分光光度法测定蔗糖酶的米氏常数
蔗糖酶米氏常数的测定预习报告
蔗糖酶米氏常数的测定预习报告一、实验目的1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响。
2.学习测定米氏常数的原理和方法。
二、实验原理在酶的研究应用中，人们经常会遇到底物浓度对酶反应速度的影响的问题。
Michaelis 和Menten 得到了一个表示底物浓度与反应速度之间相互关系的方程式，称为米氏方程式。
][][S Km ＋S νυ=式中v 为最大反应速度，Km 为米氏常数。
由上式可见，米氏常数是当酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。
其单位是浓度单位，一般用mol/L 或mmol/L 表示。
米氏常数是酶的特征性物理常数。
一种酶，在一定的实验条件(25℃，最适pH)下，对某一种底物，有一定的Km 值。
不同的酶有不同的Km 值。
因此，测定酶的Km 值可以作为鉴别酶的一种手段。
米氏常数的求法很多，但是，最常用的是LineweaVer —Burk 的作图法(双倒数作图法)。
将米氏方程式改写为下列倒数形式：实验时，选择不同的[S]，测定相应的v ，求出两者的倒数，以1/[S]为横坐标，以1/[v]为纵坐标作图，绘出一条直线(图84-1)，外推至横轴相交，横轴截距即为-1/Km 。
此法由于方便而应用最广，但亦有缺点，实验点过分集中于直线的左端，因而作图不易十分准确。
图84-1 酶促反应速度倒数与底物浓度倒数的关系曲线三、实验用品1.器具：722分光光度计、恒温水浴试管、吸量管、秒表、坐标纸、血糖管。
2.药品：⑴0.1mol/L蔗糖溶液⑵0.2mol/L NaAc缓冲溶液(pH4.6)⑶lmol/LNaOH溶液，2mol/LNaOH溶液⑷3,5-二硝基水杨酸试剂：称取10g 3,5-二硝基水杨酸溶于200ml mol／L NaOH中，加入300g酒石酸钾钠·4H2O，再用去离子水稀释至2000ml。
3.材料：自制蔗糖酶溶液。
四、实验方法1.取试管12支，按1～12编号，1号为空白。
2.按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入12支试管中，于35℃水浴中保温10min。
蔗糖酶的分离提纯
蔗糖酶的分离提纯【实验目的】1．了解蔗糖酶分离提纯的方法。
2．掌握离心技术、电泳技术、层析技术、膜分离技术和分光光度法。
【实验原理】蔗糖酶[Ec 3．2．1．26]习惯命名β--D--Fructofuranosidase 系统命名：β--D —Fructofuranosideffructonydrolase 。
蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。
它所催化的反应是：H OH OH H蔗糖+H OH OH H葡萄糖 果糖蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。
在微生物中，酵母中的含量很丰富。
在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。
我们实验室的研究表明采用菌体自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE--纤维素柱层析两步分离提纯步骤，就可制备纯度较高的蔗糖酶制剂，而且收率也较好。
从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性质、动力学研究也十分方便。
【实验材料、仪器和试剂】 1．实验材料和试剂(1)0．2％葡萄糖标准液；(2)3，5-二硝基水杨酸试剂；(3)新鲜啤酒酵母； (4)甲苯；(5)乙酸钠；(6)稀乙酸溶液；(7)95％乙醇；(8)DEAE--纤维素；(9)0.5mol ／L NaOH ；(10)0.5mol ／L HCl ；(11)0.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(12)含O.15mol ／L NaCl 的O.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲CH 2OHH OHHHOHCH 20H液；(13)5％蔗糖；(14)测定蛋白质浓度试剂；(15)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂2．仪器(1)恒温水浴；(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰盐浴；(4)离心机；(5)721型分光光度计；(6)柱层析装置；(7)天平；(8)pH计； (9)滴管、试管和血糖管；(10)秒表【实验操作】一、葡萄糖浓度标准曲线的制作1．取10支血糖管，按下表加入0．2％葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。
《物理化学实验》课程实验教学大纲
《物理化学实验》课程实验教学大纲一、实验课程名称：中文名：物理化学实验英文名：Physical Chemistry Experiment二、课程性质：必修课三、开放实验项目数：0四、适用专业及年级：化学师范、应用化学专业、化学工程与工艺三年级五、实验教科书、参考书：（一）教科书1、东北师范大学等校编《物理化学实验》高等教育出版社 2002年（二）参考书1、复旦大学等校编《物理化学实验》高等教育出版社 2000年2、上海师范大学物理化学教研室自编《物理化学实验》六、学时学分：1、化学师范：课程总学时：90 实验学时：90 课程总学分：52、应用化学专业：课程总学时：90 实验学时：90 课程总学分：43、化学工程与工艺专业：课程总学时：72 实验学时：72 课程总学分：2七、实验教学的目的与基本要求：目的：培养学生熟悉物理化学实验基本方法,掌握物理化学实验中的基本技术(如控温和测温技术、量热技术、差热分析技术、压力测量技术、真空技术、电化学测量技术、光学技术、磁学测量技术等)，加深对物理化学基本理论的理解和提高运用这些基本理论的能力。
基本要求：通过物理化学实验，要求学生能掌握物理化学的基本实验技术和技能，学会重要的物理化学性能测定，掌握物理化学实验仪器设备的基本原理和操作技术，熟悉物理化学实验现象的观察和记录，实验数据的测量和处理，实验结果的分析和归纳等一套严谨的实验方法，培养严格的科学实验态度和增强解决实际化学问题的能力。
八、实验课考核方式：（1）实验报告：实验报告要求用专门的物化实验报告纸撰写，其中需要作图的内容用方格纸作图。
实验报告应包含实验目的、实验原理、实验过程、对原始数据的记录、处理、分析、及对实验结果的总结和相关参考资料的说明。
（2）考核方式a. 第一学期笔试、第二学期操作；b. 平时实验成绩平均分占实验课成绩70%，实验的考核成绩占实验课成绩30%。
九、实验课程内容及学时分配：注：实验1-12：化学师范、应用化学和化学工程与工艺专业均必做；实验13-16：化学师范和应用化学专业必做，化学工程与工艺专业选做；实验17-18：化学工程与工艺专业必做；化学师范和应用化学专业选做。
分光光度法测定蔗糖酶的米氏常数
分光光度法测定蔗糖酶的米是常数一．实验目的：1. 用分光光度法测定蔗糖酶的米是常数M K 和最大反应速率m ax v 。
2. 了解底物浓度与酶反应速率之间的关系3. 掌握分光光度计的使用方法二．实验原理：酶是由生物体内产生的具有催化活性的蛋白质。
它表现出特异的催化功能，因此叫生物催化剂。
酶具有高效性和高度选择性，酶催化反应一般在常温、常压下进行。
在酶催化反应中，底物浓度远远超过酶的浓度，在指定实验条件时，酶的浓度一定时，总的反应速率随底物浓度的增加而增大，直至底物过剩此时底物的浓度不再影响反应速率，反应速率最大。
Michaelis 应用酶反应过程中形成中间络合物的学说，导出了米氏方程，给出了酶反应速率和底物浓度的关系：sM s c K c v v +⋅=max 米氏常数M K 是反应速率达到最大值一半时的底物浓度。
测定不同底物浓度时的酶反应速率，为了准确求得M K ，用双倒数作图法，可由直线方程：maxmax 111v c v K v s M +⋅= 以v1为纵坐标，s c 1为横坐标，作图，所得直线的截距是m ax 1v ，斜率是m ax v K M ，直线与横坐标的交点为MK 1-。
本实验用的蔗糖酶是一种水解酶，它能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖。
该反应的速率可以用单位时间内葡萄糖浓度的增加来表示，葡萄糖与3,5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定浓度范围内，葡萄糖的量和棕红色物质颜色深浅程度成一定比例关系，因此可以用分光光度计来测定反应在单位时间内生成葡萄糖的量，从而计算出反应速率。
所以测量不同底物（蔗糖）浓度s c 的相应反应速率v ，就可用作图法计算出米氏常数M K 值。
三．仪器与试剂：高速离心机一台；分光光度计一台；恒温水浴一套；比色管（25ml ）9支；称液管（1ml ）10支；称液管（2ml ）4支；试管（10ml ）10支；3,5-二硝基水杨酸试剂（即DNS ）；0.1mol.dm -3醋酸缓冲溶液；蔗糖酶溶液；蔗糖（分析纯）；葡萄糖（分析纯）。
分光光度法测定蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)酶活性
蔗糖是重要的光合产物，是植物体内运输的主要物质，优势碳水化合物的暂贮形式之一。
蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物体内催化蔗糖合成的两种酶。
对这两种酶活性的测定，可以了解植物组织合成蔗糖能力的高低。
【实验原理】蔗糖合成酶催化游离果糖与葡萄糖工体UDPG反应生成蔗糖。
UDPG+果糖---蔗糖+UDP这是一个可逆反应，平衡常数为1.3-2.0。
该酶在分解方向的Km值相对较高（30-150mmol/L），细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行。
蔗糖合成酶活性测定既可在合成方向进行测定（外加底物UDPG和果糖，测产物蔗糖的量表示酶活性），也可以在分解方向进行测定（外加蔗糖和UPD，测定果糖含量表示酶活性）。
蔗糖磷酸合成酶（SPS）催化UDPG与果糖-6-磷酸（F6P）结合形成磷酸蔗糖：UPDG+F6P---蔗糖-6-P+UDP+H+6-磷酸蔗糖可以经磷酸蔗糖酶（SPP）水解后形成蔗糖。
实际上最近有证据证明SPS 和SPP可以在体内形成一个复合体，因此使得SPS催化的反应基本上是不可逆的。
酶活性测定是外加UDPG和F6P，测定产物蔗糖的量表示酶活性。
一般把SPS-SPP系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是催化蔗糖分解的。
果糖是酮糖，可与间苯二酚混合加热反应生成红色产物，在一定范围内糖的含量与反应液颜色成正比。
蔗糖在含有盐酸的间苯二酚中水解成葡萄糖和果糖，也能生成红色产物，在480nm处可比色测定。
【实验材料】植物茎【仪器设备及设备】冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平（感量0.01mg），0.1、0.5、1、5ml移液管各1个，10ml具塞试管10支，5ml量瓶一个，冰箱【试剂药品】1.提取缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含5mmol/LMgCl 2,2mmol/LEDTA-Na 2,2%乙二醇，0.2%牛血清蛋白（BSP），2%PVP，5mmol/LDTT。
14 生物化学实验--酵母蔗糖酶米氏常数的测定
酵母蔗糖酶米氏常数的测定【目的】1 ．掌握蔗糖酶米氏常数测定的方法及原理。
2 ．熟悉蔗糖酶米氏常数测定的及意义。
3 ．验证底物浓度对酶促反应速度的影响。
【原理】当环境温度、 pH 和酶浓度等条件一定时，酶促反应的初速度（V ）随底物浓度 [ S ] 增高而加快，直至达到一个极限，即最大反应速度（V max ）。
依据底物浓度与酶促反应初速度的这种关系，米–曼（ Michaelis-Menten ）氏推倒出如下公式，称为米–曼氏方程式（式 3-1 ）。
方程式中 K m 称为米氏常数， K m 是酶的特征性常数，等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度， K m 可以近似地表示酶与底物亲合力的大小， K m 愈小，表明酶与底物的亲合力愈大。
测定 K m 是研究酶促反应动力学的一种主要方法。
林–贝（ Lineweaver-Burk ）氏将米–曼氏方程式等号两边取倒数得到的双倒数方程为林–贝氏方程式（式 3-2 ）。
实验选择不同的 [S] ，测定相对应的 V ，以 1/V 对 1/[S] 作图，得到一个斜率为 K m /V max 的直线，将直线外推与横轴相交，其横轴上截距即﹣ 1/ K m （图 3-7 ），由此求出 K m 。
V = （式 3-1 ）= ? + （式 3-2 ）斜率： K m /V maxY 轴截距： 1/V maxX 轴截距：﹣ 1/K m图 3-7 双倒数作图法本实验以酵母蔗糖酶为例。
应用制备的酵母蔗糖酶，在 pH5.0 的醋酸缓冲液中，30 ℃ 条件下测定其 K m 值。
其过程是：当酵母蔗糖酶在有缓冲液存在时与不同浓度的蔗糖混合，保持反应液的温度30 ℃ ，反应 5min 后，测定还原糖生成量（还原糖的定量测定，参见第 3 篇实验 18 ）。
以还原糖的生成量代表反应开始阶段的初速度 ( V ) ，按照 Lineweaver–Burk 作图法求得 K m 值。
【器材】1 ．中号试管2 ．刻度吸量管3 ．微量移液器4 ．恒温水浴箱5 ．冷冻离心机6 ．分光光度计【试剂】1 ． 0.2M pH5.0 醋酸缓冲液0.2M 醋酸 30ml 与 0.2M 醋酸钠 70ml 混合2 ．醋酸钠3 ． 1 M 醋酸4 ． 0.03M 蔗糖溶液(1) 蔗糖的纯化：在做实验前 , 用 Bendiet 氏试剂检验蔗糖中是否有还原糖存在，如果有还原糖则需要将蔗糖纯化，纯化利用蔗糖和还原糖在乙醇中溶解度的差异 ( 表 3 -7 ) ，蔗糖在绝对量上最多，将少量的还原糖从蔗糖中洗去。
分光光度法测蔗糖酶米氏常数_数据处理方法
For i = 2 To n c4 ( i ) = ( a2( i ) - b1) / mL ∋葡萄糖的浓度 V ( i ) = c4( i ) / t ∋蔗糖的反应速度
Nex t i c = 0 ( d = 0 ( Sxx = 0 ( Syy = 0 ( Sxy = 0 ∋最小二乘法直线拟合 For i = 2 T o n c = c + X( i ) (d = d + Y( i ) Nex t i ax = c / ( n- 1) (ay = d / ( n- 1) For i = 2 T o n xt = X( i ) - ax ( yt = Y ( i ) - ay Sx x = Sx x + xt * xt ( Sy y= Sy y+
For m1. H ide
∋隐藏窗体 For m1
co( 1) = Val( T ex t 7. T ex t ) ∋将对象 T ex t7
的 T ex t 属性转换为数值赋给数组元素 co ( 1)
yt* yt ( Sxy= Sxy+ xt* yt
Nex t i
K2 = Sxy / Sx x ( b2 = ay - K 2 * ax ( r2 =
的学说, 导出了著名的米氏方程, 即
V = V max & Cs / ( Km+ Cs) .
( 1)
式中 V 为反应速率, Cs 为底物浓度, Km 为米氏
常数.
米氏常数是反应速率达到最大值的一半时的
底物浓度, 即当 V = 1/ 2V max 时, Km = Cs, 基于
这一点, 测定不同浓度时的酶反应速率,
1 实验原理
酶是由生物体内产生的具有催化活性的一类 蛋白质, 表现出特异的催化功能. 酶的催化效率
紫外分光光度法测定蔗糖含量
从试验结果可见该方法具有很好的选择性和较 高的灵敏度 ,适用于各种饮料中的蔗糖含量测定 。
(下转第 365 页)
·363 ·
夏岫云 : ED TA 滴定法测定稀土镁硅铁中氧化镁
本文选择重铬酸钾溶液溶解样品 。 2. 2 溶样时间的确定
蔗糖在盐酸介质中发生水解产生果糖和葡萄 糖 ,果糖在盐酸的作用下生成羟甲基糠醛[6] ,通过对 产物的吸收光谱进行扫描 ,发现在 291 nm 波长处 有最大吸收 。蔗糖浓度在0～50 mg ·L - 1 范围内服 从比耳定律 。本法只加入盐酸 ,不加入其它显色物 质 ,样品无需预处理 ,方法简便 、快速 、灵敏 ,无污染 。
1 试验部分
1. 1 试剂与仪器 蔗糖标准溶液 : 0. 200 0 g ·L - 1 ,称取蔗糖 (分
析纯试剂) 01 200 0 g 溶于二次蒸馏水 ,并定容到 1 L。
TU21201 紫外可见分光光度计 水为二次蒸馏水 1. 2 试验方法 在具塞比色管中加入适量的 0. 200 0 g ·L - 1 蔗 糖标准溶液 , 加入浓盐酸 3 mL , 用二次水定容至 10 mL 。在沸水中加热 8 min ,取出用流水冷却. 用 1 cm 比色皿 ,以试剂空白为参比 ,于 291 nm 波长处 测定其吸光度 。
按试验方法进行了干扰试验 ,结果表明 ,维生素 C 、柠檬酸 、2 g ·L - 1 苯甲酸钠对测定没有干扰 。 2. 6 工作曲线的绘制
吸取 0. 200 0 g ·L - 1 蔗糖标准溶液 0. 0 ,0. 5 , 1. 0 ,1. 5 ,2. 0 ,2. 5 mL ,按试验方法测定吸光度 ,绘 制工作曲线 ,蔗糖含量在 0～50 mg ·L - 1 范围内服 从比耳定律 ,线性方程 A = 0. 016 4 c + 0. 009 6 ,相 关系数为 0. 998 4 。对 40 mg ·L - 1 蔗糖进行 11 次 测定 ,相对标准偏差为 2. 6 %。 2. 7 样品分析
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实验报告解析
（目的要求、基本原理、仪器试剂和实验步骤四个部分可参阅实验预习或者实验内容部分，数据处理部分参见数据处理）
一、实验重点
1、掌握本实验的基本原理。
2、掌握实验中用到仪器的操作方法，并能熟练使用。
3、了解实验中的注意事项并能解释为什么。
二、实验难点
1、葡萄糖标准曲线的绘制
2、反应实验条件的控制
三、注意事项
1、分光光度计使用注意事项：
(1)使用前，使用者应该首先了解本仪器的结构和原理，以及各个旋钮之功能。
(2)仪器接地要良好，否则显示数字不稳定。
(3)如果大幅度改变测试波长时，在调整“00.0”和“100”后稍等片刻（因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间），当稳定后，重新调整“00.0”和“100”即可工作。
(4)仪器左侧下角有一只干燥剂筒，应保持其干燥，发现干燥剂变色应立即更新或烘干后再用。
(5)当仪器停止工作时，关掉电源，电源开关需同时切断，并罩好仪器
2、葡萄糖标准曲线的绘制要精确
3、反应条件要严格安要求控制
四、思考题回答
1、为什么说米氏常数是一个特征性常数，而且最大反应速度不是？
米氏常数是酶的特征性常数，可用来表示酶和底物亲和力的大小。
米氏常数与底物浓度和酶浓度无关，而受温度和pH值的影响，竞争性抑制剂米氏常数增大，最大反应速度不变；非竞争性抑制剂米氏常数不变，最大反应速度减小；反竞争性抑制剂米氏常数减小，最大反应速度减小。
Km：米氏常数，是研究酶促反应动力学最重要的常数。
它的意义如下：它的数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度〔S〕，图示以及公式推导。
它可以表示E与S之间的亲和能力，Km值越大，亲和能力越强，反之亦然。
它可以确定一条代谢途径中的限速步骤：代谢途径是指由一系列彼此密切相关的生化反应组成的代谢过程，前面一步反应的产物正好是后面一步反应的底物，例如，EMP途径。
限速步骤就是一条代谢途径中反应最慢的那一步，Km值最大的那一步反应就是，该酶也叫这条途径的关键酶。
它可以用来判断酶的最适底物，某些酶可以催化几种不同的生化反应，叫多功能酶，其中Km值最小的那个反应的底物就是酶的最适底物。
Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关而与酶的浓度无关，与底物的浓度也无关，这一点与Vm是不同的，因此，我们可以通过Km值来鉴别酶的种类。
但是它会随着反应条件（T、PH）的改变而改变。
2、为什么测定酶的米氏常数要采用初始速度法？
米氏方程式是根据中间产物理论推导出来的。
即在酶催化反应中，酶（E）和底物（S）首先生成中间产物（ES），然后分解成产物（P）和游离酶（E）：
（1）
、、代表反应各步的速率常数。
当反应以恒态进行时，ES的生成速率等于分解速率，即
（2）
式中、和分别代表酶、底物和中间产物的浓度。
令
（3）
设反应前酶的初始浓度为,则
（4）
由（3）和（4）式得：
（5）
当酶的浓度一定时，测定的是底物反应的初速率，那么由S P 的反应速率为，但在反应方程式（1）中，ES的分解速率很慢，这一步成了总反应的决定步骤，则有
（6）
在反应开始阶段，底物浓度的增加，反应速率也随着增加；当增加到过剩时，进一步增加不再影响反应速率了，即达到。
此时绝大部分酶与底物都结合了。
可近似地看作,则有：
因此测定酶的米氏常数要采用初始速率法。
3、试讨论本实验对米氏常数的测定结果与底物浓度、反应温度和酸度的关系。
米氏常数的测定结果准确与否与酶的活性有莫大的关联而酶是一种活性蛋白质，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性，
同时也影响着米氏常数的测定。
酶与底物作用的活性，受温度、pH 值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。
(一) 温度
酶的催化作用，只有在一定温度下才能表现出来。
酶的作用速度与温度的关系为：当酶蛋白没有因受热而变性时，温度每升高10℃，反应速度增加一倍左右。
通常酶的作用速度随温度升高而加速，但温度升高到一定限度后，酶的活性就要钝化，直至完全失活。
(二) pH值
pH值可改变底物的带电状态，从而影响底物分子与酶的结合。
各种酶的特异性表明，酶的活动中心只能结合带某种电荷的离子，包括正电、负电或两性电荷。
酶分子具有两性电解质的性质，同时pH 值也改变了酶分子的带电状态，特别是改变了酶活力中心上有关基团的电离状态。
当在某一pH时，酶分子的活动中心，既存在一个带正电的基团，又存在一个带负电的基团，这时，酶与底物结合最容易；当pH偏高或偏低时，其活动中心只带有一种电荷，就会使酶与底物的结合能力降低。
例如，蔗糖酶当处于等电点时，才具有酶活性，而在等电点的偏酸或偏碱的一侧，酶活性则降低甚至完全丧失。
(三) 酶的浓度和底物浓度
酶与底物浓度的关系，一般来说，当酶的浓度较小，底物浓度大大高于酶，则酶的浓度与反应速度成正比；当底物浓度一定时，酶的浓度继续增加到一定值以后，其反应速度并不加快。