1398酶米氏常数Km的测定
学习指南11-1 过氧化氢酶米氏常数的测定
过氧化氢酶米氏常数的测定——学习指南
l 学习重点 1. 了解米氏常数的意义。
2. 掌握过氧化氢酶米氏常数的测定方法和操作。
l 知识要点
1. 米氏常数：酶反应速度达到最大反应速度（V max ）一半时的底物浓度，用K m 来表示，单位与浓度单位相同。
K m 值与酶的种类和作用底物有关，与酶浓度、底物浓度无关。
2. 双倒数作图法求K m 值：将米氏方程转变如下：
m max max
K 111v V [S]V =×+ 以1/v~1/[S]作图，可求得K m 值。
m
3. 过氧化氢酶：催化H 2O 2分解，产生H 2O 和O 2。
2H 2O 2 ¾¾¾¾¾
®过氧化氢酶 2H 2O ＋O 2↑ l 试剂 1. 0.02mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0）。
2. 0.01mol/L KMnO 4溶液。
3. 0.1mol/L H 2O 2溶液。
4. 25% H 2SO 4溶液。
l 材料
新鲜马铃薯
l 仪器 电子天平、组织匀浆器、循环水泵、抽滤装置、滴定管、滴定架、定时器、移液器、温度计
l 操作
l 注意事项
1. 准确控制每个体系的反应时间。
2.
酶浓度须均一，若酶浓度过大，反应时间过短，会造成较大误差
，应适当稀释。
米氏常数测定(精)
COOCH2 NHCH2OH
HCHO
COOCH2 NH(CH2OH)2
试剂器材
试剂
1. 10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）： 四种不同［S］的酪蛋白标准溶液。 2. 中性甲醛溶液：75mL分析纯甲 醛加15mL 0.25%酚酞乙醇溶液， 以0.1M NaOH滴至微红，密闭于 玻璃瓶中。（自己配制） 3. 0.25%酚酞乙醇溶液： 4. 标准0.1M NaOH溶液。 5.胰蛋白酶溶液（已配好）
液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。
利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出V与 Km值。
注意事项
（1 ）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种， 如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速 逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研 究酶的活力以酶促反应的初速度为准。
此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底 物浓度 之间的定量关系。
双倒数作图法测定Km值： 1 Km 1 1 v V [S] V
胰蛋白酶的性质 胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精 氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解， 产生自由氨基端。
氨基的测定
甲醛滴定法
COOCH2 NH2
HCHO
实验十六
底物浓度对酶促反应速度的影响 ——米氏常数的测定
目的要求
（1）了解底物浓度对酶促反应的影响。
（2）掌握测定米氏常数Km的原理和方法
实验原理
Km定义： Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时 所对应的底物浓度。
Km的意义
Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同，同
一种酶与不同底物反应Km值也不同。
米氏常数的测定
一、目的要求
1.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度 Vm值。
二、原理
酶促反应v-[S]曲线
v
[S]
推导出米氏方程为：
Vm [ S ] v K m [S ]
其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度； Km 为米氏常数
0
0 0.8
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
0.30
0.6 0.2
各管加入1.0 mL 各管加入0.2 mL 各管加入2.0 mL
以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标， 绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。
(二）测定 15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。
（三） 数据处理
各管在722分光光度计测定波长405nm的OD 值 (OD405nm) 。 从 对 硝 基 苯 酚 标 准 曲 线 上 查 出 OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数), 计 算 出 各 种 底 物 浓 度 下 的 初 速 度 vo （ 单 位 以 molL-1min-1 表示），取倒数1/v填入表内。以 1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常 数Km和最大反应速度Vm。
（不做） 取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作：
3 0.3 0.5 4 0.4 0.4 5 0.5 0.3 6
pNP含量 (mol)
0.5mol/mL pNP (mL) H2O (mL) Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) 0.1 mol/L NaOH (mL) OD 405 nm
米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能 够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反 映出酶与各种底物的亲和力的强弱。
实验五 固体发酵纤维素酶米氏常数Km的测定
实验五固体发酵纤维素酶米氏常数Km的测定一、目的了解纤维素酶的种类和测定原理，掌握其活力的测定方法。
二、原理纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物(滤纸)水解，释放出还原糖。
在碱性、煮沸条件下，3，5一二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。
通过在540 run测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的滤纸酶活力。
以此代表纤维素酶的酶活力。
酶活定义以滤纸为底物，在一定反应条件（50℃，pH4.8，恒温1h）下，以水解反应中每小时催化底物水解形成1μmol葡萄糖的酶量为一个单位（U）。
三、试剂和溶液(一) 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。
1 DNS试剂称取3，5一二硝基水杨酸(10士0. 1)g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠log，在50℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至I 000mL，过滤。
贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。
2柠檬酸缓冲液，0. 05 mol/L pH 4.8(适用于酸性纤维素酶)称取一水柠檬酸4.83 g，溶于约750 mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g，用水定容至1000 mL。
调节溶液的pH到(4.8士0.05)备用。
注:也可采用pH4.8乙酸缓冲溶液:称取三水乙酸钠8. 16 g，溶于约750 ml，水中，加入乙酸2.31 ml，用水定容至1 000 ml.调节溶液的pH到(4.810.05)备用3葡萄糖标准贮备溶液（4mg/ml）同实验四上述系列浓度应根据需要自行调整。
.5快速定性滤纸(杭州新华一号滤纸)沪15 cm(每批滤纸，使用前用标准酶加以校正)。
(二) 仪器除普通实验室仪器外，还应有:1分光光度计2酸度计精度10.01 pH 3恒温水浴(50士0.l)0C4分析天平感量0.1 mg 5磁力搅拌器6秒表或定时钟7沸7k洛(可用800W申炉和高脚烧杯、楠夸量杯或茸楠奔器切成) 8具塞刻度试管25 mL四、操作步骤4.1绘制标准曲线按表A. l规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液(A.2.5)、缓冲溶液(A.2.2或A.2.3)和DNS试剂(A.2.1)于各管中(每管号平行作3个样)，混匀。
米氏常数测定方法
酶活米氏常数实验一、实验前准备1、24孔板洗净烘干，准备足够枪头。
2、准备催化剂，在光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超声分散5min，期间准备底物（如TMB或者ABTS），浓度依照自己实验的要求定（10mg/mL 或5mg/mL），一般1mL足够用，可在1.5mL离心管中溶解。
TMB（外间冰箱上层）溶于DMSO（二甲亚砜，位于化学间王春雨的柜子里），ABTS（与TMB放在一起）溶于二次水。
3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、200µL和10µL移液枪、50µL排枪（位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中）、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中，放到对面酶标仪前，开空调定室温（25℃，提醒其他人随手关门），24孔板中其中一排加入适量H2O2（每孔1mL 左右，注意避光，可在板上盖一张卷纸），将缓冲液、催化剂、底物放实验台上，静置0.5-1h。
4、记录本上提前写好实验的加样顺序：催化底物TMB（或ABTS）的酶促动力学过程加样顺序：①200µL缓冲液②10µL催化剂③底物TMB（ABTS）(0，0.5，1，2，4，6，8，10µL) ④32µLH2O2（排枪加）催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序：①200µL缓冲液②10µL催化剂③H2O2（2，4，6，8，10，16，32，64µL）④10µL底物TMB（ABTS）（排枪加）数据记录按下表记，Code为每次读板时的微孔板编号，Time为对应的读板时的时间，一般30s读板一次，可根据反应的快慢来确定读板的时间。
Code 1 2 3 4 5 6 7TimeTMB 0 0.5 1 2 4 6 8 10V01Code 1 2 3 4 5 6 7TimeH2O2 2 4 6 8 10 16 32 64V01二、实验1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通），密码为5个0，按Enter键进入系统。
【米氏常数】 米氏常数测定实验的报告.docx
【米氏常数】米氏常数测定实验的报告.docx米氏常数是一个经验参数，它是用于测量基质和溶质之间相互作用的重要参数。
米氏常数的测定涉及到溶质和基质的相互作用，主要是通过溶解度进行测定。
下面就是本实验的报告。
实验背景米氏常数是用来描述溶质在溶液中浓度度量的非线性关系的参数。
米氏方程如下：Ksp = [A+]^m [B-]^n其中Ksp是溶解度积常数，[A+]和[B-]分别表示电离度为1的正离子和负离子的浓度，m和n分别为正离子和负离子在配位物中的摩尔数。
溶解度积（或离解平衡常数）是可以直接从溶解度数据中获得的参数，这些参数是根据溶解度测量推导出来的，通常采用天平法或者滴定法进行测量。
实验目的本实验的目的是测定铅酸盐的米氏常数，用溶解度法测定铅酸盐的溶度积常数，并根据米氏方程计算米氏常数。
实验原理铅酸盐在水溶液中的离解方程式：PbSO4(s) ⇆ Pb2+(aq) + SO42-(aq)溶解度积常数是根据溶解度求出的：对于低溶度度超取6.5，我们软件系统一压根对孔直接忽略其离子反应方程中的y。
实验流程1. 准备1 L的稀铅酸溶液（2 × 10-5 mol/L）2. 取0.2 mL的稀铅酸热解，目测重量大概是0.03 g左右。
3. 将稀铅酸加入100 mL的无铅纯水溶液中，然后调整pH值，使稀铅酸与水达到最大的平衡浓度。
4. 记录溶解度数值，并计算铅酸盐的溶解度积常数。
实验结果1. 初始重量为0.03 g的铅酸盐溶解后，其溶解度为5.5 × 10-5 mol/L。
2. 根据铅酸盐的溶解度计算溶解度积常数Ksp为3.025 × 10-9。
3. 根据米氏方程Ksp = [Pb2+][SO42-]，计算出米氏常数为1.79。
米氏常数测定实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握米氏常数（Km）及其与最大反应速度（Vmax）的关系。
2. 通过实验测定酶的米氏常数，了解酶与底物之间的亲和力。
3. 学习并掌握酶促反应动力学的基本原理和实验方法。
二、实验原理米氏常数（Km）是酶的特征性常数，表示酶与底物结合的亲和力。
在一定的实验条件下，酶促反应的初速度（v）与底物浓度（[S]）之间的关系可用米氏方程表示：\[ v = \frac{V_{max} [S]}{Km + [S]} \]当底物浓度很低时，酶促反应速度与底物浓度成正比，随着底物浓度的增加，反应速度逐渐加快，但增速逐渐减慢。
当底物浓度增加到一定程度时，反应速度达到最大值（Vmax），此时酶已全部被底物饱和。
本实验采用分光光度法测定酶的米氏常数。
实验中，通过改变底物浓度，测定不同浓度下酶促反应的初速度，根据米氏方程绘制v/[S]对1/[S]的曲线，通过线性回归分析求出曲线的斜率和截距，进而计算出Km和Vmax。
三、实验材料与仪器材料：1. 酶制剂（如蔗糖酶、淀粉酶等）2. 底物溶液（如葡萄糖溶液、淀粉溶液等）3. 碳酸盐缓冲液4. 4-氨基安替比林5. 铁氰化钾6. 0.1 mol/L NaOH溶液7. 葡萄糖标准溶液仪器：1. 分光光度计2. 移液管3. 移液器4. 恒温水浴5. 试管6. 比色皿四、实验步骤1. 制备酶溶液：将酶制剂溶解于适量的碳酸盐缓冲液中，调节pH值至最适值，稀释至一定浓度。
2. 制备底物溶液：将底物溶液稀释至不同浓度，备用。
3. 测定酶促反应初速度：a. 将不同浓度的底物溶液分别加入试管中，加入适量的酶溶液。
b. 将试管放入恒温水浴中保温一段时间。
c. 取出试管，立即加入适量的4-氨基安替比林和铁氰化钾，充分混匀。
d. 在分光光度计上测定溶液的吸光度，记录数据。
4. 数据处理：a. 以底物浓度[S]为横坐标，酶促反应速度v为纵坐标，绘制v/[S]对1/[S]的曲线。
b. 对曲线进行线性回归分析，求出曲线的斜率和截距。
米氏方程中km和vmax的测定
米氏方程中km和vmax的测定引言米氏方程是描述酶与底物之间反应速率的重要工具。
其中的两个关键参数是Km和Vmax，分别代表了底物浓度为一半时的反应速率和最大反应速率。
测定这两个参数对于了解酶的底物亲和性和催化效率至关重要。
本文将介绍两种常用的方法来测定Km和Vmax。
正文1. 双倒数法（Lineweaver-Burk plot）双倒数法是一种常见且简便的测定Km和Vmax的方法。
该方法基于米氏方程的倒数形式，可以将实验数据转化为线性关系，从而确定Km和Vmax。
实验步骤如下：1.1 准备一系列底物浓度的反应混合物，反应时间相同。
1.2 测定每个反应混合物的反应速率。
1.3 计算每个浓度下的倒数，即1/[S]和1/v。
1.4 绘制1/v和1/[S]的双倒数图。
1.5 通过拟合直线确定斜率（Km/Vmax）和截距（1/Vmax）。
1.6 由斜率和截距计算Km和Vmax。
该方法的优点是操作简单，不需要复杂的仪器设备。
然而，由于双倒数法在计算过程中引入了测量误差，因此结果可能存在一定的偏差。
2. 非线性回归法（Nonlinear regression）非线性回归法是一种更精确的测定Km和Vmax的方法。
该方法通过拟合米氏方程，直接得出Km和Vmax的数值。
实验步骤如下：2.1 准备一系列底物浓度的反应混合物，反应时间相同。
2.2 测定每个反应混合物的反应速率。
2.3 将实验数据带入米氏方程进行拟合，得到Km和Vmax的数值。
非线性回归法的优点是准确性高，结果更可靠。
然而，该方法需要借助计算机软件进行数据拟合，操作相对较复杂。
讨论通过以上两种方法，可以准确测定酶的Km和Vmax。
Km是衡量底物与酶之间亲和力的指标，Km越小，底物与酶结合越紧密；Vmax是酶催化反应的最大速率，反映了酶的催化效率。
在实际应用中，选择合适的测定方法需要考虑多个因素，包括实验条件、酶的性质以及研究目的。
双倒数法适用于简单的酶底物体系，操作简单快捷；非线性回归法适用于复杂的酶底物体系，结果更为准确可靠。
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测定Km和Vm，可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver测定 可通过作图法求得。 最常用的 Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形 双倒数作图法。 双倒数作图法 式，即：
以1/v对1/[S]作图，可得一条直线
1 Km 1 1 = ⋅ + v Vm [ S ] Vm
1/v
1/Vm
1 1.6
2 2
3 3
4 4
5 5 0.25 0.75 1
6 6 0.3 0.7 1
7 7 0.35 0.65 1
8 8 0.4 0.6 1
实验方法 0.08 0.1 0.15 0.2
0.92 1 0.9 1 0.85 1 0.8 1
40 ℃ ，pH7.5，10min ， TCA 2ml 40 ℃ ，10min，过滤 ， 滤液（ ） 滤液（ml） Na2CO3（ml） （ ） 福林试剂（ ） 福林试剂（ml） 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1
50ml•N00mlˆ&€ô 1 瓶 研钵、 光光 温 计
实验方法
酶液的准备
蛋白酶1g 称1398蛋白酶 蛋白酶 倒入研钵中，加入 倒入研钵中， 少量PBS缓冲液 少量 缓冲液 用研钵磨碎
定容至100ml 定容至
定容至50ml 取1ml定容至 定容至
过滤
40℃保温15分钟 ℃保温 分钟
0 酪蛋白浓度（ 酪蛋白浓度（mg/ml) 酪蛋白体积（ ） 酪蛋白体积（ml） PBS（ml） （ ） 酶液 0 0 1 1
1398酶米氏常数Km的测定 1398酶米氏常数Km的测定
实验目的
掌握米氏常数Km和Vmax测定的基本原理； 学习米氏常数Km值测定的方法； 测出1398酶以酪蛋白为底物时的米氏常数 Km。
Km值的意义 Km值的意义
• Km：米氏常数，是研究酶促反应动力学最重要的常数： ：米氏常数，是研究酶促反应动力学最重要的常数： • 它的数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物 它的数值等于酶促反应达到其最大速度 一半时的底物 浓度〔 〕 它可以表示酶和底物之间的亲和能力， 浓度〔S〕，它可以表示酶和底物之间的亲和能力，Km 值越大，亲和能力越弱，反之亦然。 值越大，亲和能力越弱，反之亦然。 • 可以确定一条代谢途径中的限速步骤：限速步骤就是一条 可以确定一条代谢途径中的限速步骤： 代谢途径中反应最慢的那一步， 代谢途径中反应最慢的那一步，Km值最大的那一步反应 值最大的那一步反应 就是，该酶也叫这条途径的关键酶。 就是，该酶也叫这条途径的关键酶。 • 它可以用来判断酶的最适底物，某些酶可以催化几种不同 它可以用来判断酶的最适底物， 的生化反应，叫多功能酶，其中Km值最小的那个反应的 的生化反应，叫多功能酶，其中 值最小的那个反应的 底物就是酶的最适底物。 底物就是酶的最适底物。 • Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关而与酶的浓 是一种酶的特征常数， 是一种酶的特征常数 度无关，与底物的浓度也无关，这一点与Vm是不同的， 是不同的， 度无关，与底物的浓度也无关，这一点与 是不同的 因此，我们可以通过Km值来鉴别酶的种类。 值来鉴别酶的种类。 因此，我们可以通过 值来鉴别酶的种类
实验原理
• 在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物 浓度对酶促反应的速度有很大的影响。
实验原理
• 酶促反应 酶促反应v-[S]曲线 曲线
v
[S]
• 推导出米氏方程为： 推导出米氏方程为：
Vm [ S ] v= K m + [S ]
• 其中 为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km 为米氏常数 其中[S]为底物浓度； 为初速度 为初速度； 为最大反应速度； 为底物浓度 为最大反应速度
40 ℃ ，20min，显色 ， OD650nm
数据处理
• 各管在可见光分光光度计测定波长650nm的 OD值(OD650nm)。从对Tyr标准曲线上查出 OD650nm相当于产物对Tyr的含量(µg数) • 计算出各种底物浓度下的速度v，取倒数1/v填 入表内。 V=Tyr微克数X4/10 1/v=1X2.5/Tyr微克数
结果计算
• 以1/v对1/[S]作图，求出1398酶催化酪蛋白水解的米 氏常数Km。
1 2 0.5 3 4 5 0.2 6 0.167 7 0.143 8 0.125
1/[s] 1/v
0.625
0.333 0.25
• Km=
所得结果(mg/ml=g/L) 2X104(MW)
mol/L
-1/Km
1/[S]
• 本实验测定1398酶催化底物酪蛋白水解的Km。 • 反应式：酪蛋白+H2O 酪氨酸
无色
蓝色
• 可通过分光光度法测定产物Tyr的含量，求出反应速 度v。
试剂和器材
试剂
氯 Na2CO3 2%¿#, 0.02Mj }¨ 试剂 缓 (PH7.5) （TCA） 试管27‹a试管架 ， 5ml 管