准确的酶促反应时间。
反应温度准确，酶液准确稀释。
不同pH所用酶液用对应pH缓冲液稀释试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；移液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。
精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；由图-1/Km=-7,可得出：Km=0.143 mg/ml(g/L)/(2×104)=0.715×10-5mol/L。
6、分析与讨论：米氏常数（Km）是酶的一个特征性物理量，其大小与酶的性质有关。
Km 值随测定的底物种类、反应的温度、pH 及离子强度而改变。
因此，对某一酶促反应而言，在一定条件下都有特定的Km 值，可用来鉴别酶，例如对于不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状况下催化相同反应的酶是否属于同一种酶[1]。
2012_完成(米氏常数)
---- Km值的测定
【实验目的】
了解底物浓度与酶反应速度间的关系
了解酶的Km值测定原理和方法
学习求蔗糖酶米氏常数的方法
酶反应速度与底物浓度的关系曲线
米氏方程:
Vmax S v K m S
当V=Vmax/2时，则Km=[s]
米氏常数的测定—
双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）
各管混匀，沸水浴5min，取出后立即用冷水冷却至室温，以蒸
馏水定容至25ml，摇匀。测540nm处A值。以葡萄糖含量（mg） 为横坐标，A值为纵坐标作出标准曲线。
2．不同底物浓度时反应速度υ的测定
反应物
管 蔗糖 号 (ml) 醋酸缓 冲液 (ml) 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5
1.25
将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再 用作图法求出Km。 1 Km 1 1 — = —— . — + —— v Vmax [S] Vmax
还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应：
【仪器与试剂】
•仪器：
分光光度计、恒温水浴、试管、吸管、秒表、 坐标纸
•试剂：
标准葡萄糖溶液（1 mg/ml）、
0.01 mol／L 蔗糖溶液、 0.2 mol／L NaAc缓冲溶液(pH4.6)、 1mol／L NaOH溶液， 3，5一二硝基水杨酸试剂。
【操作步骤】
1．葡萄糖标准曲线的制定
管号 葡萄糖标准液/ml 蒸馏水/ml 3,5—二硝基水杨酸/ml 0 0 2.0 3.0 1 0.2 1.8 3.0 2 0.4 1.6 3.0 3 0.6 1.4 3.0 4 0.8 1.2 3.0 5 1.0 1.0 3.0
实验九：酸性磷酸酯酶米氏常数、最大反应速度测定
07:04:46
结果与计算
4
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1、通过A680求出对应的酚标准液体积（V,mL），则产物的 浓度[P]=0.5×V（mmol/L）； 2、各底浓度下的反应速率v=0.5×V÷10（mmol/L/min）； 3、以1/v为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，得到双倒数方程 ，根据方程求出Km和vmax。
A680
以A680为纵坐标，酚标准应用液体积（mL）为横坐标作标准曲线
07:04:46
实验步骤
3
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3、测定Km、Vmax 取试管7支，0～6编号，空白管为0号。各管按下表加入不 同体积5mmol/L磷酸苯二钠溶液，并分别补充0.2M pH5.6乙 酸盐缓冲液至0.5mL。35℃预热2min后，逐管记时加入酸性
1～5号管分别加入0.1-1.0mL酚标准应用液，并用蒸馏水将 各管体积补充至1.0mL，0号管中加入1.0mL蒸馏水。 各管各加1mol/L碳酸钠溶液5.0mL和Folin-酚稀溶液0.5mL ，摇匀后，35℃保温显色10分钟。
以0号管作空白，在可见光分光光度计680nm波长处读取各
管的吸光度A680。
实验原理
2
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在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应
的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度（ v）随底物浓度的增加而迅速增加； 随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当 底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax ）。
6 2.5 0.4
0.5 2.0
注意事项
5
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