碱性磷酸酶米氏常数测定
碱性磷酸酶米氏常数测定
P60
【实验原理】
在环境的温度、pH和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时，酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。
若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。
当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(V max)，如图所示。
底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。
V = V max[S]/(K m+[S])
上式中V max为最大反应速度，[S]为底物浓度，K m为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的起始速度。
当V= V max/2时，K m=[S]。
所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。
因此K m的单位以摩尔浓度(mol／L)表示。
K m是酶的最重要的特征性常数，测定K m值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的K m值在0.01-100(mmol/L)间。
酶促反应的最大速度V max实际上不易准确测定，K m值也就不易准确测出。
林-贝(1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即：1/V = （K m +[S]）/ V max[S]或1/V = K m/ V max·（1/[S]）+1/ V max
此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ K m，由此可以正确求得该酶的K m值，如图所示。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其K m值。
可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的K m值。
本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。
酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。
故可以从标准曲线上查知酚的含量，从而计算化学反应速度。
反应式如下：
【实验方法】
一．底物浓度对酶促反应速度的影响
(1) 取6支试管，作好标记，按下表操作。
管号123456
0.04mol/L 基质液/mL0.10 0.20 0.30 0.40 0.80 0.0 0.1mol/L碳酸盐缓冲液/mL0.70 0.70 0.70 0.70 0.70 0.70
蒸馏水/mL 1.10 1.00 0.90 0.80 0.40 1.20
37℃水浴5min
血清/mL0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 最终基质浓度/mmol∙L-1 2.00 4.00 6.00 8.00 16.00 0.00
(2) 加入血清后，各管混匀并且立即记录时间，将上述各管置37℃水浴中准确保温15 分钟。
(3) 保温结束，立即加碱性溶液1.1mL终止反应。
(4) 各管分别加入0.3％4-氨基安替比林1.0mL，0.5％铁氰化钾2.0mL，充分混匀，放置10分钟，以6号空白管作对照，于510nm波长处比色测定，根据酚标准曲线计算酚含量。
(5) 以各管基质浓度的倒数1/[S]为横坐标，以各管反应速度的倒数1/V（µmol.L-1.min-1为单位）作纵坐标，作图求出K m值。
二．酚标准曲线的绘制
(1) 取洁净干燥试管6支，按下表依次加入试剂。
管号123456 0.1mg/mL 酚标准溶液/mL0.0 0.05 0.10 0.20 0.30 0.40
蒸馏水/mL 2.0 1.95 1.90 1.80 1.70 1.60
37℃水浴5min
碱性溶液/mL 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 0.3% 4-氨基安替比林/mL 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
0.5% 铁氰化钾/mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
(2) 混匀后室温放置15分钟，于510nm波长处比色。
(3) 以酚含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制酚标准曲线。
【实验结果】
酚含量。
碱性磷酸酶km值的测定
0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1
加入酶液后立即混匀（保持37℃水浴） ，
混匀 ， 室温放置10分钟左右, 以8号管为 空白 ， 于5l0nm比色 ， 记录各管的光密度
碱性溶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
1 2 30.05 0. 150.90 0.900.95 0.85
管号底物液 (0 .04M)碳酸缓液 (pH= 10)蒸馏水
混匀后37℃水浴 ， 预温5分钟左右
【
】
反应开始。从加入酶液起计时至下一步 加入碱性 溶液停止反应 ， 各管反应时间应准确一 致 ， 为15分钟。
■ 比较两个值的大小,分析实验误差产生 的原因
底物浓度 mmol/L
1/ [S]
1/OD
【
】
4 5
1 2
8
6
3
3
5
7
1
1
/ OD510为纵轴作 图 ， 观察曲线形状； 查Km值■
s]为横轴，
■ 以
1
1
1/ [s- 1/Km
底物浓度与反应速度关系曲线
双倒数曲线
1/2VMAX
VMAX
[S]
的原因■ 比较两种Km测定方法各自的优缺点
/ km ， 据此可算出Km
1/ Vmax
距3;4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 (红色醌衍生物
:
:磷酸苯二钠+H2O
（红色
AKP
)
4 5 6 7 80.25 0.30 0.40 0.60 0.800.90 0.90 0.90 0.90 0.900.75 0.70 0.60 0.40 0.20
4-氨基安 替比林铁氰化钾
实验三-碱性磷酸酶米氏常数的测定
Lineweaver - Burk根据米氏方程，推导出如下直线方程式：（双倒数方程）
—1— = —K—m— ·—1— + —1—
V
Vmax [S] Vmax
以不同的底物浓度—1—为横坐标，
[S]
以—1—为纵坐标，
V
此直线与横轴相交的负截距为-
—1—，
Km
由此可以正确求得酶的Km值。
蒸馏水/mL
1.10 1.00 0.90 0.80 0.40 1.20
37℃水浴5min
血清/mL
0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
最终基质浓度（[S]）
2.00 4.00 6.00
8.00 16.00 0.00
37℃Байду номын сангаас温15min
碱性溶液/mL
1.1
1.1
1.1
1.1
1.1
0.5％ 铁氰化钾、0.3％ 4-氨基安替比林、酚标准液（0.1mg/mL） • 器材：恒温水浴锅、可见光分光光度计、移液枪
四、实验步骤
一． 酚标准曲线的绘制
(1) 取洁净干燥试管6支，按下表依次加入试剂。
管号
1
2
3
4
5
6
0.1mg/mL 酚标准溶液/mL
0.0
0.05 0.10 0.20 0.30 0.40
蒸馏水/mL
2.0 1.95 1.90 1.80 1.70 1.60
37℃水浴5min
碱性溶液/mL
1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10
0.3% 4-氨基安替比林/mL
1.0
1.0
碱性磷酸酶Km值的测定
Vmax•[S] V=
Km + [S]
其中Km为米氏常数， Vmax为最大反应速度，
当V=Vmax/2时，则Km=[s]。 Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶 的一种方法
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将米氏方程变形为双倒数方程，以l/ v－1／[s]作图，将各点连线，在横轴 截距为-／km，据此可算出Km值。
碱性磷酸酶Km值的 测定
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【实验目的】
1.了解酶的Km值测定原理和方法
2．掌握碱性磷酸酶（AKP）活性测 定的原理和方法
精品课件
【实验原理】
在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促 反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加， 但当底物浓度增大到一定极限时，则反应 速度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反 应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方 程来表示，即：
OD510
1/OD510
VMAX
1/2VMAX
Km
底物浓度与反应速度关系曲线
1/Vmax
[S]
-1/Km
双倒数曲线
1/[s]
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【实验讨论】
比较两个值的大小,分析实验误差产 生的原因
比较两种Km测定方法各自的优缺点
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1/V=Km/ Vmax•[S] + 1/ Vmax
精品课件
本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O 酚
AKP OH-
苯
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物
6
78
碱性磷酸酶km值测定实验报告
碱性磷酸酶km值测定实验报告碱性磷酸酶 Km 值测定实验报告一、实验目的1、掌握测定碱性磷酸酶（ALP）Km 值的原理和方法。
2、了解底物浓度对酶促反应速度的影响。
3、熟悉分光光度计的使用。
二、实验原理碱性磷酸酶是一种广泛分布于人体各脏器器官中的酶，在骨、肝、肠、胎盘等组织中含量较高。
它能催化磷酸酯的水解反应，产生无机磷酸和醇、酚等物质。
在酶促反应中，反应速度（v）与底物浓度S之间的关系可用米氏方程表示：v ＝ VmaxS ／（Km ＋ S) ，其中 Vmax 为最大反应速度，Km 为米氏常数。
Km 值是酶的一个重要特征常数，它表示酶与底物的亲和力。
Km 值越小，酶与底物的亲和力越大；反之，Km 值越大，酶与底物的亲和力越小。
本实验通过测定不同底物浓度下的酶促反应速度，以反应速度 v 对底物浓度S作图，通过双倒数作图法（LineweaverBurk 作图法），即1/v 对 1/S作图，可求得碱性磷酸酶的 Km 值。
三、实验材料与仪器1、材料碱性磷酸酶提取液磷酸苯二钠溶液（不同浓度）01mol/L 氢氧化钠溶液004mol/L 碳酸钠溶液05mol/L 三氯乙酸溶液2、仪器分光光度计恒温水浴锅移液器试管、刻度吸管等四、实验步骤1、准备试剂配制不同浓度的磷酸苯二钠溶液：0005mol/L、001mol/L、002mol/L、003mol/L、004mol/L。
配制显色剂：将 01mol/L 氢氧化钠溶液和 004mol/L 碳酸钠溶液按4:1 的体积比混合。
2、反应体系设置取 7 支干净的试管，按下表加入试剂：｜试管编号|1|2|3|4|5|6|7|｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜磷酸苯二钠溶液（mL）｜000|020|040|060|080|100|＿____|｜蒸馏水（mL）｜100|080|060|040|020|000|＿____|｜37℃预温5min 后，各加入05mL 碱性磷酸酶提取液，立即混匀，37℃水浴准确反应 15min|｜反应结束后，各加入 05mL 05mol/L 三氯乙酸溶液终止反应|3、显色与比色各管加入 45mL 显色剂，充分摇匀。
碱性磷酸酶Km值的测定
1.0
1.0
1.0 1.0
1.0 1.0
1.0
1.0
4-氨基安 替比林
1.0 1.0
铁氰化钾
2.0 2.0
2.0Leabharlann 2.02.02.0 2.0
2.0
混匀，室温放置10分钟左右, 以8号管为 空白，于5l0nm比色，记录各管的光密度
【实验结果】
1、原始数据
结果记录 OD 1 2 3 4 5 6 7 8
底物浓度 mmol/L
【实验操作】
1 2 3 4 5 6 7 8 管号 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0.00
(0.04M) 碳酸缓 液(pH=10)
0.90 0.90 0.95 0.85
0.90 0.90 0.75 0.70
0.90 0.60
0.90 0.90 0.40 0.20
Vmax•[S] + 1/ Vmax
本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O AKP OH苯酚
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
Vmax•[S]
V=
Km + [S]
其中Km为米氏常数， Vmax为最大反应速度， 当V=Vmax/2时，则Km=[s]。 Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶 的一种方法
将米氏方程变形为双倒数方程，以l/ v －1／[s]作图，将各点连线，在横轴截 距为-／km，据此可算出Km值。
碱性磷酸酶Km值的测定-毕业论文-
12
mmol/L
78
16
0
1/[S] 1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 1/OD
2、作图
■ 以 [s ]为横轴，OD510为纵横作图，观 察曲线形状；查Km值
■ 以1／［s]为横轴，1／OD510为纵轴作图 观察曲线形状；查Km值
■ 比较两个值的差异.
OD510
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0
(0.04M)
碳酸缓 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0
液(pH=10)
蒸馏水 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1
■ 本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O Fra bibliotekKP OH- 苯酚
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
【实验操作】
碱性磷酸酶Km值 的测定
【实验目的】
■ 1 . 了解酶的Km值测定原理和方法
■ 2．掌握碱性磷酸酶（AKP）活性 测定的原理和方法
【实验原理】
■ 在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促 反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加 但当底物浓度增大到一定极限时，则反应 速度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反 应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方 程来表示，即：
1/OD510
VMAX
碱性磷酸酶Km值的测定
6
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16
0
1/[S] 1/OD
1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 -
历史ⅱ岳麓版第13课交通与通讯 的变化资料
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[自读教材·填要点]
一、铁路，更多的铁路 1．地位 铁路是 交通建运设输的重点，便于国计民生，成为国民经济 发展的动脉。 2．出现 1881年，中国自建的第一条铁路——唐山 至开胥平各庄铁 路建成通车。 1888年，宫廷专用铁路落成。
本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其底物，生成酚和 磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧 化生成红色醌的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O
AKP OH-
苯酚
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
【实验操作】
出口价格同步变动的现象。与这一现象直接相关的近代事
业是
()
A．电报业
B．大众报业
C．铁路交通业 D．轮船航运业
[解析] 材料主要反映了信息交流的快捷，故选A。
[答案] A
[题组冲关]
3．假如某爱国实业家在20世纪初需要了解全国各地商业信
息，可采用的最快捷的方式是
()
A．乘坐飞机赴各地了解 B．通过无线电报输送讯息
C．通过互联网 D．乘坐火车赴各地了解
解析：本题考查中国近代物质生活的变迁。注意题干信
息“20世纪初”“最快捷的方式”，因此应选B，火车速度 远不及电报快。20世纪30年代民航飞机才在中国出现， 互联网出现在20世纪90年代。 答案：B
4．下列不属于通讯工具变迁和电讯事业发展影响的是( ) A．信息传递快捷简便 B．改变着人们的思想观念 C．阻碍了人们的感情交流 D．影响着人们的社会生活 解析：新式通讯工具方便快捷，便于人们感情的沟通和交流。 答案：C
碱性磷酸酶米氏常数测定
碱性磷酸酶米氏常数测定P60【实验原理】在环境的温度、pH和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时，酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。
若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。
当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(V max)，如图所示。
底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。
V = V max[S]/(K m+[S])上式中V max为最大反应速度，[S]为底物浓度，K m为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的起始速度。
当V= V max/2时，K m=[S]。
所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。
因此K m的单位以摩尔浓度(mol／L)表示。
K m是酶的最重要的特征性常数，测定K m值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的K m值在0.01-100(mmol/L)间。
酶促反应的最大速度V max实际上不易准确测定，K m值也就不易准确测出。
林-贝(1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即：1/V = （K m +[S]）/ V max[S]或1/V = K m/ V max·（1/[S]）+1/ V max此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ K m，由此可以正确求得该酶的K m值，如图所示。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其K m值。
可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的K m值。
本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。
酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。
实验碱性磷酸酶米氏常数的测定
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3
2．主要方法： （1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长
蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长 为260nm。
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4
1.苯丙氨酸 2.酪氨酸 3.色氨酸
（3）比较吸光度的比值
纯DNA
A260nm 1.8 A280nm
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5
（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析
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（三） 数据处理
各管在722分光光度计测定波长405nm的OD 值 (OD405nm) 。 从 对 硝 基 苯 酚 标 准 曲 线 上 查 出 OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数), 计 算 出 各 种 底 物 浓 度 下 的 初 速 度 vo （ 单 位 以 molL-1min-1表示），取倒数1/v填入表内。以 1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常 数Km和最大反应速度Vm。
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20
(二）测定 15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。
No. 底物终浓度[S] (mM )
1
23
4
5
0.5 0.75 1.0 1.5 3
10 mmol/L pNPP（mL ） 0.1 0.15 0.2 0.3 0.6
蒸馏水（mL ）
0.5 0.45 0.4 0.3 0
16
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五、操作方法
（一）对硝基苯酚标准曲线的制作
取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作：
管号
0 12 3 4 5 6
【微生物学】第二次实验课：碱性磷酸酶米氏常数的测定,血清转氨酶活性测定(2016-03-10)
n 血清转氨酶活性，临床上可作为疾病诊断和预 后的指标之一。
二．实验原理
• 谷丙转氨酶（glutamination pyruvic transaminnse, GPT）,又称丙氨酸氨基转移酶（alamine aminotransferase,ALT）,作用于L-丙氨酸和 α–酮戊 二酸之间的氨基转移作用，其反应式如下：
• 酶活性的测定结果与温度、酶作用的时间、试剂加入 量等有关，操作时应严格掌握。
• 2,4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反应并不是特异的，α– 酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼作用而显色，此外， 2,4-二硝基苯肼本身也有类似的颜色，因此空白颜色较 深。
• 当测定结果超过150卡门氏单位时，应用生理盐水稀释 后再测。
1. 物质的颜色和波长：
可见光：波长（λ）400—760nm
紫外光：λ小于400nm
红外光：λ大于760nm
2. 溶液的颜色和光吸收的关系：
光的互补示意图
溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜 色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相 互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。
（三）利用吸收光谱对物质进行定量分析
1．原理 Beer-Lambert（比尔）定律：
T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I
A=KCL 其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射
光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光
程的厚度
2．常用方法 （1）标准曲线法
OD或Ａ
浓度 • 标准曲线与样品的测定条件必须一致。
α-酮戊二酸
COOH CH2 CHNH2 COOH 天冬氨酸
正常人各组织中ALT及AST 活性 (单位/克湿组织)