致突变试验
细胞屏障 化学物 接触 DNA损伤
无误修复
未修复 修复错误
正常细胞
DNA DNA完 基因 染色体 染色体 整性改变 交换重排 突变 结构异常 数目异常
遗传学终点
常见致突变试验反映的遗传学终点
试 验 DNA完整 性改变 DNA交换 或重排 基因 突变
染色体 结构 异常 染色体 数目 异常
微核
细菌回复突变 姐妹染色单体交换 细菌DNA修复
1* 2* 1*
1*
2*
1*
1* 表示主要反映的终点，2* 表示次要反映的终点
2. 试验配套
配套原则： 遗传学终点齐全 配套方案: ● 微核试验 （染色体结构异常和数目异常） ● 姐妹染色单体交换试验 （DNA交换或重排） ● 细菌回复突变试验 （基因突变） ● 细菌DNA修复试验（DNA完整性改变）
★ 试验方法的确立 ★ 实际案例分析 利用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验检测大气污 染物SO2的致突变性。
嗜多染红细胞及其微核实例
试验流程图
吸入洁净 空气
吸入SO2 染毒
断颈处死取股骨
取骨髓细胞制涂片
涂片固定染色
镜检：嗜多染红细胞，计数微核率
试验结果分析
12 10
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环境污染物致突变作用及其评价化学致 Nhomakorabea变物的检测
教学目的与要求
1. 如何进行致突变试验的选择？ 2. 怎样进行化学致突变物检测？
一、遗传学终点和试验配套
1. 遗传学终点 （Genetic end point）
试验观察到的现象所反映的事件。
突 变 发 传生 学过 终程 点中 的的 关事 系件 及 遗
小鼠骨髓细胞姐妹染色单体交换试验 试验设计与微核试验类似，不同点主要在于：
1. 小鼠染毒处理后要接触5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu);
2. 试验结果中，比较染毒前后染色单体交换位点发生的
比率来进行致突变性的评价。
● 主要知识点：
1. 遗传学终点及以此为基础的试验配套；
2. 致突变试验的原理。
● 知识点的应用：
二、重要的致突变试验
（一）微核试验
（二）姐妹染色单体交换试验
（三）细菌回复突变试验 （四）细菌DNA修复试验
（一） 微核试验 （Micronuclei test）
以染色体结构异常和数目异常为遗传学终点， 考察化学物对遗传物质的损伤效应。 ★ 试验原理
★
试验设计
微核试验原理图
小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验
在掌握试验原理的基础上设计试验进行 环境化学物致突变性的检测。
结果2 染毒组微核率与对照组无差别：用其他试验进一步验证。
（二） 姐妹染色单体交换试验
(Sister chromatid exchange test)
以DNA交换或重排为检测终点，考察化学物对遗传 物质的损伤效应。
★ ★
试验原理 试验设计
正常 细胞
污染物 作用后
5-溴脱氧尿嘧啶（Brdu）参入DNA互补链 造成的姐妹染色单体差示染色原理
结果1
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12 10 8 6 4 2 0
结果2
8 6 4 2 0 Ô é ¶ Õ × þ õ ¯ ò ¾ ¾ é ¶ Ñ » Á È ¶ ×
Ô é ¶ Õ ×
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结论
结果1 染毒组微核率高于对照组：SO2具有致突变性。
遗传毒性试验-动物中心
致突变试验：根据受试物的化学结构、理化性质及对遗传物质作用终点（基因突变和染色体畸变）的不同。
要求新药必须做下列三项试验。
（１）微生物回复突变试验菌株：组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（Ｓｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）四株（ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２），亦可采用大肠杆菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＷＰ２若干株（大肠杆菌试验）。
剂量：决定受试物最高剂量的标准是细菌毒性和溶解度。
一般最大剂量可达５ｍｇ／皿。
受试物至少应有五种不同剂量否则应说明选定剂量的理由。
代谢活化：应用诱导剂处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（Ｓ９）进行体外代谢活化试验，即在加Ｓ９混合物和不加Ｓ９混合物平行的条件下测试。
对照组：用溶媒作阴性对照，用已知突变原作阳性对照。
结果判定：受试物的回复突变菌落数的增加与剂量相关并有统计学意义，或至少某一测试点呈现可重复的并有统计学意义的阳性反应时记为阳性。
（２）哺乳动物培养细胞染色体畸变试验细胞：哺乳动物原代或传代培养细胞。
剂量：至少应用三种不同剂量，高剂量以５０％细胞生长抑制浓度为基准，否则应说明选定剂量的理由。
标本制作时间：药物与细胞接触后应有适当时间最好包括整个细胞周期，通常在药物处理后２４和４８小时制作染色体标本。
代谢活化：应用适当的代谢活化法。
对照组：用溶媒作阴性对照，已知突变原作阳性对照。
镜检：每种浓度至少观察１００个中期分裂相细胞的染色体结构的异常及多倍体的出现率。
结果判定：受试物诱发的染色体畸变的出现率较阴性对照有统计学意义的增加，并有剂量反应关系时记为阳性，同时标明异常细胞出现的频度和种类。
（３）体内试验一般选用微核试验，但作用于生殖系统的药物进行显性致死试验等。
ａ．啮齿类动物微核试验动物：一般用小鼠，每组１０只性成熟动物（雌雄各半）或至少６只性成熟雄性动物。
给药剂量及途径：至少采用三种剂量，最高剂量从１／２ＬＤ５０为基准，腹腔和／或口服一次给药，必要时可连续给药。
否则应说明选定剂量的理由。
毒理学评价试验的主要内容
毒理学评价试验的主要内容毒理学评价试验就像一场科学大考，它的任务就是评估各种化学物质对我们身体的影响。
听起来很严肃，但其实这其中的细节非常有趣，简直就像是侦探小说里的推理，慢慢揭开一个又一个谜团。
我们今天就来聊聊毒理学评价试验的几个主要内容，保准让你耳目一新。
1. 毒性测试的基础1.1 理论基础首先，毒理学评价试验的第一步，得了解毒性测试的基础知识。
简单来说，毒性就是指物质对生物体的危害程度。
就像人们常说的“是药三分毒”，药物虽好，但用错了就会变成毒药。
科学家们通过一系列实验，来探究不同物质的毒性，从而为后续的安全性评估奠定基础。
1.2 测试方法接下来，毒性测试的方法可多得很。
常见的有急性毒性试验、慢性毒性试验、致突变试验等。
急性毒性试验就像是“闪电战”，短时间内观察物质对生物的影响。
而慢性毒性试验则是“持久战”，要观察很长时间，看看物质是否会慢慢积累伤害。
致突变试验则是为了检查某些化学物质是否会导致基因突变，简直就是在为未来的人类健康“把关”。
2. 评估过程中的观察2.1 观察指标在测试的过程中，科学家们可得细心观察。
这可是个“细节决定成败”的过程哦！通常他们会记录动物的体重变化、行为反应、甚至是生理指标，就像医生给病人做体检一样。
这些数据就像一颗颗珍珠，串联起来才能揭示物质的真面目。
2.2 数据分析数据收集完后，接下来就得进行分析了。
这就像解开谜题，需要耐心和细致。
科学家们会用统计学的方法，看看这些数据背后有没有隐藏的规律。
毕竟，科学不是“瞎猫碰上死耗子”，而是要有理有据，才能让结果经得起考验。
3. 风险评估与管理3.1 风险评估一旦完成了毒性测试，接下来就是风险评估的阶段了。
这就像是站在悬崖边缘，得仔细打量一下前方的路。
科学家们需要结合毒性数据，评估在实际使用中，这种化学物质对人类和环境的潜在风险。
你要知道，这可不是小事，一不小心就可能影响到千千万万的人。
3.2 安全管理最后，经过严谨的评估，科研人员会提出相应的安全管理措施。
致突变作用实验方法
v 5. 标本制作时间: 分别在药物与细胞接触后 24和48小时收获细胞制作标本，代谢活化组在 24小时收获细胞制作标本。 v 6. 对照: 设空白对照、溶剂对照、阳性对照 和S9对照。 v 7. 镜检: 每种浓度至少观察100个中期分裂相 细胞的染色体结构，在油镜下分别记录结构畸 变及多倍体的出现率。
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七. SOS显色试验(SOS chromotest)
由法国巴斯德研究所 Quillardet 等于1982 年首先提出的一种遗传毒性检测方法, 通过直 接监测细胞 DNA 受损后的 SOS 修复反应来检 测化合物的生物遗传毒性。 DNA 分子在受到 外因引起大范围损伤、其复制又受到抑制的 情 况 下 ， 会 导 致 一 种 容 易 发 生 错 误 的 修 复。 所有这些在遗传毒物处理后大肠杆菌中出现 的一系列反应统称为SOS应答。
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v 早期死亡的胚胎逐步吸收，既看不到胎鼠外 观，也分不清胚胎和胎盘，仅在子宫内膜上 隆起如一小瘤，故有人称它为胎膜瘤；如已 完全被吸收，则可称为吸收点，即为最早的 早期死胎。 （3）晚期死亡胚胎：胚胎完整成形，并有明 显胎盘，但色泽灰暗，无光泽，无自然运动， 机械刺激后亦无运动反应。
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v 结果观察: 以给药组雄鼠为单位，交配后 1~8周分别统计下列指标。 （1）平均受孕数（％）＝受孕母鼠总数/同 笼母鼠总数×100％ （2）平均着床数＝总着床数（早死、迟死、 活胎数）/ 受孕母鼠总数 （3）平均活胎数＝活胎总数/受孕母鼠总数 （4）平均死胎数＝死胎总数/受孕母鼠总数
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v 结果判定
（1）受试物所诱发的染色体畸变数的增加与剂量相 关，CHL系统判定如下： 畸变率<5％ 阴性（－） 畸变率>5％ 可疑（±） 畸变率>10％ 阳性（＋） 畸变率>20％ 阳性（＋＋） 畸变率>50％ 阳性（＋＋＋） （2）某一测试点呈现可重复的并有统计学意义地增 加：符合上述一条即可判为阳性。
五章外源化学物质突变作用
1、复制前修复 光复活：
胸最腺常嘧见啶的形紫成外二线聚对体D。NA的损伤：相邻2个 修复：在长波紫外线或短波可见光诱导
下，光裂合酶可催化嘧啶二聚体进行单体 化。在人类未得到充分证明。 “适应性”反应
低剂量烷化剂可诱导一种专一蛋白质（酶） 的合成，这种酶称为烷基转移酶或烷基受 体蛋白。
可将结合到碱基上（鸟嘌呤）的烷基转移 到酶本身的半光氨酸-SH基上，恢复嘌呤本 身的结构。
类 型
转换(transition) 颠换(transvertion)
它包括转换和颠换两种情况： 原来的嘌呤被另一嘌呤置换或原来
的嘧啶被另一嘧啶置换，我们称之为转 换(transition）； 若原来的嘌呤被嘧啶置换或原来的嘧 啶被嘌呤置换，我们则称之为颠换 (transversion）。 无论是转换还是颠换都只涉及一对碱 基，其结果可造成一个三联体密码子的 改变, 可能出现同义密码、错义密码和 终止密码。由于错义密码所编码的氨基 酸不同，表达的蛋白质可能发生改变； 如果错义密码为终止密码，可使所编码 的蛋白质的肽链缩短。
总之，任何DNA损伤，只要修复 无误，突变就不会发生；如果修 复错误或未经修复，损伤就得以 固定(fixed)下来,于是发生突变。 因此诱发突变是一个受控制的过 程，失控才真正发生突变。一般 来说从DNA损伤到损伤固定需要 几次细胞分裂周期才能形成。
四、突变的不良后果
突
突变的不良后果
变
的发生在生殖细胞，无论其发生
在任何阶段，都存在对后代影响的可能性， 其影响后果可分为致死性和非致死性两种。 致死性影响可能是显性致死和隐性致死。显 性致死即突变配子与正常配子结合后，在着 床前或着床后的早期胚胎死亡。隐性致死要 纯合子或半合子才能出现死亡效应。 如果生殖细胞突变为非致死性，则可能 出现显性或隐性遗传病，包括先天性畸形。 在遗传性疾病频率与种类增多时，突变基因 及染色体损伤，将使基因库负荷增加。 基因库(gene pool)是指一种物种的群体中 生殖细胞内具有的、并能传给后代的基因总 和。 遗传负荷(genetic load)系一种物种群体中 每一个体携带的可遗传给后代的有害基因的 水平。
体内致突变试验——Pig-a基因突变试验概况和进展
Pig-a基因突变试验——研究与应用进展李岩，霍娇，张立实四川大学华西公共卫生学院，四川省食品安全监测与风险评估重点实验室327098360@遗传毒性评估是化学品和药品安全性评价的重要组成部分，现有致突变试验虽已很多，但仍不能完全满足毒理学安全性评价和风险评估的要求。
近几年来，一项新的体内致突变试验——Pig-a基因突变试验受到广泛关注，该试验的检测终点为基因突变，且能够利用流式细胞术对人体突变细胞频率实现高通量检测。
Pig-a基因位于人类X染色体，编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶复合物，参与糖基磷脂酰肌醇（GPI）连接蛋白的早期合成。
当Pig-a基因发生突变时，细胞不能正常合成GPI连接蛋白，致使造血干细胞最终分化的血细胞（包括红细胞等）表型缺失。
Hall等学者收集患者外周血，用荧光标记的单抗与细胞GPI连接蛋白反应，使用流式细胞术（FCM)）检测未被荧光标记的突变细胞，根据表型缺失细胞的比例来诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）。
鉴于对PNH中Pig-a基因的研究以及FCM对Pig-a基因表型缺失的成功检测，不少学者期望使用Pig-a基因作为体细胞突变实验的报告基因。
目前已建立两种方法测定Pig-a基因突变率：流式细胞术或有限稀释法。
流式细胞术方法利用梯度离心液等方式富集目标细胞，利用荧光标记的抗体与目标细胞孵育，标记目标细胞，以及至少标记一种GPI连接蛋白标志物。
之后利用散射光区分血小板、白细胞和红细胞，核酸染色还可用于区分正染红细胞和网织红细胞。
另一种检测方法为有限稀释法。
淋巴细胞能够将前气单胞菌溶素转变为气单胞菌溶素，气单胞菌溶素能够与正常细胞GPI连接蛋白结合，导致细胞膜完整性受损以致细胞死亡。
而Pig-a基因发生突变的细胞GPI连接蛋白缺失，因此得以存活。
该方法利用ProAER作为选择物质，使发生突变T淋巴细胞在96孔板内克隆性生长，而未突变的细胞死亡。
Pig-a基因突变试验能够利用少量样本相对迅速地得到较为精确的结果，并节省实验室工作量。
新药的非临床安全性评价
新药的非临床安全性评价新药的非临床安全性评价是指在临床试验前对新药进行一系列的实验和评估，以验证其在体内体外的药物代谢、药动学、毒理学以及药效学等方面的特性和安全性。
这些评价主要包括体外实验、动物试验和研究人自愿参与的初步试验等。
下面将详细介绍新药的非临床安全性评价的内容和意义。
一、体外实验体外实验是在人体外部进行的药物评价实验，其目的是评估药物的药理学和药代动力学特性，包括药物在体外的稳定性、溶解度、吸收性、代谢稳定性以及药物与细胞或蛋白结合的能力等。
同时，体外实验还可以评估药物的亲水性、脂溶性和分布系数，以及药物与受体结合的亲和力等指标。
通过体外实验的结果，可以初步判断药物的可行性和安全性，为后续的动物试验提供参考依据。
二、动物试验动物试验是对新药进行非临床安全性评价的重要环节。
常用的实验动物包括小鼠、大鼠、猴子等。
动物试验主要包括急性毒性试验、慢性毒性试验、生殖毒性试验、致突变性试验等。
1.急性毒性试验急性毒性试验主要用于评估药物的一次性剂量对动物的中毒程度。
通过给实验动物以高剂量的药物进行短期观察，以评估药物对生物系统的毒性程度。
常用的指标包括动物的致死剂量（LD50）和半致死剂量（LD50/2）等。
2.慢性毒性试验慢性毒性试验主要用于评估长期使用药物对动物体内器官和系统的慢性毒性作用。
通过给实验动物长期和连续地服用药物，观察其对动物的影响。
常用的观察指标包括动物的体重变化、血液生化指标、器官病理学变化等。
3.生殖毒性试验生殖毒性试验主要用于评估药物对动物繁殖功能和胚胎发育的影响。
通过给雌性动物和雄性动物进行交配和交配后的胚胎发育观察，以确定药物对动物生殖系统和胚胎发育的毒性作用。
4.致突变性试验致突变性试验主要用于评估药物对生物基因的损害作用。
通过给细菌或哺乳动物进行基因突变试验，评估药物是否对基因产生突变效应。
常用的试验包括细菌试验系统、哺乳动物试验系统和细胞培养试验系统等。
三、研究人自愿参与的初步试验研究人自愿参与的初步试验是在新药进入临床试验前的最后一步非临床安全性评价。
致突变作用及检测方法解析
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2、染色体畸变
指染色体的结构或数目的改变，是遗传物质 大的改变，一般可用光学显微镜检查。
染色单体型畸变：畸变涉及复制染色体中两条中的一条。 染色体型畸变：畸变涉及复制染色体中的两条。
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（1）染色体结构异常类型
•断裂：产生无着丝点片断
•缺失：染色体上丢失了一个片段 •倒位：一个染色体片段被颠倒了 臂间倒位：包括着丝点 臂内倒位：不包括着丝点
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五、常用致突变实验方法
1、观察项目的选择
2、常用的致突变实验
3、致突变实验中的一些问题
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一、观察项目的选择
1、观察效应终点的类型 •基因突变实验
•染色体畸变实验
•DNA损伤实验 遗传终点（genetic endpoint）： 试验观察到的现象所反映的各种事件。
宿主原因。
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一、DNA损伤的修复
1、光修复
2、“适应性”反应
3、切除修复
4、双链断裂修复
5、交联修复
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1、光修复
它通过酶切下DNA上嘧啶二聚体， 将毗连的嘧啶接回原结构上，依赖光裂 合酶，是一种依赖光的过程，主要针对 紫外线损伤产生的胸腺嘧啶二聚体的修 复机制。广泛存在于原核生物和真核生 物体内。
3、生物的染色体组成或细胞质发生变化而产生。
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突变(mutation)：遗传结构本身的变化及
其引起的变异称为突变。
突变是遗传物质的一种可遗传的变异。 自发突变 诱发突变
1、培育和选择新种或良种。 2、引起人类健康危害。
致突变作用及其试验方法与评价
③环状染色体（ring chromosome） 染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒 的节段的两断端连接形成一个环时，称为环 状染色体。
④倒位（inversion） 当某一染色体发生两次 断裂后，其中间节段倒 转180再重接，称为 倒
二、突变类型
遗传毒理学家主要关注两类遗传学损伤： 基因突变
染色体畸变
端粒
着丝粒
姊 妹 染 色 单 体
端粒
染色体畸变 染色体的结构及数目改变。
组 蛋 白
基因突变 一个或几个DNA碱基对的改变。
碱基对
双 螺 旋
这些损伤多因DNA受损所致，也可能因DNA
以外的靶组织受损所致。
基因突变、染色体畸变及染色体数目变化的本
无误 修复
染色体分 离异常
重组事件 SCE 有丝分裂性交换
染色体结 构异常
基因 突变
细胞 死亡
非整倍体 多倍体
常用的致突变试验
1、细菌回复突变试验 （Ames试验） 2、哺乳动物细胞基因突变 试验 3、果蝇伴性隐性致死试验 4、染色体畸变分析 7、显性致死试验 8、小鼠可遗传易位试验
9、细菌DNA修复试验
4、细胞周期、有丝分裂与减数分裂
细胞周期指细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂
终了所经历的过程。
G0 ：DNA合成前期； G1 ：DNA合成期；
S：完成DNA复制；
G2：为有丝分裂做准备；
M：有丝分裂期
有丝分裂过程
有丝分裂指细胞核分 裂的过程，一个细胞 由此生成两个子细胞，
ames实验名词解释
ames实验名词解释
Ames实验全称为艾姆斯氏试验（Ames Test），是一种检测化学物质的致突变效果的试验方法。
它是由美国加州大学伯克利分校的细菌学家布鲁斯·艾姆斯（Bruce Ames）于1971年所创立。
Ames实验的原理是将受试物或其可代谢产物与细菌培养基混合，观察细菌是否出现回复突变。
如果受试物具有致突变性，会导致细菌基因突变率增加，从而使得回复突变菌落数增加。
该实验主要用于检测化学物质的致突变效果，判断其是否具有潜在的致癌性。
与动物实验相比，Ames实验具有快速、经济、灵敏度高等优点，因此在毒理学和癌症研究中被广泛应用。
第五章特殊毒性作用及其试验与评价方法
肿瘤发生率，潜伏期，一般健康状况，自然寿命； 组织器官检查：肉眼、病理组织学检查（光镜及电镜） 统计分析：与对照组比较，分析显著性差异； 流行病学调查：
（二）致癌作用的其它试验
(1) 恶性转化试验
1. 原代细胞: 叙利亚仓鼠胚胎细胞(SHE Cell) 人成纤维细胞 小鼠或大鼠支气管上皮细胞
期试验。
（三）关于致癌性预测 1. 概述
传统的试验一般为长期试验,费时、费力、费钱 能不能用短期试验进行预测呢？ 鉴于化学物质致突变性与致癌性的高度关联性， 近年来多用致突变检测对致癌物进行初筛。 据此，Rosenkranz等提出了一个方法，简写为 CPBS法，即：Carcinogenicity predication and battery selection method（致癌性预测 与试验组合选择）。
(3) 试验方法 致突变试验分体内体外两种情况：
体外试验：检测间接致突变物，需加S9(体外 代谢活化系统 )，此法称微粒体间介法。
体内试验：可检测直接及间接致突变物， 不必加S9 此法称宿主间介法。
(4) 关于突变类型 分为:基因突变和染色体畸变 1. 基因突变(gene mutation) 或称
(translocation) (inversion)
(minute body) (fragment) (deletion) (break) (gap)
裂断 隙裂
② 染色体数目异常
整倍性畸变：单、三、四、多倍体
数目畸变
非整倍性畸变：2倍体多一条或少一条
或多多条或少多条 2n-1,2n-2,… 2n+1,2n+2,…
2. CPBS法原理
① 提出一种试验组合的选择,通过聚类分析, 选择试验方案。