过氧化氢酶米氏常数的测定
实验一：米氏常数的测定
双倒数法测定过氧化物酶的米氏常数学院/专业/班级____________________________________________ 姓名_______________ 合作者___________________________________________________ 教师评定___________【实验目的】以过氧化物酶为例，掌握测定酶促反应初速率和米氏常数的原理及方法【实验原理】1913年，Michaelis 和Menten 运用酶反应过程中形成中间络合物的原理，首先提出了底物浓度和酶促反应速率的关系式，即著名的米氏方程：[][]S K S V v m max +⋅= 式中：v 为反应初速率（微摩尔浓度变化/min ）；V max 为最大反应速率（微摩尔浓度变化/min ）；[S ]为底物浓度（mol/L ）；K m 为米氏常数（mol/L ）。
这个方程式表明当已知K m 及V max 时，酶反应速率与底物浓度之间的定量关系。
K m 值等于酶促反应速率达到最大反应速率一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。
不同酶的K m 值不同，同一种酶与不同底物反应K m 值也不同，K m 值可以近似的反应酶与底物的亲和力大小：K m 越大表明亲和力越小；K m 越小表明亲和力越大。
大多数纯酶的K m 值在0.01~100 mmol/L 。
通过米氏方程的不同变形，可有多种求算米氏常数的方法，一般较常用的双倒数法，即取米氏方程的倒数式：[]max max m V 1S 1V K v 1+⋅=以v 1对[]S 1作图得一直线，该直线与横轴截距[]m K 1S 1=-。
过氧化物酶是一种对氢受体（H 2O 2） 底物有特异性，对氢供体底物缺乏特异性的酶，它可催化过氧化氢氧化许多多元酚或多元胺类底物发生显色、荧光或化学发光反应，可用于微量过氧化氢含量测定，也可以和其它酶反应系统偶联可用于测定许多与生命相关的物质：如葡萄糖、半乳糖、氨基酸、尿酸及胆甾醇等，亦是免疫分子和核酸分析中常用的标记物。
过氧化氢酶km值的测定实验报告
过氧化氢酶km值的测定实验报告过氧化氢酶（catalase）是一种重要的酶类，在生物体内起着重要的氧化还原作用。
本实验旨在通过测定过氧化氢酶的Km值，来研究该酶对底物浓度的敏感程度，从而深入了解过氧化氢酶的催化特性。
首先，我们需要准备实验所需的材料和试剂，包括过氧化氢酶样品、过氧化氢底物溶液、缓冲液、吸光度计等。
接着，按照实验方案，我们将过氧化氢底物溶液分别配制成不同的浓度，然后将不同浓度的底物溶液与过氧化氢酶样品混合，反应一定时间后，利用吸光度计测定反应体系中过氧化氢的浓度。
通过对不同浓度底物下反应体系中过氧化氢浓度的测定，我们可以得到不同底物浓度下过氧化氢酶催化反应的速率。
在实验过程中，我们需要注意保持反应体系的温度稳定，避免温度对反应速率的影响。
此外，为了减小误差，我们需要进行多次重复实验，取平均值作为最终结果。
在实验结束后，我们将利用实验数据，通过线性回归分析，计算出过氧化氢酶的Km值。
通过本实验，我们可以得到不同底物浓度下过氧化氢酶的催化速率，进而绘制出酶的底物浓度与催化速率的曲线。
通过分析曲线斜率的变化，我们可以得到过氧化氢酶的Km值。
Km值表示酶与底物结合的紧密程度，Km值越小，表示酶对底物的亲和力越大，反之亦然。
在实验结果分析中，我们可以得出不同底物浓度下过氧化氢酶的Km值，从而揭示了过氧化氢酶对底物浓度的敏感程度。
这有助于我们更深入地了解过氧化氢酶的催化特性和底物结合机制。
同时，对于医学和生物工程领域，对过氧化氢酶的Km值的准确测定也具有重要的应用意义。
综上所述，通过本实验的Km值测定，我们可以更深入地了解过氧化氢酶的催化特性和底物结合机制，为相关领域的研究和应用提供重要的参考依据。
希望本实验能为相关领域的研究工作提供一定的帮助和启发。
过氧化氢酶米氏常数
过氧化氢酶米氏常数各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢篇一：过氧化氢酶动力学常数测定实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定姓名：赵家熙指导教师：谭志文实验室：6503 组员：①章恒炯②③成绩：第三部分：实验记录与分析一、酶活力测定（一）原始数据1.样品原始质量：2.标定数据：（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：/L（4）KMnO4实际浓度：/L3.样品滴定数据消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）实验（2）对照（1）对照（2）（二）结果计算1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2O2）2.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mg H2O2/g?min）(A?B)?VT??V1?t酶活(mgH2O2/g·min)=酶活(mgH2O2/g·min)=（A-B）= VT====10min二、动力学常数的测定（一）原始数据（二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度V0（三）以1/V0对1/[S]0作图（用excel 作图）1/s 1/v2008040（四）求出Km（mol/L）和Vmax （mmol/min）Km11?? vv[S]v如（三）中图maxmaxy=+ x=0时y=1/Vmaxy=0时x=-1/KmKm= Vmax=第四部分：课后研讨题1.总结本实验操作过程的注意事项。
1酶的提取和存放一般在0-4℃下进行。
2每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5min。
3各反应瓶的滴定终点微红色为同一标准。
4使用前应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴加入。
2.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?1、温度，温度过高或者过低会降低过氧化氢酶的活性。
2、酸碱度，酸或碱浓度太高会使过氧化氢酶失活。
3.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?R(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3++OH－) R(Fe3+OH－)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O24.在反应速度的测定中，加入硫酸有哪些作用？终止反应,为下一步的滴定提供酸的环境。
《酶工程实验》word版
实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。
二、实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km三、实验器材1.锥形瓶100～150ml（×6）。
2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。
3.温度计（0～100℃）。
4.微量滴定管5ml（×1）。
5.容量瓶1000ml（×1）。
四、实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。
2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。
3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。
4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。
5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O223ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色）。
6、25% H2SO4五、操作取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一过氧化氢酶米氏常数的测定管号试剂0123450.05mol/L H2O2/ml蒸馏水/ml酶液/ml9.50.51.008.500.51.258.250.51.677.830.52.57.00.55.004.500.5先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。
实验六--过氧化氢酶米氏常数(Km)的
.
五、计算
1.反应速度的计算: 以反应消耗的H2O2 mmol数表示。
反应速度=加入的H2O2 mmol数－剩余 的H2O2 mmol数
即: H2O2 mol浓度×加入的毫升数－ KMnO4 0.004 mol/L×消耗的KMnO4 毫升数× 5/2
③底物浓度［S］=②÷5 0.01
2 1.00 0.08 0.02
3 1.50 0.12 0.03
4 2.00 0.16 0.04
5 2.50 0.20 0.05
④酶作用后，KMnO4滴定 ml
⑤剩余H2O2mmol=④ ×0.004×5/2
1.35 0.0135
3.70 0.037
6.40 0.064
实验七 过氧化氢酶米氏常
数（Km）的测定
.
一、实验目的
学习米氏常数（Km）的测定方法。
.
二、实验原理
过氧化氢酶(CAT)催化下列反应: 2H2O2→2H2O+O2↑ H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下
滴定测知。 2KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4 →
2MnSO4＋K2SO4＋5O2↑＋8H2O 求出反应前后H2O2的浓度差即为反应
2．H2O2浓度的标定: 取洁净锥形瓶两只， 各加浓度约为0.05mol/L的H2O2 2.0ml和 25%H2SO4 2.0ml，分别用0.004mol/L KMnO4 滴定至微红色。从滴定用去KMnO4ml数，求出 H2O2的mol浓度。
.
3．反应速度的测定: 取干燥洁净 50ml锥形瓶5只，编号，按下表 操作。
.
加入物(ml) H2O2(约 0.05mol/L) 蒸馏水 血液稀释液
10 过氧化氢酶米氏常数的测定
本实验以鼠肝匀浆中的过氧化氢酶为例，测定其 Km值和Vm值。
过氧化氢酶
2H2O2
2H2O + O2
2KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4
2MnSO4 + K2SO4 + 5O2↑ + 8H2O
过氧化氢酶催化H2O2分解成H2O和O2； 反应后剩余的H2O2用KMnO4在酸性溶液中滴定；
通过滴定KMnO4的消耗量求出反应前后H2O2的浓度差 即为反应速度v；
试剂 (ml)
0.04mol/L H2O2 H2O
肝匀浆液1:500
10％H2SO4
记录0.02mol/L KMnO4用量 底物浓度[S] (mmol/L) 反应速度v (mmol/10min) [S]/v (10min/L)
1号瓶 2号瓶 3号瓶 4号瓶 5号瓶
25
20
15
10
5
0
5
10
15
20
放入37℃水浴5分钟
v
Vmax[S] =K─m─+─[S─]
Vmax：最大反应速度 Km：米氏常数
初速率 v
80 Vm
60
Vm 40 2
动力学曲线
20
K
m
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
底物浓度 [S]
Km值：可通过对米氏方 程 作 图 (V~[S] 图 ) 求 出 。 在数值上等于酶促反应 速度为最大速度一半时 的底物浓度值。单位是 mol/L(或mmol/L)。
0.01
0.015
0.0218 0.025
0.02 v/[S] (L/10min)
14
*Excel直线作图
食品酶学
第一部分 实验一、 原理1、过氧化氢酶米氏常数的测定：H 2O 2被过氧化氢酶分解出H 2O 和O 2，未分解的H 2O 2用KMnO 4在酸性环境中滴定，根据反映前后H 2O 2的浓度差可以求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km2、黄素蛋白酶的定性试验：黄素蛋白酶是以黄素核莓酸（FMN 或FDA ）为辅基的脱氢酶类。
某些黄素蛋白酶还含有铁、铜或钼类金属离子。
分子中核黄素部分能与氢原子可逆地结合，从而引起递氢作用。
N N C NH CN O O CH 2(CHOH)3CH 2OH H 3C H 3C N H N CNH C H N O O CH 2(CHOH)3CH 2OH H 3C H 3C +2H -2H这类脱氢酶可以催化脱去底物分子中的氢氧或从还原态辅酶Ⅱ（NADH,H+及NADPH ，H+）上把氢传给氧。
在无氧条件下，可用甲烯蓝代替氧。
例如牛乳中的黄嘌呤氧化酶就是黄素蛋白酶的一种。
它能催化水合甲醛把氢交给甲烯蓝3、酵母蔗糖酶的部分纯化与酶活测定：酵母中含有丰富的蔗糖酶（EC3.2.1.26），本实验以酵母为原料，首先通过研磨法以及温度差破碎法破碎细胞的方式得到粗酶，之后先通过调节pH 到5.0杂蛋白的等电点，不影响酶活的情况下，使其凝聚沉淀，最后保温至最适温度反应后，通过测定没催化产物量来间接测定酶活。
细胞破碎方法有机械破碎法（通过机械运动所产生的剪切力的作用使细胞破碎的方法），物理破碎法（通过压力、温度、声波等各种物理因素的作用使组织细胞破碎的方法，常用的有温度差破碎法、压力差破碎法和超声波破碎法）和化学破碎法（通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方法）。
研磨法是利用研体、石磨、细菌磨、球磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎，必要时可以加入精制石英砂、小玻璃球、玻璃粉、氧化铝等作为助磨剂，以提高研磨效果。
研磨法设备简单、可以采用人工研磨液可以采用电动研磨。
实验二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定
1 0.50
2 0.67 8.83
编号 3 0.83 8.67
4 1.25 8.25
5 2.50 7.00
各瓶分别加好H2O2和蒸馏水后，再依次加入酶液 0.5mL，混匀，记录各瓶起始反应的时间。30℃反应 5min后立即加入10% H2SO4 5.0mL终止反应。
2.滴定
用0.02mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色， 记录消耗的KMnO4溶液毫升数。 分别求出各瓶反应前后的底物浓度[S]0、[S]1，并计算反 应速度v： [S]0为反应前的底物浓度（mol/L） [S]0=C1V1/10 [S]1为反应后的底物浓度（mol/L） [S]1=2.5C2V2/10 C1为H2O2的浓度（mol/L） v=(C1V1-2.5C2V2)/5 C 为KMnO 用液的浓度（mol/L）
结果记录 与计算
高锰酸钾溶液标定
取5mL 0.1mol/L的草酸和3mL 10% H2SO4溶液于锥形瓶中， 加热至（75～85）℃（见冒热气），趁热用KMnO4标准溶液 滴定，刚开始反应较慢，滴入一滴KMnO4标准溶液摇动，待 溶液褪色，再加第二滴KMnO4（此时生成的Mn2+起催化作 用）。随着反应速度的加快，滴定速度也可逐渐加快，但 滴定中始终不能过快，，不断摇动或搅拌。滴定至溶液呈 现微红色并持续半分钟不褪色即为终点。
与反应速度的关系
v为反应速度 [S]为底物浓度 vmax为最大反应速度 Km为米氏常数
米氏常数Km
Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。 在酶学分析中， Km是酶的一个基本特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。
Km表示酶和底物之间的亲和能力， Km值越大，亲和能 力越弱，反之亦然。
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过氧化氢酶米氏常数的测定一、实验目的
了解并掌握米氏常数的意义和测定方法
二、实验原理
H 2O
2
被过氧化氢酶分解出H
2
O和O
2
，未分解的H
2
O
2
用KMnO
4
在酸性环境中滴
定，根据反应前后H
2O
2
的浓度差可求出反应速度。
2H
2O
2
= 2H
2
O + O
2
2KMnO
4 + 5H
2
O
2
+ 3H
2
SO
4
= 2MnSO
4
+ K
2
SO
4
+ 5O
2
↑ + 8H
2
O
本实验由马铃薯提供过氧化氢酶。
在保持恒定的条件下，用相同浓度的过
氧化氢酶催化不同浓度的H
2O
2
分解。
在一定限度内，酶促反应速度与H
2
O
2
浓度
成正比。
用双倒数作图法(即以1/v对1/[S]作图)可求得过氧化氢酶的Km值。
三、实验器材
锥形瓶(6个) 吸管、酸式滴定管
四、实验试剂
1、0.02mol/L 磷酸缓冲液(pH=7)
2、0.004 mol/L KMnO
4
(需标定)
3、0.05 mol/L H
2O
2
(需标定) 4、25% H
2
SO
4
五、实验操作
1、酶液的提取：称取马铃薯（去皮）5克，加0.02mol/L 磷酸缓冲液10mL，再加少量海砂，研磨成匀浆，离心(3000r/ min，10min)，上清液即为酶液。
2、滴定：取干燥锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：
先加好0.05mol/L H
2O
2
及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起
始反应时间。
各瓶时间达5min时立即加2.0mL 25% H
2SO
4
终止反应，充分混
匀。
用0.004 mol/L KMnO
4滴定各瓶中剩余的H
2
O
2
至微红色，记录消耗的KMnO
4
体积。
六、实验计算
分别求出1─5瓶的底物浓度[S]和相应的反应速度v。
C 1V 1
10
[S] = 5 ∕2C2V2
C 1V
1
–
v =
式中 [S]：为底物物质的量浓度(mol/L)
C 1：为H
2
O
2
物质的的量浓度(mol/L)
V
1：为H
2
O
2
的体积(mL)
10：反应的总体积
v：反应速度(mmol/min)
C 2: KMnO
4
物质的量浓度(mol/L)
V
2：KMnO
4
的体积(mL)
以1/v对1/[S]作图求出Km。
七、实验注意事项
( 1 ) 按表先加H
2O
2
及蒸馏水。
( 2 ) 准确控制各瓶中酶促反应时间尽量一致。
( 3 ) 各种试剂的加量应准确。