体内致突变试验——Pig-a基因突变试验概况和进展
基于TK6细胞的体外PIG-A基因突变检测方法的建立
基于TK6细胞的体外PIG-A基因突变检测方法的建立李若婉;周长慧;黄鹏程;常艳【摘要】目的:建立基于人成淋巴TK6细胞的体外磷脂酰肌醇聚糖A类(PIG-A)基因突变试验方法,研究甲基磺酸乙酯(EMS)与苯并芘(B[a]P)诱导TK6细胞PIG-A基因突变的能力,并探讨该方法用于药物开发初期遗传毒性筛选和评价的前景.方法:通过免疫磁珠分离清除TK6细胞株中预先存在的GPI(-)细胞(即PIG-A基因突变细胞),然后连续40 d测定正常传代培养TK6细胞PIG-A基因的自发突变率.设不添加体外代谢活化系统长时处理组(24 h-S9)和添加体外代谢活化系统短时处理组(4h+S9),并分别采用3个不同浓度50、75、100μmol/L的EMS和4、8、16μmol/L的B[a]P处理TK6细胞10 d,在第11天收获细胞.使用CD19、CD55、CD59抗体和核酸染料7-AAD对细胞进行标记,然后用流式细胞仪分析CD19阳性细胞中,CD55和CD59表达阴性的细胞频率.结果:经过免疫磁珠分离,TK6细胞中预先存在的PIG-A基因突变细胞频率降低至2.5×10-5.连续测定40 d TK6细胞的PIG-A基因自发突变率,计算得到其自发突变率为5.04×10-7个/d.与阴性对照组比较,不同浓度EMS和B[a]P诱导产生的PIG-A基因突变细胞比例均呈剂量依赖性增加,并超过阴性对照组的2倍以上.结论:本研究初步建立了基于TK6细胞的体外PIG-A基因突变检测方法.该方法成本较低,简便、快速,具有应用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的潜力.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2019(031)003【总页数】7页(P242-248)【关键词】PIG-A基因;TK6细胞;遗传毒性;基因突变检测【作者】李若婉;周长慧;黄鹏程;常艳【作者单位】中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心,上海益诺思生物技术股份有限公司,上海 201203;中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心,上海益诺思生物技术股份有限公司,上海 201203;中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心,上海益诺思生物技术股份有限公司,上海201203;中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心,上海益诺思生物技术股份有限公司,上海 201203【正文语种】中文【中图分类】Q355遗传毒性的危害识别和风险评估在临床前化学品和药品的安全性评价中起着至关重要的作用。
体内Pig-a基因突变检测方法研究
中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文体内Pig-a基因突变检测方法研究The Study of Pig-a Gene MutationAssay Trial in Vivo姓名：邓媛元学号： 8450309077904015专业：免疫学研究方向：遗传毒性导师姓名：王雪二零一二年六月目录中文摘要 (1)Abstract (3)第一章前言 (7)第二章 SD大鼠Pig-a基因突变检测方法的建立 (11)第一节 SD大鼠Pig-a基因突变检测方法的建立 (11)1.1材料和方法 (11)1.2实验结果 (13)1.3讨论 (15)第二节 SD大鼠经ENU和DMBA暴露后Pig-a基因突变发生率 (17)2.1材料和方法 (17)2.2实验结果 (18)2.3讨论 (19)第三节 SD大鼠自发和诱发产生Pig-a基因突变与其周龄的关系 (21)3.1材料和方法 (21)3.2实验结果 (22)3.3讨论 (23)第四节 SD大鼠Pig-a基因突变检测方法评估 (25)前言 (25)4.1样本重复性分析 (25)4.2仪器稳定性分析 (25)4.3染色细胞稳定性分析 (26)4.4血液样本稳定性分析 (26)4.4流式细胞仪检测准确性评估 (27)4.5检测细胞数目对实验结果的影响 (29)第五节小结 (30)第三章 SD大鼠Pig-a基因突变检测方法的应用 (32)第一节两种抗肿瘤药物诱发SD大鼠Pig-a基因突变研究 (32)前言 (32)1.1顺铂注射液对SD大鼠Pig-a基因突变的影响 (32)1.2盐酸甲基苄肼对Pig-a基因突变的影响 (36)第二节两种中药主要成分诱发SD大鼠Pig-a基因突变研究 (40)前言 (40)2.1材料和方法 (40)2.2实验结果 (41)2.3讨论 (43)第三节小结 (44)第四章SD大鼠Pig-a基因突变检测RET方法的建立 (46)前言 (46)1.1材料和方法 (46)1.2实验结果 (48)1.3讨论 (52)第五章综述 (54)缩略语中英对照 (62)致谢 (63)版权申明 (64)中文摘要随着新药不断上市及对药品安全性的日益重视，作为药物非临床研究的重要组成部分的遗传毒性检测，其检测新技术和新方法的开发成了当务之急。
医学实验动物学
《实验动物管理条例》（1988年） 实验动物是指人工饲养、繁育，对其携带的微 生物及寄生虫实行控制、遗传背景明确或者来 源清楚，而应用于科学研究、教学、生产和检 定以及其他科学实验的动物 《实验动物管理条例》 （新修订，未公布） 实验动物是指经人工培育、遗传背景明确或来 源清楚，对其质量实行控制、用于科学实验及 产品生产的动物
• 人类各种疾病的发生发展十分复杂，要深入 探讨其疾病的发病及防治机理是不能也不应 该在病人身上进行的，但可以通过对动物各 种疾病和生命现象的研究，进而推用到人类
• 医学生物学的科研课题有60%以上需要用实验 动物，许多课题的研究离开实验动物就寸步 难行
制药工业方面
• 新的药品必须以大量的动物实验进行严格的安全性、 有效性评价，包括动物急性、亚急性及慢性毒性试 验、三致试验（致畸、致癌、致突变），包括以啮 齿类动物、犬或猴等不同进化程度动物进行试验， 证明对人体安全可靠后，方能呈有关部门审批，申 请生产批号
多个近交系杂交而成
杂交群 (Cross Breeding colony) 两种不 同品系杂交，利用杂交一代 F1杂交优势
突变系（Mutant strain）具有特殊突变基因 的品系动物，正常染色体基因发生突变，并具有各 种遗传缺陷的动物
• 按微生物控制的程度,目前我国将实验动物 分为四个等级
• 1 普通级动物（Conventional Animals) 2 清洁级动物（Clean Animals) 3 无特定病原体动物(Special Pathogen Free Animals, SPF) 4 无菌动物(Germ Free Animals)、悉生动物 (Gnotobiotic Animals)
纳米材料遗传毒性试验选择指南 草案
附件1纳米材料遗传毒性试验选择指南(草案)纳米材料独特的物理化学性质及其与生物体相互作用特性为其在食品加工、抗菌产品生产、药物载体开发、肿瘤诊疗、体内示踪等领域的应用提供了广泛的前景。
新型纳米材料的诞生为人类带来机遇的同时也带来了挑战。
大量纳米材料的涌现，极大程度上增加了人体与纳米材料接触的机会，纳米材料的安全性评价成为关注的热点。
如何合理评价纳米材料对人体的潜在毒性，特别是慢性或者长期毒性，预测其潜在毒性风险是目前全科学界及各相关监管部门亟需解决的问题。
国际标准（ISO / TS 80004-2：2015）[1]对纳米粒子（nanoparticle）的定义为：微小的纳米物体（长度范围约1 nm至100 nm），所有外部尺寸在纳米级，其中纳米物体最长和最短轴的长度没有显著差异。
如果尺寸差异显著（通常超过三倍），则为纳米纤维或纳米板。
纳米粒子的尺寸效应和表面活性高等特点使它极易透过细胞膜，可在表面活性和蓄积性的共同作用下，对细胞遗传物质产生直接或间接的相互作用。
尤其是携带金属离子的纳米粒子进入体内后有可能通过氧化应激等作用机制诱发染色体或DNA断裂[2-5]。
此外，纳米材料进入人体后可能在脏器蓄积并长期存在。
纳米材料的遗传毒性，现已发展成一个专门的亚分支研究领域—纳米遗传毒理学[6-7]。
对纳米材料的潜在致癌和致畸作用评估，是对纳米材料对人体安全性评价中极为重要的一环。
纳米材料与生物体作用方面存在一定特殊性，与大多数化学品和环境诱变剂有所差异，导致现行常规使用的遗传毒性标准化评价组合可能无法有效而可靠地进行评价。
美国FDA医疗器械和辐射健康中心（Center for Devices and Radiological Health, FDA）在2010年9月指出，有必要对标准遗传毒性试验方法进行评价，并分析传统方法是否适用于纳米材料的毒性评价[8]。
经合组织（The Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）纳米材料产品工作组（Working Party on Manufactured Nanomaterials，WPMN）于2013年11月18-19日在加拿大渥太华召开纳米材料产品遗传毒性专题研讨会，就是否需要在现有OECD遗传毒性试验指导原则范畴内对纳米材料遗传毒性测试方法进行特别调整，以及/或需要制定新的试验指导原则或指导性文件进行讨论。
致突变作用及其试验方法与评价
③环状染色体（ring chromosome） 染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒 的节段的两断端连接形成一个环时，称为环 状染色体。
④倒位（inversion） 当某一染色体发生两次 断裂后，其中间节段倒 转180再重接，称为 倒
二、突变类型
遗传毒理学家主要关注两类遗传学损伤： 基因突变
染色体畸变
端粒
着丝粒
姊 妹 染 色 单 体
端粒
染色体畸变 染色体的结构及数目改变。
组 蛋 白
基因突变 一个或几个DNA碱基对的改变。
碱基对
双 螺 旋
这些损伤多因DNA受损所致，也可能因DNA
以外的靶组织受损所致。
基因突变、染色体畸变及染色体数目变化的本
无误 修复
染色体分 离异常
重组事件 SCE 有丝分裂性交换
染色体结 构异常
基因 突变
细胞 死亡
非整倍体 多倍体
常用的致突变试验
1、细菌回复突变试验 （Ames试验） 2、哺乳动物细胞基因突变 试验 3、果蝇伴性隐性致死试验 4、染色体畸变分析 7、显性致死试验 8、小鼠可遗传易位试验
9、细菌DNA修复试验
4、细胞周期、有丝分裂与减数分裂
细胞周期指细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂
终了所经历的过程。
G0 ：DNA合成前期； G1 ：DNA合成期；
S：完成DNA复制；
G2：为有丝分裂做准备；
M：有丝分裂期
有丝分裂过程
有丝分裂指细胞核分 裂的过程，一个细胞 由此生成两个子细胞，
基因突变可行性研究报告
基因突变可行性研究报告一、研究目的和意义基因突变是指生物体基因组中发生的突然性变异，可能对生物体的性状和功能产生不同程度的影响。
基因突变的可行性研究旨在探讨基因突变对生物体的影响，评估基因突变的可行性，并为基因突变在遗传工程和生物学研究中的应用提供理论基础。
本研究选取了实验动物小白鼠为研究对象，通过基因编辑技术诱导小白鼠基因突变，并对其进行系统性评估，以验证基因突变的可行性和对小白鼠的生物学影响。
二、研究方法1.实验动物选择及分组本研究选取了实验动物小白鼠为研究对象，将小白鼠随机分为实验组和对照组，每组均包含10只小白鼠。
2.基因编辑技术诱导基因突变利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，设计合适的靶向序列，针对小白鼠基因组中特定基因进行突变诱导。
通过电转染或病毒载体等方法将编辑工具导入小白鼠胚胎干细胞中，筛选获得基因突变幼年小白鼠。
3.检测基因突变效率利用PCR或测序技术对编辑过的小白鼠进行基因突变效率的检测，确认基因编辑是否成功，评估编辑效果。
4.系统性评估基因突变效果对实验组和对照组小白鼠进行生长发育、行为学、生理指标等多方面的系统性评估，比较两组小白鼠的差异性，评估基因突变对小白鼠的影响。
5.数据统计及分析采集实验数据后，利用统计学方法对数据进行分析和处理，确定实验结果的可信度和显著性。
三、研究结果与讨论1.基因突变诱导经过基因编辑技术诱导，成功获得了小白鼠基因突变模型，基因突变效率达到80%以上。
2.生物学影响评估对实验组和对照组小白鼠进行系统性评估后发现，实验组小白鼠在生长发育、行为学和生理指标等方面与对照组存在显著差异。
实验组小白鼠出现了明显的生长迟缓和行为异常等情况，部分实验组小白鼠甚至出现了严重的生理缺陷。
3.数据分析通过数据统计和分析，发现实验组小白鼠的生长发育和生理功能受到显著影响，表现出异常生长曲线和异常生理指标。
四、研究结论及启示1.本研究通过基因编辑技术成功诱导了小白鼠基因突变模型，并对其进行全面、系统性评估，评估了基因突变对小白鼠的生物学影响。
生物实验突变实验报告
一、实验名称生物实验——突变实验研究二、实验目的1. 探究基因突变对生物性状的影响；2. 熟悉基因突变实验的操作步骤和原理；3. 培养实验设计和数据分析能力。
三、实验原理基因突变是指基因序列发生改变，导致蛋白质合成或功能发生改变。
基因突变是生物进化的重要来源，也是生物多样性的基础。
本实验通过诱变剂诱导基因突变，观察突变体性状变化，分析基因突变对生物性状的影响。
四、实验器材及试剂1. 实验器材：恒温培养箱、显微镜、显微镜载物台、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、酒精灯、酒精、蒸馏水、酒精灯等。
2. 实验试剂：MS培养基、诱变剂（如亚硝酸盐、紫外线等）、植物种子、蒸馏水等。
五、实验步骤1. 准备实验材料：将植物种子浸泡在蒸馏水中，用镊子取出，放入MS培养基中培养。
2. 诱变处理：将培养好的植物幼苗放入含有诱变剂的MS培养基中，处理一定时间后取出。
3. 观察突变体性状：将诱变后的植物幼苗放入MS培养基中继续培养，观察突变体性状变化，如植株高度、叶片形状、花色等。
4. 数据记录与分析：对突变体性状进行统计，并与正常植株进行比较，分析基因突变对生物性状的影响。
六、实验结果1. 突变体植株高度明显低于正常植株；2. 突变体叶片形状发生改变，部分叶片呈扭曲状；3. 突变体花色与正常植株存在差异。
七、实验结论1. 基因突变可以导致生物性状发生改变；2. 诱变剂可以诱导基因突变，提高突变率；3. 本实验成功观察到基因突变对植物性状的影响。
八、讨论1. 实验过程中，诱变剂的选择和浓度对突变率有较大影响，需根据实验目的和材料特性进行合理选择；2. 实验结果受到多种因素的影响，如环境条件、遗传背景等，需进行多因素分析；3. 本实验为基因突变研究提供了实验依据，有助于深入理解基因突变对生物性状的影响。
九、实验改进建议1. 在实验过程中，可尝试不同诱变剂和浓度，观察突变率的变化，为后续实验提供参考；2. 增加实验重复次数，提高实验数据的可靠性；3. 对突变体进行分子生物学分析，确定突变基因，为基因功能研究提供线索。
第六章--致突变作用及其评价
国际环境致突变物致癌物防护委员会 〔ICPEMC〕于1979年曾把致突试验按其观察的 遗传学终点分为四类：
〔1〕基因突变； 〔2〕染色体畸变； 〔3〕不别离； 〔4〕原发性DNA损伤。
1983年重新提出将致突变试验所反响的遗传学终点 分为5类：
〔1〕DNA完整性的改变〔形成加合物断裂、交 联〕；
〔2〕 DNA重排或交换；
1. 试验动物：多用雄性大鼠或小鼠进行。
2. 动物接触被检物的时间：可为一次、5～7天或3个月。 其中3个月者效果较好。然后将雄性与雌性动物按1：2比例 交配，雌性动物不接触化学受试物。小鼠连续交配6周，大 鼠8周，每周更换一批雌鼠。
3. 观察指标
雌鼠受孕后12～13天剖腹取出子宫，检查并记录活胎 数、早期死亡胎数、晚期死亡胎数，并计算总着床数〔可 按早期与晚期死亡胎数和活胎数计算〕以及每只受孕动物 平均着床数。
3 姊妹染色单体交换〔sister chromatid exchange，SCE〕 试验
遗传学终点：①染色体完整性改变②DNA重 排或交换
4 显性致死突变试验〔dominant lethal mutation test〕
遗传学终原理点：：通染过色哺体乳完动物整生性殖改细变胞染色体畸变进行的致
突变作用试验。哺乳动物生殖细胞染色体发生突变时，往 往不能与异性生殖细胞正常结合，易出现受精卵在着床前 死亡和胚胎早期死亡。显性致突变的机理可能是生殖细胞 染色体的断裂和易位。
观察对象：嗜多染红细胞〔PEC〕中的微核发生率， PEC是红细胞成熟发育过程中的一个阶段，此时红
细胞主核已经排出，因细胞质内含有核糖体，Giemsa染色 后呈兰灰色，便于与成熟红细胞鉴别〔成熟红细胞Giemsa 染色后呈桔红色〕，微核与细胞核一致，呈紫红色或紫兰 色。
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Pig-a基因突变试验——研究与应用进展
李岩，霍娇，张立实
四川大学华西公共卫生学院，四川省食品安全监测与风险评估重点实验室
327098360@
遗传毒性评估是化学品和药品安全性评价的重要组成部分，现有致突变试验虽已很多，但仍不能完全满足毒理学安全性评价和风险评估的要求。
近几年来，一项新的体内致突变试验——Pig-a基因突变试验受到广泛关注，该试验的检测终点为基因突变，且能够利用流式细胞术对人体突变细胞频率实现高通量检测。
Pig-a基因位于人类X染色体，编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶复合物，参与糖基磷脂酰肌醇（GPI）连接蛋白的早期合成。
当Pig-a基因发生突变时，细胞不能正常合成GPI连接蛋白，致使造血干细胞最终分化的血细胞（包括红细胞等）表型缺失。
Hall等学者收集患者外周血，用荧光标记的单抗与细胞GPI连接蛋白反应，使用流式细胞术（FCM)）检测未被荧光标记的突变细胞，根据表型缺失细胞的比例来诊断阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）。
鉴于对PNH中Pig-a基因的研究以及FCM对Pig-a基因表型缺失的成功检测，不少学者期望使用Pig-a基因作为体细胞突变实验的报告基因。
目前已建立两种方法测定Pig-a基因突变率：流式细胞术或有限稀释法。
流式细胞术方法利用梯度离心液等方式富集目标细胞，利用荧光标记的抗体与目标细胞孵育，标记目标细胞，以及至少标记一种GPI连接蛋白标志物。
之后利用散射光区分血小板、白细胞和红细胞，核酸染色还可用于区分正染红细胞和网织红细胞。
另一种检测方法为有限稀释法。
淋巴细胞能够将前气单胞菌溶素转变为气单胞菌溶素，气单胞菌溶素能够与正常细胞GPI连接蛋白结合，导致细胞膜完整性受损以致细胞死亡。
而Pig-a基因发生突变的细胞GPI连接蛋白缺失，因此得以存活。
该方法利用ProAER作为选择物质，使发生突变T淋巴细胞在96孔板内克隆性生长，而未突变的细胞死亡。
Pig-a基因突变试验能够利用少量样本相对迅速地得到较为精确的结果，并节省实验室工作量。
有学者将Pig-a基因突变试验、体内微核试验与28天重复剂量染毒试验结合应用，通过收集不同时间点外周血，同时检测同一动物同一靶组织的非整倍体诱变剂、染色体断裂诱变剂和基因突变诱变剂。
该整合方法不仅可比较化学物对同一动物造成的不同遗传学终点损伤，还可以研究重复染毒对突变频率的影响，并且大量节省实验动物，实验过程更为简便快捷。
关键词：Pig-a基因，流式细胞术，遗传毒性。