致突变实验综合分析及评价
致突变试验综合分析及评价(毒理学教研室20150507)
第六部分： 19. 以上四种实验方法注意事项有哪些？ 20. 结合以上四个实验结果，对 96%二氯吡啶酸原药的致突变性进行综合评 价。 21. 如仅小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果为阳性，其余试验结果均为阴性 时，应进一步如何设计试验方案？
讨论方式：①各实验室分成六小组（各实验室组长安排分组） ，每小组同学针对 下述 6 个问题进行讨论，并负责制作其中一个部分的 PPT（独立完成，不重复） 。 ②课堂上从各实验室抽签确定相应组别进行相关内容的 PPT 汇报， 其他同学针对 汇报内容进行提问、 补充和讨论。③课后请学习委员收齐所有小组同学 PPT 交教 研室。 上课时间：5 月 12 日，下周三，4602 教室
表 3 96%二氯吡啶酸原药在 CHL 细胞染色体畸变分析结果 组别 阴性对照 溶剂对照 （DMSO） S9 对照 95%二氯吡 啶酸原药 S9 剂量 （µg/ml） 0 0 0 1250 2500 5000 + + + + + 观 察 细 染色体异 胞 数 常细胞数 （个） （个） 200 11 200 200 200 200 200 200 200 200 200 16 10 17 16 18 15 19 14 16 畸变类型 g 6 8 0 10 6 10 5 9 5 5 b 11 13 10 16 15 15 5 19 11 16 t 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 r 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 m 0 3 0 1 2 3 10 0 3 0 畸变细 其 胞 率 它 （%） 0 5.5 1 0 0 0 0 0 0 0 0 8 5 8.5 8 9 7.5 9.5 7 8
致突变试验综合分析及评价
某单位欲对农药—— 96% 二氯吡啶酸原药，进行致突变试验综合分析及评 价，见相关资料。 现请根据所学知识，查阅资料和文献，思考并讨论以下问题。
致突变作用实验方法
v 5. 标本制作时间: 分别在药物与细胞接触后 24和48小时收获细胞制作标本，代谢活化组在 24小时收获细胞制作标本。 v 6. 对照: 设空白对照、溶剂对照、阳性对照 和S9对照。 v 7. 镜检: 每种浓度至少观察100个中期分裂相 细胞的染色体结构，在油镜下分别记录结构畸 变及多倍体的出现率。
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七. SOS显色试验(SOS chromotest)
由法国巴斯德研究所 Quillardet 等于1982 年首先提出的一种遗传毒性检测方法, 通过直 接监测细胞 DNA 受损后的 SOS 修复反应来检 测化合物的生物遗传毒性。 DNA 分子在受到 外因引起大范围损伤、其复制又受到抑制的 情 况 下 ， 会 导 致 一 种 容 易 发 生 错 误 的 修 复。 所有这些在遗传毒物处理后大肠杆菌中出现 的一系列反应统称为SOS应答。
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v 早期死亡的胚胎逐步吸收，既看不到胎鼠外 观，也分不清胚胎和胎盘，仅在子宫内膜上 隆起如一小瘤，故有人称它为胎膜瘤；如已 完全被吸收，则可称为吸收点，即为最早的 早期死胎。 （3）晚期死亡胚胎：胚胎完整成形，并有明 显胎盘，但色泽灰暗，无光泽，无自然运动， 机械刺激后亦无运动反应。
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v 结果观察: 以给药组雄鼠为单位，交配后 1~8周分别统计下列指标。 （1）平均受孕数（％）＝受孕母鼠总数/同 笼母鼠总数×100％ （2）平均着床数＝总着床数（早死、迟死、 活胎数）/ 受孕母鼠总数 （3）平均活胎数＝活胎总数/受孕母鼠总数 （4）平均死胎数＝死胎总数/受孕母鼠总数
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v 结果判定
（1）受试物所诱发的染色体畸变数的增加与剂量相 关，CHL系统判定如下： 畸变率<5％ 阴性（－） 畸变率>5％ 可疑（±） 畸变率>10％ 阳性（＋） 畸变率>20％ 阳性（＋＋） 畸变率>50％ 阳性（＋＋＋） （2）某一测试点呈现可重复的并有统计学意义地增 加：符合上述一条即可判为阳性。
第六章致突变作用及其评价
第六章致突变作用及其评价一、物理致突变作用物理致突变作用包括辐射和高温等。
辐射致突变作用主要有电离辐射和非电离辐射两类。
电离辐射直接作用于DNA分子，产生切割和离子化，导致碱基的改变和突变；非电离辐射通过激发态分子产生自由基，再与DNA发生反应，引起碱基缺失、骨架断裂等突变。
高温致突变作用主要通过破坏DNA的双螺旋结构，导致碱基的改变和突变。
评价物理致突变作用的方法主要有突变频率、突变谱和克隆肥大度等。
突变频率是指单位时间和单位器官细胞中突变细胞的比例，可以通过突变频率实验来测定。
突变谱则是指突变细胞中各类突变的比例，可以通过分子生物学技术和测序方法来分析。
克隆肥大度是指突变细胞在培养基上形成的克隆的大小和数量，可以通过克隆形成试验来测定。
二、化学致突变作用化学致突变作用包括化学射击和化学诱变剂两类。
化学射击是指化学物质直接与DNA发生反应，引起碱基改变和突变。
化学诱变剂则是通过诱导DNA产生加合法或错配法复制，导致突变。
常见的化学诱变剂有碱基类似物、交联剂和DNA切割剂等。
评价化学致突变作用的方法主要有突变频率、突变谱和鉴定突变基因等。
突变频率的测定方法与物理致突变作用的评价方法相同。
突变谱的分析和鉴定突变基因的方法则需要借助生物学、分子生物学和遗传学等多种技术手段，如突变谱分析和基因克隆。
三、生物致突变作用生物致突变作用是指生物体内的内源性或外源性因素引起的突变。
内源性因素包括细胞自身的突变机制和DNA复制错误等，外源性因素则包括病毒、细菌和真菌等微生物的感染。
评价生物致突变作用的方法主要有突变频率、突变谱和鉴定突变基因等。
突变频率和突变谱的测定方法与物理致突变作用和化学致突变作用的评价方法相似。
鉴定突变基因的方法则需要借助生物学、分子生物学和遗传学等多种技术手段，如基因进行克隆和功能验证。
综上所述，对致突变作用的评价可以通过突变频率、突变谱和鉴定突变基因等多种方法来进行。
不同的致突变作用可能对生物体产生不同的影响，因此在评价致突变作用时需要综合考虑不同评价指标的结果。
药物致突变试验评价实验流程
药物致突变试验评价实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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基因组学研究中的突变检测与分析实验报告
基因组学研究中的突变检测与分析实验报告【引言】基因组学研究是一个重要的领域，通过研究DNA序列中的突变信息，我们可以了解到基因突变对人类健康以及疾病发生的影响。
本实验旨在讨论基因组学研究中突变检测与分析的方法和实验结果。
【实验方法】1. DNA样本提取：我们从10名志愿者手部采集细胞样本，并使用DNA提取试剂盒按照说明书提取DNA。
2. PCR扩增：通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因区域。
我们设计了一对引物来选择性扩增我们感兴趣的基因区域。
PCR条件设置为：初始变性(95℃，5分钟)，循环反应（95℃，30秒；56℃，30秒；72℃，30秒），最终延长（72℃，10分钟）。
3. 凝胶电泳：将PCR反应产物与DNA分子量标准物质一同加载到1%琼脂糖凝胶中进行电泳，以观察扩增产物的大小和纯度。
【结果与讨论】我们成功提取了10名志愿者的DNA样本，并进行了PCR扩增反应。
经凝胶电泳分析，我们发现所有样本均得到了预期大小约为500bp的PCR产物，说明PCR反应成功。
这也意味着我们成功地选择性扩增了我们感兴趣的基因区域。
在进一步的突变检测与分析中，我们采用了两种常见的方法：Sanger测序和Next Generation Sequencing（NGS）。
1. Sanger测序：我们从PCR产物中选择了5名志愿者的样本进行Sanger测序。
通过测序分析，我们检测到了一名志愿者的样本中存在一个已知的多态性突变，这与该志愿者的个人医疗史相符。
该突变是一种单核酸多态性（SNP），在基因座位的一对碱基上存在不同的碱基对。
我们对此突变进行了进一步的调查，并发现它与某种常见疾病的发生有关。
2. Next Generation Sequencing（NGS）：我们选取了另外5名志愿者的样本进行NGS分析。
NGS是一种高通量测序技术，可以快速检测大量的突变信息。
通过NGS分析，我们发现了每位志愿者不同的突变谱系，包括单核酸多态性（SNPs）、插入、缺失和结构变异等。
致突变试验评价实验流程
致突变试验评价实验流程一、实验准备阶段。
这就像是一场奇妙的冒险前的准备工作呢。
我们得先把各种实验用品都找齐咯。
像那些测试用的微生物呀，比如说细菌，得保证它们是活力满满的。
还有各种培养基，这就像是微生物的“小食堂”，要准备得妥妥当当的。
化学试剂也不能少，它们在这个实验里可是关键的“小助手”。
对了，别忘了那些专门用来培养微生物的小器皿，像培养皿之类的，得洗得干干净净的，不然微生物住着可不舒服，那实验结果可能就不准啦。
我们还得把实验室的环境弄得好好的。
温度和湿度要控制在合适的范围里，就好像给微生物和试剂们创造一个舒适的“小天地”。
要是温度太高或者太低，微生物可能就“闹脾气”，不好好配合实验了。
而且呀，在这个准备阶段，我们得把实验计划再好好看几遍，确保每一个步骤都在脑袋里清清楚楚的，可不能到时候手忙脚乱的。
二、样本处理环节。
现在开始处理样本啦。
这个过程就像是给我们的“小演员”（样本）化妆一样呢。
如果是检测化学物质的致突变性，那就要把这个化学物质按照不同的浓度配好。
这个浓度的调配可得小心啦，就像厨师做菜放调料一样，多一点少一点可能味道就完全不一样了。
而且要确保化学物质完全溶解或者均匀分散在溶液里，不然有些微生物可能就会“遭遇”浓度过高或者过低的情况，这样测出来的结果就会有偏差。
要是样本是生物性的，比如说细胞之类的，那也要好好照顾它们。
把细胞从培养瓶里取出来的时候，要轻轻的，就像对待娇嫩的小花朵一样。
然后把它们放在合适的溶液里，让它们舒舒服服地准备接受后面的考验。
三、正式实验过程。
如果是检测细胞的致突变性，可能会用到一些特殊的技术，比如说细胞遗传学检测。
这时候细胞就像是一群小士兵，我们要观察它们的染色体有没有发生变化。
在显微镜下看着那些细胞的染色体，就像在看一幅神秘的小画，要是发现染色体有断裂、缺失或者其他奇怪的变化，那就可能意味着这个测试样本有致突变的能力。
四、结果观察与分析。
实验进行了一段时间后，就到了收获结果的时候啦。
致突变作用及其试验方法与评价
③环状染色体（ring chromosome） 染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒 的节段的两断端连接形成一个环时，称为环 状染色体。
④倒位（inversion） 当某一染色体发生两次 断裂后，其中间节段倒 转180再重接，称为 倒
二、突变类型
遗传毒理学家主要关注两类遗传学损伤： 基因突变
染色体畸变
端粒
着丝粒
姊 妹 染 色 单 体
端粒
染色体畸变 染色体的结构及数目改变。
组 蛋 白
基因突变 一个或几个DNA碱基对的改变。
碱基对
双 螺 旋
这些损伤多因DNA受损所致，也可能因DNA
以外的靶组织受损所致。
基因突变、染色体畸变及染色体数目变化的本
无误 修复
染色体分 离异常
重组事件 SCE 有丝分裂性交换
染色体结 构异常
基因 突变
细胞 死亡
非整倍体 多倍体
常用的致突变试验
1、细菌回复突变试验 （Ames试验） 2、哺乳动物细胞基因突变 试验 3、果蝇伴性隐性致死试验 4、染色体畸变分析 7、显性致死试验 8、小鼠可遗传易位试验
9、细菌DNA修复试验
4、细胞周期、有丝分裂与减数分裂
细胞周期指细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂
终了所经历的过程。
G0 ：DNA合成前期； G1 ：DNA合成期；
S：完成DNA复制；
G2：为有丝分裂做准备；
M：有丝分裂期
有丝分裂过程
有丝分裂指细胞核分 裂的过程，一个细胞 由此生成两个子细胞，
第六章致突变作用及其评价
2 Ames试验： 指鼠伤寒沙门氏菌／哺乳动物微粒 体酶试验，由Ames首先建立。 原理：在细菌回变试验的基础上，首先将受试 物与肝微粒体在体外进行代谢活化，再以营养缺 陷型鼠伤寒沙门氏菌作为指示微生物进行观察。
肝微粒体制备： 大鼠生前一般用多氯联苯进行肝微粒体酶诱 导，然后取肝脏组织制备匀浆，9000g离心，上 清液为S-9组分。使用时，再加入微粒体酶催化 作用中的辅助因子，即辅酶Ⅱ与6-磷酸葡萄糖， 此种混合物简称S-9混合液。
早期死亡胚胎数
致突变指数= 总着床数 早期死亡胚胎数 早期死亡胚胎率= 受孕雌性动物数 ×100% ×100
胎仔活产、死亡和吸收的特征
颜色 活产 胎仔 晚期 死胎 肉红色 灰红色 乌紫色 暗紫或 浅紫点 块 器官外形 完整成形 完整成形
自然 运动
有 无 无
对机械刺激的反应 有运动反应 无运动反应 ——
（1）基因突变；
（2）染色体畸变； （3）不分离； （4）原发性DNA损伤。
1983年重新提出将致突变试验所反应的遗传学终点 分为5类： （1）DNA完整性的改变（形成加合物断裂、交 联）；
（2） DNA重排或交换；
（3）DNA碱基序列改变；
（4）染色体完整性改变；
（5）染色体分离改变。
其中（3）实际指基因突变，而（4）、（5）依次 指染色体
3 姊妹染色单体交换（sister chromatid exchange， SCE） 试验
遗传学终点：①染色体完整性改变②DNA重排或交换
4 显性致死突变试验（dominant lethal mutation test）
遗传学终点：染色体完整性改变 原理：通过哺乳动物生殖细胞染色体畸变进行的致 突变作用试验。哺乳动物生殖细胞染色体发生突变时，往 往不能与异性生殖细胞正常结合，易出现受精卵在着床前 死亡和胚胎早期死亡。显性致突变的机理可能是生殖细胞 染色体的断裂和易位。 1. 试验动物：多用雄性大鼠或小鼠进行。
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细菌回复突变试验（Ames试验）[1]
Ames 试验是利用突变体的测试菌株，观察受试物能否纠
正或补偿突变体所携带的突变改变，判断其突变性。
原理：采用鼠伤寒沙门菌组氨基酸缺陷突变株作为指示微
生物，检测受试物致突变的实验。鼠伤寒沙门菌突变型菌 株为组氨基酸缺陷型(his-),不能自行合成组氨酸,在无组 氨酸的选择性培养基上不能正常生长，而在含组氨酸的培 养基上则可正常生长，当受到致突变物诱变后突变型回复 突变为野生型（his+），表现为在无组氨酸的培养基上也 能生长的菌落数。如图示：
致突变实验综合分析及评价——第二部分
CONTENTS
01 细菌回复突3
结果判断依据
04
分析评价
2015-5-22
背景资料
某单位欲对农药——96%二氯吡啶酸原药，进行致
突变试验综合分析及评价，见相关资料。
现请根据所学知识，查阅资料和文献，思考并讨
论以下问题。
阴性 Dunnet-t
不拒绝 H0
实验组
检验
阳性， 剂量反 应关系 阳性 P≤0.05 ，拒绝 H0，接受 H1. 拒绝 H0， 接受 H1。 阴性 不存在
阳性
存在
2015-5-22
结果评价
结果评价[4]：试验结果表明，受试物各剂量组对各测试菌 株在加或不加S9的条件下，其回变菌落数均未超过阴性对 照组回变菌落数的 2倍，亦无明显的剂量——反应关系， 而阳性对照组各测试菌株的回变菌落数均明显增加，并超 过阴性对照组回变菌落数的 2倍以上。因此可认为 95 ％二 氯吡啶酸原药无诱发菌株基因突变活性。
正向突变
野生型细菌（ his+ ） （his-）
2015-5-22
突变型细菌
实验方案[2-5]
一、实验名称： 96%二氯吡啶酸原药的鼠伤寒沙门氏菌回 复突变试验 二、实验目的：观察95％二氯吡啶酸原药对鼠伤寒沙门菌 回复突变试验 (Ams 试验)菌株基因突变，初步探讨其致突 变性的强弱。为该农药的毒理学安全性评价提供基础数据。 三、实验原理：鼠伤寒沙门菌突变型菌株为组氨基酸缺 陷型(his-),不能自行合成组氨酸,在无组氨酸的选择性培 养基上不能正常生长，而在含组氨酸的培养基上则可正常 生长，当受到致突变物诱变后突变型回复突变为野生型 （his+），表现为在无组氨酸的培养基上也能生长的菌落 数。根据试验菌株在无组氨酸的培养基上能否形成菌落以 2015-5-22 及形成菌落的多少，判定受试物是否具有致突变性及致突
实验方案
四、试验步骤 1、受试物[5]：95％二氯吡啶酸原药，白色絮状固体。 2、溶剂：二甲基亚砜(DMSO)，光谱纯，无菌。 3 、 Ames 菌株：鼠伤寒沙门菌标准突变株 TA97 、 TA98 、 TA100和TA102。 剂量：采用平板掺入法，在加S9(+S9)和不加S9(一S9)条 件下进行测试。在不加S9的条件下测试该药对 TA100菌株 产生的最小毒性的浓度作为剂量选择的依据。查阅相关文 献后（若没有相关文献则根据预实验结果）以每皿5 000ug为最高剂量，按5倍组距下设每皿1 000、200、40、 8ug4个剂量组。 4、对照组：设自发对照组、阴性对照组和阳性对照组。 阳性对照组不加 S9 的 TA97 、 TA98 和 TAl02 菌株用敌克松 (Dexon)，TAl00菌株用叠氮钠(NaN3)；阳性对照组加S9的 TA97、TA98和TAl00菌株用2-氨基芴(2-AF)，TAl02菌株用 1，8·二羟基蒽醌(1，8-HAQ)。37℃培养48 h后计数每皿 2015-5-22 回变菌落数，每个剂量作3个平行皿。
实验结果判断[4]
若96%二氯吡啶酸原药的回变菌落数超过自发回变菌落数
的两倍以上，且各剂量组间呈剂量一反应关系，则该药对
鼠伤寒沙门菌标准突变型菌株有诱发基因突变的作用，反 之，这无该作用。
2015-5-22
统计分析
2015-5-22
统计分析
对照组
单因素方 差分析
阴性
P>0.05，不拒绝 H0。
2015-5-22
参考文献
[1]王心如.毒理学基础[M].人民卫生出版社，2014,162.
[2]GB 15193.4-2014 食品安全国家标准 细菌回复突变试
验(S)
[3]GB15670-1995,农药登记毒理学试验方法 (S)
[4]张爱华，张华.公共卫生与预防医学实验教程 [M].科学
出版社，2012, 130-135.
[5]95%二氯吡啶酸原药 重庆双丰化工公司—盖德化工网.
2015-5-22
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