花生FAD2_RNAi载体基因AFLP标记的克隆及序列分析

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分子标记——AFLP原理和操作步骤

分子标记——AFLP原理和操作步骤一、原理AFLP也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。

但AFLP是通过P CR反应先把酶切片段扩增，然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。

实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接，连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点。

实验中，根据需要通过选择在末端上分别填加了1～3个选择性核苷的不同引物，可以达到选择性扩增的目的。

这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段，进行结合，导致特异性扩增。

二、实验试剂Taq酶、EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI接头、E+A引物M+C引物、T4DNALigaseE和M引物、琼脂、过硫酸胺、丙烯酰胺、尿素、硝酸银、甲酰胺、dNTPs、二甲苯青、冰醋酸、玻璃硅烷、50bpMark三、操作步骤（一）基因组DNA提取和纯化A、参考实验一的大量提取DNA实验方法，B、DNA的纯化：用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小，取出其中的1/3已提取的基因组D NA进行纯化，首先用TE缓冲液补满至总体积50ul，再等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（2 4∶1）各抽提一次，离心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10体积的NaAC和二倍体积预冷的无水乙醇，－20℃放置2h以上，10000g离心10min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次，风干后溶于30μlTE缓冲液中，U V-2401PC（岛津）紫外分光光度计检测A260、A280值并定量，再用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小。

注：0.1-0.2g组织可用100ul溶液E溶，0.5g组织，溶液E可增加至300ul，此时DNA浓度大约为100ng/ul。

（二）限制性酶切及连接在0.2ml离心管中加入：模板量约为250ng，2.5μl 10×酶切缓冲液， 2.5μl 10×T4DNA连接酶切缓冲液，5U EcoRⅠ，5U MseⅠ，2U T4连接酶，50pmol MseⅠ接头（序列见表2），双蒸水补至25μl。

FAD2和γ-TMT基因双价种子特异表达载体的构建及对花生的转化

ＢｎｅｕｎｅＡＦ０２０２ｒｍｏｅｓｉｏａｅｏｒｓｉａｎｐｓＤＮａｃｒｉｇｔ０７８ｓｑｅｃ，ａｋｓｑｅｃ１４２．ＳｐｏｔｒｗａｓｌｔｄｆｍＢａｓａｕＡｃｏｄｎｏＪ２９ｅｕｎｅｒｃ
到一基因，聊根据已发表的油菜（ｒｓｃａｕ）Ｂａｓａｎｐｓ种子贮藏蛋白基因特异表达的２ｉｓ启动子（登录号Ｊ２９）０７８序列，
从油菜ＤＡ中分离得到２启动子。为了同时提高花生中维生素Ｅ和油酸含量，Ｎｓ构建得到了双价种子特异表达载
ＳＩｉｇｏＨＮＨａＨＮＸａｇ— ｕＺＵＮｉｊｎＨｎ— ｕ，ＣＥｕ，ＣＥｉＸｎｙ，ＨＡＧＷｅ — ｉａ
（ｕａｅａｌｎＭｏｅｕｒａｄＣｌＢｏｏｙＦｚｏ５０２ｈｎ）ＦｊｎＫｙＬｂｏＰａｔｌｌｎｅｉｇ，ｕｈｕ３００，Ｃｉａｉｆｃａｌｌ
石新国，陈华，陈湘瑜，庄伟建
（福建省作物分子与细胞生物学重点实验室，福建福州３００）５０２
摘要：根据已发表的一
基因序列（ｅＢｎＦ０２０，ＧｎａｋＡ１４２）从拟南芥（ｒｂｏｓａｉｎ）ｃＮＡａｉｐｉｔｌａ的ＤＡ中分离得ｄｓｈａ
ＦＤ．ＩｗｓｕｅｃｅｓｏｈｔｏｈｒｌｎｌｉａｉｃｎｅｔｎｐａｕｔｏｇｇｏａｔｉｍｔｆｃｎＡ２ｔａｓｄｔｉｒａｅｂｔｏｐｅｏａｄｏｃｃｄｏｔｎｅｎｔｈｕｈＡｒｂｃｒｍｅｉｓｏｎｃｅｉｒｅｕｕａｅ

AFLP标记技术及其在花生上的应用研究

AFLP标记技术及其在花生上的应用研究
郭静佩;王晓林;周鹏;周延清
【期刊名称】《河南农业科学》
【年(卷),期】2011(040)002
【摘要】AFLP是检测DNA多态性的一种分子标记技术.综述了该技术原理、方法、特点及其在花生遗传多样性、抗性相关分子标记、根瘤菌、指纹图谱等方面应用的研究进展.
【总页数】4页(P12-15)
【作者】郭静佩;王晓林;周鹏;周延清
【作者单位】河南师范大学,生命科学学院,河南,新乡,453007;驻马店农业科学研究所,河南,驻马店,463000;河南师范大学,生命科学学院,河南,新乡,453007;河南师范
大学,生命科学学院,河南,新乡,453007
【正文语种】中文
【中图分类】S565.2
【相关文献】
1.DNA分子标记技术在花生品种鉴定上的应用研究 [J], 王传堂;杨新道;于翔;张建成;刘光臻;徐建芝
2.DNA分子标记技术在花生品种鉴定上的应用研究 [J], 王传堂;杨新道;于翔;张建成;刘光臻;徐建芝
3.分子标记技术在花生上的应用研究 [J], 李洁;马金娜;谷献锋;荆建国
4.AFLP技术在花生品种鉴定上的应用研究 [J], 张建成;王传堂;江玉萍;李群;李汝玉
5.DNA分子标记技术在花生上的应用研究 [J], 王传堂
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CRISPR/Cas9编辑花生FAD2基因研究

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2021, 47(8): 1481-1490 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail: zwxb301@本研究由国家自然科学基金项目(31671766)和深圳市科创委基础研究项目(JCYJ20190808143207457, JCYJ20180305124101630, JCYJ20170818094958663)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31761766) and the Shenzhen Commission of Science and Technology Innovation Projects (JCYJ20190808143207457, JCYJ20180305124101630, JCYJ20170818094958663).*通信作者(Corresponding author): 于为常, E-mail: wyu@第一作者联系方式: E-mail: zahngwang@Received (收稿日期): 2020-09-19; Accepted (接受日期): 2021-01-13; Published online (网络出版日期): 2021-02-25. URL: https:///kcms/detail/11.1809.S.20210225.1139.002.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2021.04214CRISPR/Cas9编辑花生FAD2基因研究张旺冼俊霖孙超王春明石丽于为常*深圳大学生命与海洋学院 / 广东省植物表观遗传学重点实验室, 广东深圳 518071摘要: 油酸脱氢酶(∆12FAD 或FAD2)是催化油酸(OA)的C12位上脱氢生成双不饱和亚油酸(LA)的关键酶, 它控制油酸、亚油酸的含量及其比值(O/L)。

等位基因特异PCR法鉴定花生FAD2B新突变

[11]
。完成后, 电泳检测
引物0.
2
5μL、无菌双蒸水8.
7
5μL。 PCR 程序:9
4℃
1 mi
n,9
4℃ 3
0s,5
3℃ 3
0s,7
2℃ 3
0s,3
0 个循环;
7
2℃ 5 mi
n。在东胜龙 EDC
8
1
0型 PCR 仪上完成。
2 结果与分析
2.
1 FAD2B 基因编码序列比较
用引物对 b
花生高油酸育种具有重要意义。本研究对普通油酸的野生型花生 15L46 和本团队创制的高油酸
突变型花生 15L46HOFAD2B 基因进行克隆测序和序列比对,证实 FAD2B 基因存在 G558A 突变。
在此基础上设计两套 AS
-PCR(等位基因特异性 PCR)引物检测该突变位点,效果良好。该方法操作
肪、蛋白质、糖类、矿物质及多种维生素等,对促进
发现,FAD2A 和 FAD2B 即 o
l1 和 o
l2 两对隐性
2
2[1]
1752 万t,单产 3781kg/hm 。花生籽仁富含脂
人体新陈代谢和改善记忆力等都有所裨益,是一种
集益智、抗衰、延寿等功效于一体的农产品[2] 。
油酸和亚油酸是花生两种主要脂肪酸,两者之
ypeFAD2 mu
gh
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花生Clp蛋白酶基因(AhClpP)的克隆与序列分析

２００）５１０
摘要：ｌＣｐ蛋白酶通过蛋白质水解作用来清除细胞内由逆境引起的异常和具有潜在毒性的蛋白或多肽，而保证从细胞正常的生理功能。从优质大花生鲁花ｌ子不同发育时期混合ｅＮ４种ＤＡ文库中发现一条序列，长为１２２ｂ，全１ｐ３
ＩｒｖｍｅｔａｄＢｏｅｈｏｏｙＨｕｎｈａｈｉＭｉｉｒｆＡｒｕｔｒ，ｉａ２００Ｃｉａｍｐｏｅｎｎｉｔｃｎｌｇ，ａｇｕｉａ，ｎｓｏｇｉｌｅＪｎｎ５１０，ｈｎ）ｔｙｃｕ
ＡｂｓｒｔＣｌｒｔａｅｃｎｒｌｒｉａｙｍｅａｏｉｒｃｓｅｙｒｍｏｉｇａｎｒａｎｏｉｒｔｉｓｏｅｔｄｓｔａｃ：ｐｐｏｅｓｏｔｏｓｏｄｎｒｔｂｌｃｐｏｅｓｓｂｅｖｎｂｏｍｌａｄｔｘｃｐｏｅｎｒｐｐｉｅ
clp蛋白酶参与错误折叠蛋白降解短命蛋白调控和错误功能蛋白移除调节代谢途径中限速酶的水平来控制代谢过程的进行从而保证细胞正常生理功能在生物蛋白质代谢调控中发挥重要作用在逆境条件刺激下细胞会产生一些不可逆损伤的蛋白或多肽而这种不可逆损伤的蛋白会对细胞产生某种毒害作用或者干扰正常代谢过程的进行在这种情况下会有许多clp蛋白酶产生通过蛋白质水解作用清除非正常和具有潜花生是我国重要的油料和经济作物之一种植面积约502花生在其生长过程中经常会遭受到不同程度的生物和非生物逆境胁迫这些胁迫严重影响植物的生长发育并对农业生产造成极大的负面影响研究发现在长期的生物进化过程中植物自身已经发展了多种抵抗胁迫的机制以通过调节自身生理和代谢变化来抵御逆境

花生FAD2-RNAi载体基因AFLP标记的克隆及序列分析

．
ＷｅｏａｎｅｗｅｖＡＦＬＰｍａｋ— ｂｔｉｄｔｎｔｒ
．
１＿ａｔｃｄｄｅａｕａｅＲＮＡｉｖｃｏｒＦｉ２ｆｔｙａｉｓｔｒｓ－ｅｔｖｅ
ｓｑｕｎｃｓａｅｏｂａｎｄａｔｒｒｃｖｒｓｇｅｃｌｎｅａｅｓｒｎｄｗｅｅｃｍｐａｅｌｓｎｉｈｅｅｅｒｔｉｅｆｅｅｏｅ，ｉｏｎｉ，ｃｏｎｄｍａｕｅａｒｏｒｄｂｙｂａｔｎｔｅ
中图分类号：５５２２４￥６．０．文献标识码：Ａ
ＭｏｅｕａｏｉｇａｄＳｑｅｃａｙｉｏｌｃｌｒＣｌｎｎｎｅｕｎｅＡｎｌｓｓｆ△ １＿ａｔｉ２ｆｔｙＡｃｄ
‘
ＤｅａｕａｅＲＮＡｉＶｅｔｒＢａｅｓｔｒｓ－ｃｏｓｄＡＦＬＰｎＰｅｎｕｉａｔ
ＧｅＢｎｎａｋ．Ｔｈｎｌｔｅｕｔｓｏｅｈｉｅｓｑｅｃｒａｅｅｅｗｅｎ３．７ｍｎ．９ｍｔｅａａｙｉｒｓｌｈｗｄｔｅｆｅｕｎｅｗｅｅｌｂｌｄｂｔｅ８ｃａｄ６５ｃｃｖｈｅ
花生ＦＡＤ２ＲＮＡｉ体基因ＡＦＰ一载Ｌ标记的克隆及序列分析
张宁洁，国庆熊发前高，
（．西大学，西南宁５００；．西农业科学院生物实验室，西南宁５００１广广３０３２广广３０３）

玉米FAD2基因的克隆及序列分析

玉米FAD2基因的克隆及序列分析
玉米FAD2基因的克隆及序列分析
高等植物中的△12脂肪酸脱饱和酶是将油酸转化为亚油酸的酶.根据已发表的其他高等植物的FAD2基因的保守序列设计同源引物,通过RT-PCR从玉米幼胚中扩增得到一个特异的cDNA基因片段.通过生物信息学分析,从玉米幼胚cDNA和基因组中均扩增得到1 164 bp FAD2基因(GenBank登陆号:DQ496227),它编码387个氨基酸,含有完整的ORF框,在ORF框内无内含子.序列联配与树状分析结果表明,FAD2推导的氨基酸序列与其他物种的△12脱饱和酶基因具有同源性.它含有3个组氨酸保守域和2段很长的疏水区,是一个跨膜4次的膜结合蛋白.半定量RT-PCR分析显示FAD2基因在玉米幼胚中表达量最高,在叶、茎、根中亦有低水平表达.
作者：陶芳朱苏文范军程备久 TAO Fang ZHU Su-Wen FAN Jun CHENG Bei-Jiu 作者单位：安徽农业大学生命科学院生物物理实验室,合肥,230036 刊名：植物生理与分子生物学学报ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF PLANT PHYSIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 年，卷(期)：2006 32(6) 分类号：Q94 关键词：玉米 FAD2基因半定量RT-PCR maize FAD2 gene semi-quantitative RT-PCR。

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文章编号:100224093(2008)0120007207花生FA D22RNAi载体基因A FL P标记的克隆及序列分析3张宁洁1,2,高国庆2,熊发前2(1.广西大学,广西南宁530003;2.广西农业科学院生物实验室,广西南宁530003)摘要:以花生高油酸品种Sunolic95R和低油酸品种汕油162杂交组合的F1为试验材料,采用AFL P分子标记,用100对AFL P引物筛选出20个与△122脂肪酸脱氢酶2RNAi载体基因遗传连锁距离为3.87～8.91cm的差异片段,并回收纯化、克隆测序及NCBI上进行序列比对,最终获得了5个FA D22RNAi载体基因的全序列(长度为589～763bp),通过分析得出:所获得的5个FA D22RNAi载体基因的遗传连锁距离为3.87～6.59cm,序列间同源性达到88%～97%,与G enBank中已知的FA D22RNAi载体基因序列相似性均达到85%以上,分别包含一个起始密码子与一个终止密码子,结果表明本试验采用AFL P技术获得的5个序列均为△122脂肪酸脱氢酶2RNAi载体基因。

关键词:花生;油酸;FA D22RNAi载体;序列分析中图分类号:S565.202.4文献标识码:AM o l e c ul a r Cl o n i n g a n d Se q ue n c e A n a l y s i s o f△122f a t t y A c i dD e sa t ur a s e2R N A i Ve c t o r Ba s e d A F L P i n P e a n utZ H A N G Ning2jie1.2,GA O Guo2qing2,XION G Fa2qian2(1.T he U ni versi t y of Guan g x i,N anni n g530003,Chi na;2.T he B i ol o g y L aborator yof Gu an g x i A ca dem y of A g ricul t u ral S cience,N anni n g530003,Chi na)Abstract:The F1of high oleic acid Sunolic95R and lo w oleic acid San162was used as experi metal material.Nearly o ne hundred of p ri mer s are boltinged wit h A FL P.We o btained t went y A FL P mar k2 ers which have labeled bet ween3.87cm and8.91cm wit h△122fat t y acid desat urase2RN Ai vecto r.Five sequences are o btained after reco ver,iso genic,clo ne and measure and were co mpared by blast n in t he GenBank.The analytic result sho wed t he five sequence were labeled bet ween3.87cm and6.59cm.t he identit y a mo ng t hem was88%～97%and abo ve87%wit h cited sequences.These analyses revealed t he o btained sequence were△122fat t y acid desat urase2RN Ai vector.K ey words:peanut;oleic acid;FA D22RN Ai vector;sequence analysis 花生脂肪酸中的油酸具有重要医疗保健功能,它能降低有害胆固醇、减缓动脉粥样硬化、预防冠心病等心血管疾病的发生等,而亚油酸为多不饱和脂肪酸,虽能降低有害胆固醇但也能降低有益胆固醇的含量,因此油酸与亚油酸比值的高低成为判断花生油品质是否优良的一个主要标准,而控制花生高油酸性状的逻辑候选基因已确定为FA D2(存在植物内质网和叶绿体中)[1,2],它　花生学报　2008,37(1):7～13　J ou rnal of Peanut S cience,Vol.37,No.1,20083收稿日期:2008201206基金项目:广西自然科学基金项目(桂科自0342003)作者简介:张宁洁(19762),女,贵州黔西人,广西大学作物遗传育种专业在读硕士,主要从事花生脂肪酸的分子研究。

编码产生多聚不饱和脂肪酸的关键酶-油酸脱氢酶(EC1.3.1.35,12酰基222油酰基2s n2甘油232磷酸胆碱脱氢酶),是亚油酸合成的关键酶,能催化油酸(18:1)脱去第12碳位上的氢形成亚油酸(18∶2)[3～5],因此,阻止或减缓该酶基因的表达可控制后续的脱饱和过程,减少亚油酸的形成。

花生△122脂肪酸去饱和酶基因的RNA i载体可抑制对该酶基因的表达,在花生中转录,形成发夹RNA(hp RNA),发夹臂形成的双链RNA (ds RNA)诱导花生的内源同源RNA的降解,从而调控花生脂肪酸代谢途径[6～8],降低花生种子亚油酸含量,提高油酸含量及油酸/亚油酸比值。

目前以分子标记为基础进行目的基因的克隆及序列分析的相关报道甚少,本文采用步骤较为繁锁的AFLP技术,经过克隆、测序、序列比对筛选到花生中5个与F A D2紧密连锁的△122脂肪酸去饱和酶基因的RNA i载体基因,得到全长c DNA 序列并进行核苷酸序列分析,以期为将复杂的AFLP标记转化成稳定简单的SCAR标记和高油酸花生育种提供基础。

1　材料与方法1.1　试验材料花生品种为Sunolic95R(美国品种,高油酸)和汕油162(广西地方品种,低油酸)杂交F1后代的高低油酸个体,取自广西农科院试验田。

ECORⅠ、MseⅠ酶切酶、T4DNA连接酶、A FL P 随机引物、dN TP、Taq DNA聚合酶、λHindⅢDNA Marker、PMD182T载体均购自大连Ta Ka2 Ra公司,Silver Beads DNA胶回收试剂盒购自上海Sango n公司,CBS2Scientific Company,Inc.的DASG2500233型电泳槽及配套的电泳仪。

1.2　试验方法1.2.1　花生叶片总DNA的提取及纯化提取:采用改良CTAB法,取1.5g叶片于液氮中研磨成粉,加入3.8mL预热的C TAB提取液(2% CTAB,100mol/L Tris-HCl,20mol/L ED TA, 1.4M NaCl,2%PV P)和15μLβ-巯基乙醇,65℃水浴2h,晃摇3次;加4.0mL氯仿/异戊醇(24∶1),40℃、12000×g离心10mim,取上清液,加入1/10体积的10%C TAB,65℃水浴10min,重复抽提2～3次;上清液中加入0.7倍体积的预冷异丙醇,-20℃放置30min,移液枪轻挑絮状物,75%酒精洗涤两次。

纯化:1mL含RNAa的TE溶解DNA,37℃水浴1h;加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1),混匀,40℃、12000×g离心10mim;取上清液,加1/10体积的3mol/L NaAC和2倍体积的预冷无水乙醇混匀,-20℃放置30min;弃上清液, 75%的酒精洗沉淀,倒立放置5～8h,充分干燥, 200μL TE缓冲液溶解DNA,-20℃保存备用。

1.2.2　A FL P操作流程 (1)双酶切。

反应体系:8.0μL基因组DNA(25ng/μL),2.0μL10×buffer(r+/T ango T M),1.0μL EcoRⅠ(10U/μL), 0.5μL MseⅠ(10U/μL),加dd H2O至20μL。

4500×g稍离心混匀,在37℃水浴保温8h,转至65℃保温5h。

80℃保温20min终止酶切反应。

(2)连接。

接头连接反应体系:10.0μL酶切DNA产物,2.0μL10×buffer T4DNA ligase(含ATP), 1.0μL ECORⅠadaptor pairs(5p mol/μL), 1.0μL MseⅠadaptor pairs(50p mol/μL), 0.5μL T4DNA ligase(5U/μL),加dd H2O至20μL。

4500×g稍离心混匀,16℃保温8～16h, 65℃10min终止连接反应。

(3)预扩增。

4.0μL 稀释连结产物DNA,2.0μL10×Taq buffer, 2.0μL dN TP(2.5mol/L),3.0μL Eco RIPrimer (10ng/μL),2.0μL MseIPrimer(10ng/μL), 0.2μL Taq polymerase(5U/μL),加dd H2O至20μL。

94℃预变性5min,94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环,72℃再延伸5min,4℃保存。

(4)选择性扩增。

选择性扩增除模板换成稀释预扩增产物,引物换成A FL P 通用引物外,其余反应物同预扩增反应体系, 94℃5min,94℃30s,65℃30s,72℃60s,35个循环(前12个循环每循环降0.7℃,最后退火温度保持56.6℃),72℃再延伸5min,4℃保存。

(5)聚丙烯酰胺变性胶的制作。

洗玻璃板-玻璃板的硅化-装玻璃板-配胶:(6%工作胶溶液配制如下:水17.0mL,尿素22.5g,40%丙烯酰胺7.5mL)—灌胶—预电泳—扩增产物的变性及上样—电泳—银染(脱色,水洗,染色,显影,终止)—干燥及保存[9]。

1.2.3　克隆测序在聚丙烯酰胺变性胶上割取高低油酸个体有差异的片段,TE溶解24h,煮8 花　生　学　报 37卷　沸10m i n ,离心取上清进行PCR 扩增,利用DNA 快速纯化回收试剂盒回收PCR 产物,与克隆载体P MD18-T 连接。

按Sa mbr ook [6]的方法制备E.coil DH10B 感受态细胞并进行转化,取100μL 转化产物涂布于含10μL 的I P T G 和40μL 的X -gal 的LB 平板上,37℃倒置培养12～16h 。

挑选培养基上的白色菌落,接种于含Amp 的LB 液体培养基上于37℃摇床上培养12h ,穿刺培养15h 送于上海鼎安生物技术有限公司进行测序。