福氏佐剂作用
佐剂
一、概念佐剂（adjuvant）是指能够增强免疫应答或改变免疫应答类型的物质，应用时可与抗原同时或预先注射于机体。
佐剂本身可以有免疫原性，也可以没有免疫原性。
应用佐剂的目的是为了提高抗原对机体的免疫原性，从而提高抗体的效价。
颗粒性抗原（如细菌、细胞）因具有较强的免疫原性，一般情况下不使用佐剂即可取得较好的免疫效果。
对于可溶性大分子量的蛋白质免疫原、人工抗原，初次免疫时必须使用佐剂才能取得较好的免疫效果。
另外，一般不连续两次使用完全弗氏佐剂，以免导致动物严重反应。
免疫佐剂的作用归纳起来有：1、延缓抗原的释放，保护抗原不被水解，佐剂可延长抗原在体内滞留时间，避免频繁注射，有利于高亲和力抗体的产生；2、活化巨噬细胞并促进巨噬细胞与T和B细胞的相互作用，从而对淋巴细胞有特异性加强刺激的作用；3、佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；4、佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；5、可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。
故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原；6、可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴度；7、改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。
由于佐剂常混有微量的其他物质，这些物质进入机体后也可引起抗体的产生，影响抗体的特异性。
注射完全佐剂可引起局部炎症反应，使局部组织坏死二、佐剂的制备条件佐剂的条件作为一种良好的佐剂，必须具备下列条件1、增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性；2、佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，减低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体；3、佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能；4、良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。
三、常用佐剂的种类和制备佐剂主要可分为两种：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。
完全和不完全福氏佐剂的作用
完全和不完全福氏佐剂的作用以抗原免疫动物获得抗血清是制备抗体的经典方法。
为了提高免疫效果，在免疫的时候，常辅以佐剂以改变抗原的物理状态而延长其在体内的滞留时间，使抗原缓慢释放，同时非特异性的促进局部吞噬细胞反应来增强动物的免疫效果。
佐剂的类型较多，目前常用的还是福氏佐剂(Freund’s Adjuvant，FA)。
它是一种对大多数抗原都有效的佐剂，但由于它的一些副作用限制了它在实验动物上的使用。
因此，福氏佐剂只能在确实需要的情况下(如使用的抗原为小分子可溶性抗原或半抗原)和强佐剂活性时使用。
FA是用矿物油(石蜡油)、乳化剂(羊毛脂)和灭活的分枝杆菌(结核分枝杆菌或卡介苗)组成的油包水乳化佐剂。
这三种成分俱全的佐剂称为福氏完全佐剂(Freund’s ComD】ele Adjuvant，FCA)，不含分枝杆菌的佐剂为福氏不完全佐剂(Freund’s InconrpleteAdjuvant，FIA)。
石蜡油因不能代谢而存留在注射的部位，这就阻碍了抗原降解或快速反应，起到抗原储存作用，使抗原缓慢持续的释放，不断刺激机体的免疫系统而产生免疫反应。
乳化剂对于水溶性抗原与油稳定地乳化是必要的。
分枝杆菌具有很强的免疫刺激作用，可以非特异性的激活免疫系统。
FCA用于基础注射，而FIA用于辅助注射以避免分枝杆菌蛋白引起的过敏反应。
FA皮下注射或肌内注射可导致多种副作用，例如肉芽肿和无菌性脓肿的形成。
腹腔注射引起腹膜炎。
由于这些严重的副作用，FA不允许用于人或动物的疫苗接种免疫。
传统的免疫方案，包括使用福氏佐剂和某些免疫程序，已不再被一些国家的权威机构所接受。
据调查，在荷兰有64％的研究人员使用FCA，而且，用于多克隆抗体的生产方案差异很大。
因此，在1993年，荷兰发布了利用动物免疫技术制备多克隆抗体的生产指南。
主要规定了加强免疫注射的次数、免疫途径、注射量和佐剂的使用，并且支持使用替代佐剂来替换FCA。
由于FCA给实验动物带来的严重的副反应，对它的使用提出了特别的限制，规定了(小鼠和大鼠sc：0．1nd；i．d：家兔0．o5 rI1l；i．P：小鼠0．2nd)推荐使用量和注射途径。
弗氏完全佐剂(complete
弗氏完全佐剂（complete freund’s adjuvant, CFA）弗氏不完全佐剂（incomplete freund’s adjuvant, IFA）佐剂的作用：1．形成抗原储存库。
2．形成局部肉芽肿。
3．刺激淋巴细胞增殖和分化。
二、抗体特异性体液免疫是由抗体介导的免疫。
是人和动物的B细胞在抗原刺激下转化成浆细胞，并由浆细胞产生的具有与抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白（Ig）。
存在于血液、淋巴液和组织液中。
（一）抗体的种类与结构抗体的种类多，血清中可有千百种不同的抗体，分为五种，已统一命名为IgG、IgM、IgA、IgD相IgE。
五种免疫球蛋白的分子结构基本相似（P257图9—9）说明。
(1)每个单体由两条长链又称重链(H链)及两条短链又称轻链(L链)构成。
各链之间以二硫键(S—S)相连接，两条L链位于两条H链所形成的Y形结构的两侧。
(2) 重链：每条H链分子量为55000，由420--460个氨基酸组成，重链共分四段，各段约含110个氨基酸。
靠近氨基(N—端)的第一段为重链可变区(V区)，简称VH，其余三段为恒定区(简称CH)，以CH1、CH2、CH3表示。
重链有γ、α、μ、δ、ε五种类型，每种抗体只能有一种类型的重链。
(3)轻链：分子量为22000，由2l3—216个氨基酸组成。
每条轻链分为两段：轻链可变区(简称v L)和轻链恒定区(简称C L)。
V L区有109个左右的氨基酸，CL区有l04个左右氨基酸。
轻链有两种类型，κ链和λ链。
一种抗体只能有同一种轻链。
(4)可变区：重链与轻链的可变区共同构成抗体结合价(即抗原结合簇部位)，与抗原呈特异性结合。
一个单体抗体分子具有两个结合抗原的部位，故为二价。
(5)用木瓜蛋白酶消化抗体，可得到三个片段：两个抗原结合片段，称为Fab，一个可结晶片段Fc；用胃蛋白酶消化，得到一个二价抗体活性部分，称F(ab’)2和两个剩余的小分子片段Fc’,不具任何生物活性。
动物疫苗中灭活剂与佐剂的种类及其作用
动物疫苗中灭活剂与佐剂的种类及其作用摘要介绍了动物疫苗中的灭活剂和佐剂的种类及其作用,以期为灭活剂和佐剂的推广应用提供参考。
关键词动物疫苗;灭活剂;佐剂;种类;作用动物疫苗种类包括弱毒苗和灭活疫苗,在灭活疫苗生产过程中,必然涉及灭活剂和佐剂,二者的安全性和效力也决定了疫苗的质量和推广应用效果。
1疫苗灭活剂灭活是指破坏病原体的生物学特性,但尽可能避免影响其免疫原性或破坏血清中补体活性的过程。
常用的灭活剂有甲醛、β-丙内酯(BPL)或其他有效灭活剂。
1.1甲醛甲醛是一种有强烈刺激性的致癌物质,其既可作用于病毒含氨基的核苷酸碱基(如A,G,U),又可作用于病毒壳蛋白。
作用于病毒壳蛋白时,易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集,不能再作用于壳蛋白内的核酸。
这样,病原体蛋白的抗原性会遭到严重破坏,并可能有病原体存活。
用甲醛灭活时间长,一般需要在37～39℃处理24h以上或更长时间,使用浓度一般为0.1%。
其灭活的效果易受温度、pH值、浓度、是否存在有机物、病原体的种类和含氮量等因素影响,残留的游离甲醛若随疫苗注入机体后,会产生制激性反应。
1.2β-丙内酯β-丙内酯(Beta-Propiolactone,BPL)在国外已广泛用于各种疫苗的灭活,是一种杂环类化合物,沸点155℃,常温下是无色粘稠状液体,对病毒具有很强的灭活作用。
能作用于病原体DNA或RNA,改变病毒核酸结构达到灭活目的,而不直接作用于蛋白,不破坏病原体的免疫原性。
大剂量β-丙内酯(BPL)虽是一种致癌物,但极易水解,在37℃水浴水解2h后消失,其水解为无毒性的人体脂肪代谢产物β-羟基丙酸。
另外,由于其能在疫苗液体中完全水解,不必考虑在成品疫苗中的残留,接种反应也轻微。
同时,β-丙内酯灭活病原时间短,从而显著地缩短了疫苗生产周期,提高了经济效益。
但与甲醛相比,价格明显昂贵,不适用于发展中国家或经济落后国家。
2免疫佐剂免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用、能增强机体针对抗原的免疫应答能力、或改变免疫反应类型的物质。
实验一、抗体的制备.
永州职业技术学院
杨晓斌
目的 1、掌握抗体制备方法 2、理解福氏佐剂的作用 内容 1、伤寒沙门菌O抗体的制备； 2、抗人全血清的制备。
一、伤寒沙门菌O抗体的制备
（一）、实验原理： 用抗原刺激机体可以使机体产生抗体，根据抗体 产生的一般规律，视抗原的性质选择不同的途径 免疫动物，经初次、再次免疫的过程，使得动物 血清中产生足量的特异性抗体，继而分离血清并 纯化免疫球蛋白，得到免疫血清或抗体。 抗体的制备是利用动物，有目的地生产某种抗体， 通过这种方法得到的抗体是多克隆抗体，可用于 体外的抗原抗体反应。
（2） 伤寒沙门菌O抗原免疫方案 用于免疫动物的菌液浓度视种的不同而异， 伤寒沙门菌、志贺痢疾菌等道杆菌，免疫浓 度多为109个/ml左右。细菌性抗原的免疫方 案大致相同，见下表：
免疫日期（天） 1免疫途径 Nhomakorabea点皮内抗原 伤寒沙门菌O抗原
免疫剂量（ml） 1.0
6
11 16 19
静脉
静脉 静脉 静脉
（二）、试剂与器材 1、 抗原与免疫对象 细菌菌种（伤寒沙门菌O901）、混合人全血清、 健康家兔。 2、 试剂 生理盐水、甘油、防腐剂等。 3、 设备与器材 剪刀、镊子、注射器、研钵、试管等器材和冰箱、 离心机等仪器。
实验动物的捉拿和固定方法
1．小鼠 性情比较温顺，一般不会主动咬人，但由于体形较 小且胆小怕惊，因此捉拿动作需要轻缓。捉拿时先用右手 将鼠尾抓住并提起，将其旋转数周后放在实验台面（最好 有一定粗糙度，以便于鼠爪用力）上，在小鼠向前爬行时 用力向后拉尾，此时用左手的拇指和食指捏住小鼠两耳和 头颈部皮肤，然后将鼠臵于左手心中，拉直后肢并用左手 无名指和小指压紧尾巴和后肢，右手即可作注射、灌胃等 实验操作。若进行解剖、手术、尾部采血或尾静脉注射时， 要将小鼠做一定形式固定。如作解剖、手术和心脏采血时， 一般将小鼠仰卧，用大头针或线绳将小鼠四肢固定在木板 上。作尾静脉注射或采血时，可将小鼠装入木制或有机玻 璃制作的小鼠固定盒内，亦可将小鼠直接 固 定在固定板 上
疫苗免疫佐剂
皂昔系： 从皂树Quillaja saponaria：树皮提取的三菇类混合物, Quilla A和spikoside为其部分纯化物, 为精制物。皂昔能诱 导对某些蛋白强和应答、中等应答, 可能是由于生成了蛋 白一皂昔混合小体的结果。 Quilla A已广泛用作兽用佐剂并提议用于人体, 它价廉、 安全、配制简单。 细胞因子一般为分子量约20KDa。
大肠杆菌不耐热毒素及其亚单位, 在动物实验中显示粘膜佐剂活性。它们可能是通过GM1神 经节苷脂受体靶向作用和刺激内源性腺昔酸环化酶活性而 起佐剂作用。
Vaccine adjuvant
微生物衍生物型佐剂： 微生物的核酸类,CpG 寡脱氧核苷酸(CpG2ODN)佐剂 , 非核酸类佐剂单磷脂A (MPL) 、OM2174、不耐热肠毒素 (LT)及其突变体等。
二、佐剂的类型：
油水乳剂：矿物油、乳化剂 微生物及代谢产物：脂多糖、分支杆菌、霍乱毒素等 细胞因子：白介素、干扰素等 脂质体：胆固醇类 蜂胶：蜂蜜 人工合成：胞壁酰二肽
vaccine adjuvant
1.具备免疫原性的佐剂：如卡介苗、枯草分枝杆菌、短小 棒状杆菌、百日咳杆菌、脂多糖、细胞因子等。
AS02 是一种含有单磷脂A (MPL)和皂角苷(QS221)的油包 水乳剂,能诱导强烈的抗体应答并伴有Th1 型和CTL 反 应。
Vaccine adjuvant
颗粒型佐剂： 将抗原输送系统与疫苗抗原复配或融合后形成颗粒状物质， 显微镜下呈颗粒状。铝盐氢氧化铝、磷酸铝等的不溶性胶 状沉淀, 颗粒大小100-1000nm, 免疫原通过静电与胶结合。 安全性佳, 靶向良好, 贮存作用中等, 诱导强Th2应答, 常见 强IgE应答, 但诱导CTL和CM1作用很弱。价廉, 易制备。
疫苗佐剂作用
疫苗佐剂作用
疫苗佐剂是一种可以增强疫苗免疫效果的物质，其作用主要包括以下几个方面：
1. 增强免疫反应：疫苗佐剂可以增强疫苗引起的免疫反应，提高疫苗诱导的抗体产生和T细胞应答，从而提高疫苗的有效性。
2. 提高抗原呈递：疫苗佐剂可以通过增强抗原呈递细胞的活性，促进抗原的呈递和交叉呈递，进一步增强免疫应答。
3. 调节免疫应答：疫苗佐剂可以调节免疫应答的类型和强度，促进Th1型和Th2型免疫应答的平衡，增强疫苗的交叉保护能力。
4. 减少疫苗用量：疫苗佐剂可以减少疫苗的用量，从而降低疫苗的成本和不良反应的风险。
5. 改善免疫记忆：疫苗佐剂可以促进免疫记忆的形成，提高疫苗的长期保护效果。
总之，疫苗佐剂在疫苗设计和制备中具有重要作用，可以提高疫苗的有效性和安全性，同时降低疫苗的成本和不良反应的风险。
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弗氏佐剂
弗氏佐剂(Freundadjuvant),这是目前最常用于动物实验的佐剂，它是将抗原水溶液与油剂(石蜡油或植物油)等量混合，再加乳化剂(羊毛脂或叶吐温80)制成油包水抗原乳剂，称之为不完全弗氏佐剂。
如在不完全佐剂中加入分枝杆菌(如死卡苗)则称为完全弗氏佐剂。
二、制备方法：弗氏佐剂是现在动物实验中最常用的佐剂，分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。
不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1～5：1，可根据需要而定，通常为2：1。
不完全佐剂中加卡介苗(最终浓度为2～20mg/ml)或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂(FCA)。
一般首次注射时用1／2体积FCA加上1／2体积的抗原进行乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。
如不加佐剂，则抗原量增大10-20倍。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
在免疫动物前，先将弗氏佐剂与抗原按一定比例混合，佐剂和抗原体积比一般为1：1，制备成"油包水"乳状液。
因为含SDS很易促使其乳化成油包水抗原乳化复合物，注射入动物体内时一定要保持乳化状态。
抗原用量视抗原分子量不同及免疫原性及免疫动物不同而有一定差异，无统一标准和固定模式。
一般是每兔(约2kg重)或每羊(约20kg重)第1次注射抗原1mg，以后逐次增加抗原量，最多每次不超过3mg。
佐剂与抗原乳化可按如下方法进行：(1)研磨法：先将佐剂加热并取适量放入无菌的玻璃研钵内，待冷却后再缓缓滴入等体积的抗原溶液，边滴边按同一方向研磨，滴加抗原的速度要慢。
待抗原全部加入后，继续研磨一段时间，使之成为乳白色粘稠的油包水乳剂。
本法适于制备大量的佐剂抗原，缺点是研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大。
(2)注射器混合法：将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。
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完全和不完全福氏佐剂
以抗原免疫动物获得抗体血清是制备抗体的经典方法。
为了提高免疫效果，在免疫应答的时候，常辅以佐剂以改变抗原的物理状态而延长其在体内的滞留时间，以使抗原缓慢释放，同时非特异性地促进局部吞噬细胞反应来增强动物的免疫效果。
佐剂的类型较多，目前常用的还是福氏佐剂（FA）。
FA是一种大多数抗原都有效的佐剂，FA是矿物油（石蜡油）、乳化剂（羊毛脂）和灭活的分支杆菌（结核分支杆菌或者卡介苗）组成的油包水乳化佐剂。
这三种成分俱全的佐剂称为福氏完全佐剂（FCA），不含分支杆菌的佐剂为辅氏不完全佐剂（FIA）。
石蜡油因不能代谢而存留在注射部位，这样就阻碍了抗原的降解或快速反应，起到了抗原储存的作用，使抗原缓慢持续的释放，不断地刺激机体的免疫系统而产生免疫反应。