碱性磷酸酶米氏常数测定

碱性磷酸酶米氏常数测定

P60

【实验原理】

在环境的温度、pH和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时，酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(V max)，如图所示。

底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。

V = V max[S]/(K m+[S])

上式中V max为最大反应速度，[S]为底物浓度，K m为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的起始速度。当V= V max/2时，K m=[S]。所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。因此K m的单位以摩尔浓度(mol／L)表示。

K m是酶的最重要的特征性常数，测定K m值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的K m值在0.01-100(mmol/L)间。

酶促反应的最大速度V max实际上不易准确测定，K m值也就不易准确测出。林-贝(1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即：1/V = （K m +[S]）/ V max[S]或1/V = K m/ V max·（1/[S]）+1/ V max

此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ K m，由此可以正确求得该酶的K m值，如图所示。

本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其K m值。

可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的K m值。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。故可以从标准曲线上查知酚的含量，从而计算化学反应速度。反应式如下：

【实验方法】

一．底物浓度对酶促反应速度的影响

(1) 取6支试管，作好标记，按下表操作。

管号123456

0.04mol/L 基质液/mL0.10 0.20 0.30 0.40 0.80 0.0 0.1mol/L碳酸盐缓冲液/mL0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70

蒸馏水/mL 1.10 1.00 0.90 0.80 0.40 1.20

37℃水浴5min

血清/mL0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 最终基质浓度/mmol∙L-1 2.00 4.00 6.00 8.00 16.00 0.00

(2) 加入血清后，各管混匀并且立即记录时间，将上述各管置37℃水浴中准确保温15 分钟。

(3) 保温结束，立即加碱性溶液1.1mL终止反应。

(4) 各管分别加入0.3％4-氨基安替比林1.0mL，0.5％铁氰化钾2.0mL，充分混匀，放置10分钟，以6号空白管作对照，于510nm波长处比色测定，根据酚标准曲线计算酚含量。

(5) 以各管基质浓度的倒数1/[S]为横坐标，以各管反应速度的倒数1/V（µmol.L-1.min-1为单位）作纵坐标，作图求出K m值。

二．酚标准曲线的绘制

(1) 取洁净干燥试管6支，按下表依次加入试剂。

管号123456 0.1mg/mL 酚标准溶液/mL0.0 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40

蒸馏水/mL 2.0 1.95 1.90 1.80 1.70 1.60

37℃水浴5min

碱性溶液/mL 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 0.3% 4-氨基安替比林/mL 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

0.5% 铁氰化钾/mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

(2) 混匀后室温放置15分钟，于510nm波长处比色。

(3) 以酚含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制酚标准曲线。

【实验结果】

酚含量