基础生物化学实验-米氏常数Km
基础生物化学名词解释
1.碱基互补原则：在形成双螺旋结构的过程中，由于各种碱基的大小与结构的不同，使得碱基之间的互补配对只能在G…C（或C…G）和A…T（或T…A）之间进行，这种碱基配对的规律就称为碱基配对规律（互补规律）。
2.核酸的变性：当呈双螺旋结构的DNA溶液缓慢加热时，其中的氢键便断开，双链DNA 便脱解为单链，这叫做核酸的“溶解”或变性。
3.核酸的复性：在适宜的温度下，分散开的两条DNA链可以完全重新结合成和原来一样的双股螺旋。
这个DNA螺旋的重组过程称为“复性”。
4.增色效应：当DNA从双螺旋结构变为单链的无规则卷曲状态时，它在260nm处的吸收便增加，这叫“增色效应”。
5.减色效应：DNA在260nm处的光密度比在DNA分子中的各个碱基在260nm处吸收的光密度的总和小得多（约少35%~40%）, 这现象称为“减色效应”。
6退火：热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火。
7.DNA的熔解温度（Tm值）：引起DNA发生“熔解”的温度变化范围只不过几度，这个温度变化范围的中点称为熔解温度（Tm）。
8.环化核苷酸：单核苷酸中的磷酸基分别与戊糖的3’-OH及5’-OH形成酯键，这种磷酸内酯的结构称为环化核苷酸。
9.碱基堆积力：各个碱基堆积在一起，产生碱基间的范德华引力，对稳定双螺旋结构起一定的作用。
10.顺反子：遗传学将编码一个多肽的遗传单位称为顺反子11.核小体：DNA双螺旋盘绕在组蛋白八聚体上形成核小体。
核小体是染色体的基本结构单位。
12．两性离子：指在同一氨基酸分子上含有等量的正负两种电荷，又称兼性离子或偶极离子。
13．氨基酸残基：肽链中的氨基酸分子由于参加肽键的形成已不完整，每一个氨基酸单位叫氨基酸残基。
14．氨基酸的等电点：指氨基酸的正离子浓度和负离子浓度相等时的pH值，用符号pI表示。
15．肽键：一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基脱去一分子水缩合而形成的共价键. 16．肽单位：多肽链主骨架的重复单位Cα-CO-NH- Cα，包括肽键和两个α-碳原子。
基础生物化学习题生物化学习题集
基础生物化学习题生物化学习题集第一章核酸的结构和功能一、选择题1、热变性的DNA分子在适当条件下可以复性，条件之一是（）A、骤然冷却B、缓慢冷却C、浓缩D、加入浓的无机盐2、在适宜条件下，核酸分子两条链通过杂交作用可自行形成双螺旋，取决于（）A、DNA的Tm值B、序列的重复程度C、核酸链的长短D、碱基序列的互补3、核酸中核苷酸之间的连接方式是：（）A、2’，5’—磷酸二酯键B、氢键C、3’，5’—磷酸二酯键D、糖苷键4、tRNA的分子结构特征是：（）A、有反密码环和3’—端有—CCA序列B、有密码环C、有反密码环和5’—端有—CCA序列D、5’—端有—CCA序列5、下列关于DNA分子中的碱基组成的定量关系哪个是不正确的？（）A、C+A=G+TB、C=GC、A=TD、C+G=A+T6、下面关于Watson-Crick DNA双螺旋结构模型的叙述中哪一项是正确的？（）A、两条单链的走向是反平行的B、碱基A和G配对C、碱基之间共价结合D、磷酸戊糖主链位于双螺旋内侧7、具5’－CpGpGpTpAp-3’顺序的单链DNA能与下列哪种RNA杂交? （）A、5’-GpCpCpAp-3’B、5’-GpCpCpApUp-3’C、5’-UpApCpCpGp-3’D、5’-TpApCpCpGp-3’8、RNA和DNA彻底水解后的产物（）A、核糖相同，部分碱基不同B、碱基相同，核糖不同C、碱基不同，核糖不同D、碱基不同，核糖相同9、下列关于mRNA描述哪项是错误的？（）A、原核细胞的mRNA在翻译开始前需加“PolyA”尾巴。
B、真核细胞mRNA在3’端有特殊的“尾巴”结构C、真核细胞mRNA在5’端有特殊的“帽子”结构10、tRNA的三级结构是（）A、三叶草叶形结构B、倒L形结构C、双螺旋结构D、发夹结构11、维系DNA双螺旋稳定的最主要的力是（）A、氢键B、离子键C、碱基堆积力 D范德华力12、下列关于DNA的双螺旋二级结构稳定的因素中哪一项是不正确的？（）A、3'，5'－磷酸二酯键C、互补碱基对之间的氢键B、碱基堆积力D、磷酸基团上的负电荷与介质中的阳离子之间形成的离子键13、Tm是指( )的温度A、双螺旋DNA达到完全变性时B、双螺旋DNA开始变性时C、双螺旋DNA结构失去1/2时D、双螺旋结构失去1/4时14、稀有核苷酸碱基主要见于( )A、DNAB、mRNAC、tRNAD、rRNA15、双链DNA的解链温度的增加，提示其中含量高的是（）A、A和GB、C和TC、A和TD、C和G16、核酸变性后，可发生哪种效应？（）A、减色效应B、增色效应C、失去对紫外线的吸收能力D、最大吸收峰波长发生转移17、某双链DNA纯样品含15％的A，该样品中G的含量为（）A、35％B、15％C、30％D、20％二、是非题（在题后括号内打√或×）1、杂交双链是指DNA双链分开后两股单链的重新结合。
km值名词解释
km值名词解释在生物化学和酶催化反应中，KM（又称为米氏常数）是一个用来度量酶与底物之间的亲和力的常数。
KM的全称为Michaelis-Menten常数，取自Hans Michaelis和Maud Menten这两位德国生物化学家的名字，他们在1913年提出了Michaelis-Menten方程，描述了酶与底物之间的动力学关系。
KM的数值表示了酶与底物结合的亲和力，具体来说，KM越小，酶对底物的亲和力越强，底物与酶结合形成酶底物复合物的速率越快。
反之，KM越大，酶对底物的亲和力越弱，底物与酶结合形成酶底物复合物的速率越慢。
KM的定义是，在酶催化反应中，当酶底物复合物的浓度为一半时，即酶底物反应速率的一半时，底物的浓度就等于KM。
换句话说，KM可以看作是底物浓度的一个度量，当底物浓度等于KM时，酶的速率只有最大速率的一半。
KM的单位通常是摩尔/升（M），但在实验室常用的浓度单位为摩尔/升时，KM的数值很小，通常在10^-3至10^-6 M之间。
因此，在实际中，常常使用KM的对数，即pKM（-logKM）来表示。
KM的值是由酶-底物系统的性质决定的，包括酶的结构、底物的结构以及反应条件等。
通常而言，底物结构与酶的活性位点的互补性越好，底物对酶的亲和力越大，KM的值越小。
通过测定酶在不同底物浓度下的速率，可以得到KM的值。
KM的测定对于了解酶催化反应的机制、酶的特性以及酶底物的相互作用非常重要。
在药物研发和酶工程中，对KM的测量和调控也非常关键，可以帮助优化酶的催化效率和选择性。
总之，KM是用来度量酶与底物之间亲和力的常数，表示了底物浓度等于KM时酶的速率达到最大速率的一半。
KM的值受到酶的结构、底物的结构和反应条件等因素的影响，通过测定酶在不同底物浓度下的速率可以获得KM的值，进而了解酶催化反应的机制和优化酶的性能。
生物化学笔记
生物化学一．名词解释米氏常数（Km）磷酸戊糖途径调节子酶辅助因子cori循环与巴斯德效应滚动环复制二．结构式TPCK 尼克酰胺GC配对IP3三．填空1, 蔗糖是否为还原糖-----。
2，糖苷键的两种类型-----和-----。
3，DNA的一条链序列为GTCAATG，那么另一条链的序列为-----。
4，-----常数表征酶的催化效率。
5，ρ因子的催化活性是-----和-----。
6，常见的遗传缺陷病有-----，-----，-----，-----；常见的放射性标记的同位素是-----，-----，-----，-----。
7，DNA复制过程中动物是以-----为能源，E. Coli 以-----为能源。
8，生物体中产能最多的生化反应过程是-----。
9，-----发现TCA循环，-----发现化学渗透学说。
10，真核生物rRNA拼接过程中左端的拼接点顺序为-----右端为-----，切除-----结构。
11，生长激素是由-----产生的。
12，E．Coli DNA Pol I 经酶切，得到大小片段，其中大片段具有-----酶活性和-----酶活性，小片段具有-----酶活性。
13，必需脂肪酸有-----和-----。
四．回答1，作动力学曲线区分酶的可逆性抑制与不可逆抑制？2，比较ATP与ppi在磷酸键及生物学功能方面的异同。
3，真核生物至少需要31种tRNA才能识别61种密码子，而线粒体中tRNA只有22种，为什么？4，阐明衰减子对操纵子的调控。
5，糖酵解和糖异生过程中涉及的不可逆反应和限速步骤。
五．计算1，反竟争抑制和米氏方程。
2，酶活力，比活力，酶浓度。
3，DNA半保留复制。
15NDNA在14N培养基上培养一代后，14NDNA与14N-15NDNA杂交分子之比是多少？4，正常DNA的超螺旋密度为-0.05，在无拓扑异构酶条件下当复制到超螺旋密度为0.07时，由于正超螺旋的阻力而不能继续复制，求此时的复制百分数。
生物化学实验简答题
生物化学实验简答题1 简述透析的原理，影响透析的因素及透析的应用。
透析是一种利用小分子能通过，大分子不能通过半透膜的原理把它们分开的一种重要手段。
影响透析的因素主要有膜、溶剂（水溶液、大分子溶液）、物理条件（温度、压力）、董南膜平衡等。
透析主要用于将大分子物质和小分子物质分开，如蛋白质的分离纯化。
2 请设计一项实验，分离并鉴定某一微生物中的游离氨基酸。
如何分析未知样品的氨基酸成分？利用纸层析法分离鉴定该微生物中的游离氨基酸。
实验所需器材包括层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿和层析滤纸，实验所需试剂包括扩展剂、氨基酸溶液（各标准氨基酸溶液和待测氨基酸溶液）和显色液（0.1%水合茚三酮正丁醇溶液）。
实验操作步骤如下一取层析滤纸一张，在纸的一端距边缘1.5-2cm处用铅笔划一条直线，在此直线上以相同间距作出记号。
二点样用毛细血管将各氨基酸样品分别点在所作记号的位置上，待干燥后，可重复点3次。
三扩展用线将滤纸缝成筒状，将滤纸直立于盛有扩展剂的培养皿中扩展。
待溶剂上升至距滤纸上端边缘1cm时，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界限，自然干燥或吹风机热风吹干。
四显色用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，用热风吹干显出层析斑点。
五计算各氨基酸Rf值。
滤纸上的层析斑点图即是对氨基酸分离的结果，通过比较各标准氨基酸Rf值和待测氨基酸的Rf值即可鉴别待测的游离氨基酸。
3 层析技术包括哪几类？请简要介绍凝胶层析的原理。
层析技术包括吸附层析、离子交换层析、分配层析、薄层层析、凝胶层析和亲和层析。
凝胶层析的基本原理是用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使物质分离。
固定相是凝胶，各组分分子的大小不同，而在凝胶上受阻的程度不同，从而分层。
大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，移动速度快，先被洗出层析柱；小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱。
生物化学习题及答案_酶
酶（一）名词解释值）1．米氏常数（Km2．底物专一性（substrate specificity）3．辅基（prosthetic group）4．单体酶（monomeric enzyme）5．寡聚酶（oligomeric enzyme）6．多酶体系（multienzyme system）7．激活剂（activator）8．抑制剂（inhibitor inhibiton）9．变构酶（allosteric enzyme）10．同工酶（isozyme）11．诱导酶（induced enzyme）12．酶原（zymogen）13．酶的比活力（enzymatic compare energy）14．活性中心（active center）（二）英文缩写符号1．NAD+（nicotinamide adenine dinucleotide）2．FAD（flavin adenine dinucleotide）3．THFA（tetrahydrofolic acid）4．NADP+（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）5．FMN（flavin mononucleotide）6．CoA（coenzyme A）7．ACP（acyl carrier protein）8．BCCP（biotin carboxyl carrier protein）9．PLP（pyridoxal phosphate）（三）填空题1．酶是产生的，具有催化活性的。
2．酶具有、、和等催化特点。
3．影响酶促反应速度的因素有、、、、和。
4．胰凝乳蛋白酶的活性中心主要含有、、和基，三者构成一个氢键体系，使其中的上的成为强烈的亲核基团，此系统称为系统或。
5．与酶催化的高效率有关的因素有、、、、等。
6．丙二酸和戊二酸都是琥珀酸脱氢酶的抑制剂。
7．变构酶的特点是：（1），（2），它不符合一般的，当以V对[S]作图时，它表现出型曲线，而非曲线。
大学课程生物化学实验km课件
一、实验目的 1．了解底物浓度对酶促反应速度的影响。 2．学习测定米氏常数的原理和方法。
二、实验原理
酶促反应动力学
研究各种因素对酶促反应速度的影响。
影响因素包括有
酶浓度、底物浓度、pH、温度、 抑制剂、激活剂等。
研究前提
I. 单底物、单产物反应 II. 酶促反应速度用单位时间内底物的消耗量和产
底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方 程 式 ， 简 称 米 氏 方 程 式 (Michaelis equation)。
Ｖ ＝ Vmax[S]
Km + [S]
米－曼氏方程式推导基于两个假设：
①反应刚刚开始，产物的生成量极少，逆反应可 不予考虑。
②［S］超过［E］，［S］的变化可忽略不计。
Km与Vmax的意义
3. Km是酶的特征性常数之一
4. Vmax
定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与 酶浓度成正比。
意义：Vmax=K3 [E] 如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算酶
的转换数(turnover number)，即动力学常 数K3。
Ｋm值与Ｖmax值的测定
双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为 林-贝 氏(Lineweaver- Burk)作图法
每个三角瓶中各加人酚酞20滴，用0.1 mol／LNaOH 滴定至粉红色，保持颜色在30秒内不退色，记下所用 NaOH的毫升数。每个小锥型瓶中样品的滴定终点颜 色应当一致。
6．其它浓度的酪蛋白溶液反应速度的测定重复2－5 步骤。
五、数据处理
1．初速度的计算 用增加的滴定度(标准NaOH滴定体积× 0.1摩 尔浓度×14.008)对时间作图，测定不同底物 浓度的初速度。
实验九：酸性磷酸酯酶米氏常数、最大反应速度测定
07:04:46
结果与计算
4
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1、通过A680求出对应的酚标准液体积（V,mL），则产物的 浓度[P]=0.5×V（mmol/L）； 2、各底浓度下的反应速率v=0.5×V÷10（mmol/L/min）； 3、以1/v为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，得到双倒数方程 ，根据方程求出Km和vmax。
A680
以A680为纵坐标，酚标准应用液体积（mL）为横坐标作标准曲线
07:04:46
实验步骤
3
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3、测定Km、Vmax 取试管7支，0～6编号，空白管为0号。各管按下表加入不 同体积5mmol/L磷酸苯二钠溶液，并分别补充0.2M pH5.6乙 酸盐缓冲液至0.5mL。35℃预热2min后，逐管记时加入酸性
1～5号管分别加入0.1-1.0mL酚标准应用液，并用蒸馏水将 各管体积补充至1.0mL，0号管中加入1.0mL蒸馏水。 各管各加1mol/L碳酸钠溶液5.0mL和Folin-酚稀溶液0.5mL ，摇匀后，35℃保温显色10分钟。
以0号管作空白，在可见光分光光度计680nm波长处读取各
管的吸光度A680。
实验原理
2
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在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应
的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度（ v）随底物浓度的增加而迅速增加； 随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当 底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax ）。
6 2.5 0.4
0.5 2.0
注意事项
5
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0.4
-1/Km
0.2
1/Vmax
0.0 -4 -2 0 2 4
-1
6பைடு நூலகம்
8
10
1/[S](1/m m ol.L )
实验器材
1、37℃恒温水浴 2、量筒 3、三角瓶 4、碱式滴定管（注意：排尽管内气泡） 5、试管
试剂
1．5% 酪蛋白溶液（pH8.5） 2．4%胰蛋白酶溶液 3．甲醛溶液 (自己稀释) 4．酚酞 5．0.1N NaOH（自己稀释）
注意事项
1、甲醛要稀释 2、酶促反应的时间要精确控制 3、滴定过程中要不断晃动锥形瓶 4、滴定终点的判断：30s内不褪色可视为稳 定。
操作
1、用配好的5%的酪蛋白原液配制7个浓度的酪蛋白 2、4%胰蛋白酶及酪蛋白37℃保温10min 3、取7个三角瓶，每个三角瓶加入甲醛5ml及酚酞10滴 4、酪蛋白试管1反应：加1ml胰蛋白酶混匀，反应5分 钟，将反应液转入三角瓶中，用0.1N的NaOH滴定， 直到获得稳定的粉红色为止。 试管2-7反应同上，计算NaOH量 5、以NaOH消耗的毫升数代表在每种底物浓度下的 V，以1/V对1/［S］作图，求出胰蛋白酶的米氏常数 Km和最大速度Vmax
生物化学实验
Biochemical Experiment 胰蛋白酶米氏常数 （Km）的测定 ——甲醛滴定法
目的要求
z掌握用滴定法测胰蛋白酶的米氏常数 z掌握双倒数作图法计算Km和Vmax
原理
z 本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用双倒数 作图法测定Km值。 z 胰蛋白酶是胰液中的一个酶，它催化蛋白质中碱 性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成 的肽键水解。水解时生成自由氨基。 z 常温下，甲醛能迅速与氨基酸上的氨基结合，形 成羟甲基衍生物，使N+H3上的H+游离出来，使溶液 的酸度增加，这样就可以用碱滴定N+H3放出H+，滴 定终点在酚酞的变色域内(pH9.0左右)。因此，可 用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。
米氏方程
¾ 1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中 间产物学说对酶促反映的动力学进行研究，推 导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关 系的著名公式，称为米氏方程。 ¾ Km：是酶的特征常数之一，只与酶的性质有 关，不同的酶其Km值不同。Km值表示酶与底物 之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶 的催化活性低。它等于酶促反应达到最大反应 速度一半时所对应的底物浓度。
V=
Vmax [S] Km + [S]
米氏方程
米氏方程中常数的意义
y=ax+b直线方程
¾ 米氏常数Km的测定：
测定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的 作图法 — 双倒数作图法。
斜率=Km/Vmax
1.0
取米氏方程式的倒数形式：
1
0.8
Km
1
1
1/v
0.6
⎯⎯⎯ = ⎯⎯ × ⎯⎯⎯ + ⎯⎯ V Vmax [S] Vmax