KRAS基因突变的检测及其临床意义
KRAS和BRAF基因检测的必要性
KRAS和BRAF基因检测的必要性KRAS基因位于12号染色体上，是表皮生长因子受体（EGFR）功能信号的下游分子，在膜受体到腺苷环化酶信号转导中起重要作用。
大约30%的人类肿瘤细胞中出现RAS基因突变，其中KRAS基因对人类癌症影响最大。
KRAS基因与一些肿瘤的发病机理和预后相关，主要以结直肠癌、肺癌和胰腺癌的突变率比较高。
KRAS基因突变发生在肿瘤恶变的早期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致。
一般认为，KRAS基因状态不会因治疗而发生变化。
KRAS基因最常见的突变方式为点突变，研究表明，90%的KRAS基因突变位于2号外显子的第12和13密码子位点，结直肠癌患者突变率为27%-43%。
目前，结直肠癌和肺癌的治疗仍以手术治疗为主，辅助以化学药物治疗、放射治疗。
但是，随着肿瘤分子生物学、基因组学的不断发展，肿瘤靶向治疗预测指标及分子靶向治疗药物受到了越来越多的重视，并被逐渐应用到临床治疗当中。
BRAF基因位于人染色体7q34,长约190kb,是Ras-Raf-MEK-ERK信号转导通路重要的转导因子，主要通过有丝蛋白激酶通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶来发挥作用，该酶将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，启动多种因子参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。
BRAF在结直肠癌的高、中、低分化中表达的阳性率差异明显，肿瘤分化程度越低，BRAF阳性表达率越高，可为结直肠癌的诊断、治疗提供新的依据。
近些年来，结直肠癌和肺癌的治疗领域中最大亮点是确定KRAS基因和BRAF基因状态与抗EGFR抗体疗效的相关性。
最新的研究显示，靶向治疗药物西妥昔单抗治疗的有效性受KRAS基因和BRAF 基因状态的影响，突变型的KRAS基因和BRAF基因无需EGFR接收信号能够自动活化该通路并启动下游信号的转导，因此只有野生型KRAS和BRAF基因的患者才能从抗EGFR的治疗中获益，而突变型的患者则不能。
kras和egfr检测与临床应用-文档资料
EGFR突变背景
• 研究发现EGFR突变与吉非替尼、厄洛替尼的疗效密切有关。其中 EGFR突变的患者对吉非替尼、厄洛替尼治疗敏感，有效率在80%以 上；而EGFR野生型的患者的有效率在10%以下。 • 吉非替尼、厄洛替尼作为一线药物治疗非小细胞肺癌，相比传统的化 疗可以取得更长的无进展生存期（PFS），且副作用相对较小，患者 容易耐受，但总体生存期（OS）并未延长。 • EGFR-TKI目前主要用于非小细胞肺癌一线、二线和维持治疗。我国 大部分医生将其用于二线（69.4%）治疗，41.7%的医生将其用于一 线治疗，27.8%的医生将其作为维持治疗药物。
美国FDA指南推荐：在使用靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结肠直肠癌前 必须检测KRAS基因的基因型；2019年7月6日批准第一个用于结直肠癌的基因检测（ Qiagen），以判断西妥昔单抗是否有效； 美国国立综合癌症网络（NCCN，2019）指南说：转移性结直肠癌患者均应进行RAS 突变检测（KRAS和NRAS），至少应检测KRAS第二外显子的突变情况。KRAS或 NRAS突变型的病人不应采取西妥昔单抗或帕尼单抗治疗。
KRAS和EGFR检测与临床应用
汇报内容
• KRAS和EGFR的简介及临床意义 • ARMS-PCR的基本原理和技术特点 • 等位特异性引物设计 • KRAS试剂盒开发简介
KRAS和EGFR的简介及临床意义
KRAS背景
• KRAS是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体，是RAS基因 家族成员之一，编码的蛋白主要参与PI3K、PTEN、AKT和RAF、 MEK、ERK信号通路的调控； • EGFR在通路中位于KRAS上游，配体与之结合后可以激发其酪氨酸 激酶活性，导致KRAS的活化和通路中信号传导；
EGFR和KRAS基因检测意义
• 检测K-ras基因突变是深入了解癌基因的情 况、了解各种癌症的发展预后、放化疗疗 效的重要指标。 • 1.K-ras基因突变发生在肿瘤恶变的早期， 并且原发灶和转移灶的K-ras基因高度保持 一致。一般认为，K-ras基因状态不会因治 疗而发生变化。 • 2.K-ras基因突变见于20%的非小细胞肺癌 (NSCLC)，其中肺腺癌占30%～50%。
KRAS基因 - K-ras基因突变发生的时间 • K-ras基因突变发生在肿瘤恶变的早期，并 且原发灶和转移灶的K-ras基因高度保持一 致。一般认为，K-ras基因状态不会因治疗 而发生变化。 大肠癌患者K-ras基因突变异 常的概率为30％－35％。
KRAS基因 - K-ras基因检测（K-ras,p21） 临床意义
EGFR基因检测在肺癌中的应用
检测方法：DNA测序法 检测周期: 7-10天
检测位点：EGFR的18，19，21号外显子
标本要求： 肿瘤组织病理切片，厚度8-10μm, 5-10张，要 求肿瘤组织占标本的70%以上 支气管镜活检组织，厚度8-10μm，需要10张 切片
KRAS基因检测
KRAS蛋白处于EGFR信号 通路通路的下游。在生理情况 下，EGFR信号通路活化后， KRAS蛋白短暂激活，其后迅 速失活，KRAS激活/失活效应 是受控的。 而KRAS基因突变时，可以 导致 EGRF 信号通路持续激活， 加 速 肿 瘤 细 胞 增 殖 。
KRAS基因检测在大肠癌中的应用
检测方法：DNA测序法 检测周期: 7-10天
检测位点：KRAS基因第2外显子的12，13密码子
标本要求： 肿瘤组织病理切片，厚度8-10μm, 5-10张，要求肿 瘤组织占标本的70%以上。 肠镜活检组织，厚度8-10μm，需要10张切片。
KRAS和EGFR检测与临床应用
KRAS和EGFR检测与临床应用KRAS和EGFR检测与临床应用1、引言1.1 背景1.2 目的1.3 范围2、KRAS基因检测2.1 KRAS基因的作用2.2 KRAS突变与肿瘤发生2.3 KRAS突变的检测方法2.3.1 Sanger测序2.3.2 PCR-RFLP2.3.3 ARMS-PCR2.3.4 NGS2.4 KRAS突变的临床应用2.4.1 KRAS突变与癌症预后2.4.2 KRAS突变与抗癌药物治疗反应2.4.3 KRAS突变检测的指南和建议3、EGFR基因检测3.1 EGFR基因的作用3.2 EGFR突变与肿瘤发生3.3 EGFR突变的检测方法3.3.1 ARMS-PCR3.3.2 NGS3.3.3 FISH3.4 EGFR突变的临床应用3.4.1 EGFR突变与肺癌治疗3.4.2 EGFR突变与EGFR抑制剂治疗反应3.4.3 EGFR突变检测的指南和建议4、KRAS和EGFR检测比较和结合应用4.1 KRAS和EGFR突变的共现率4.2 KRAS和EGFR突变的相互影响4.3 KRAS和EGFR联合检测的临床应用5、附件在此文档的附录中，提供了相关研究和报告，包括检测方法的详细说明，相关数据的分析和文献引用。
6、法律名词及注释- KRAS：Kirsten rat sarcoma家族成员A基因，是一种常见的肿瘤相关基因，突变与肿瘤发生和预后相关。
- EGFR：表皮生长因子受体基因，参与调控细胞生长和分化，EGFR突变与多种癌症的发生和治疗反应相关。
- Sanger测序：一种常用的DNA测序方法，通过测定DNA序列来检测基因的突变状态。
- PCR-RFLP：聚合酶链反应-限制性片段长度多态性，通过PCR扩增后，利用限制性酶对靶基因进行切割，根据限制性酶切割位点的差异来检测突变。
- ARMS-PCR：引物特异性扩增-PCR，使用不同的引物来选择性扩增突变和野生型基因片段，根据扩增产物的差异来判断突变状态。
kras 基因突变位点
kras 基因突变位点Kras基因突变位点Kras基因是人类细胞中一种重要的信号传导蛋白，它参与了细胞生长、分化和存活等过程。
然而，当Kras基因发生突变时，就会导致细胞信号传导的异常，进而引发多种疾病，包括多种肿瘤的发生和发展。
Kras基因突变位点通常指的是Kras基因中的某个特定位点发生了突变。
这些突变位点一般位于Kras基因的编码区域，即决定蛋白质序列的部分。
Kras基因突变位点的研究对于了解肿瘤的发生机制、预测治疗效果以及指导个体化治疗具有重要意义。
在Kras基因中，最常见的突变位点发生在编码区域的第12、13和61位。
这些位点的突变通常导致了Kras蛋白的功能异常，使其在细胞信号传导中扮演错误的角色。
这些突变位点的研究已经广泛应用于肿瘤的分子诊断和治疗策略的制定中。
Kras基因突变位点的研究为肿瘤的分子诊断提供了重要依据。
通过检测肿瘤组织中Kras基因突变位点的存在与否，可以确定患者是否具有Kras突变。
这一信息对于判断治疗方案的选择和预后评估具有重要意义。
例如，在结直肠癌中，KRAS基因突变与抗EGFR抗体治疗的疗效密切相关。
因此，对于KRAS基因突变位点的准确检测可以帮助医生预测患者对抗EGFR抗体治疗的敏感性。
Kras基因突变位点的研究也为肿瘤的个体化治疗提供了重要依据。
一些药物，如EGFR抑制剂、KRAS抑制剂等，已经应用于临床治疗中。
然而，这些药物的疗效在不同个体中存在差异。
研究发现，Kras基因突变位点的不同可以影响药物的作用机制和疗效。
因此，通过检测患者具体的Kras基因突变位点，可以为个体化治疗方案的制定提供重要依据。
Kras基因突变位点的研究还有助于深入了解肿瘤的发生和发展机制。
Kras基因突变是许多肿瘤中常见的遗传变异之一。
通过对不同突变位点的研究，可以揭示Kras基因突变对细胞信号传导的影响机制，进而加深对肿瘤形成和发展的认识。
这对于寻找新的治疗靶点、开发更有效的抗肿瘤药物具有重要意义。
结直肠癌Kras、Nras基因突变检测及临床意义
结直肠癌Kras、Nras基因突变检测及临床意义徐利芬【摘要】目的：探究结直肠癌Kras、Nras基因突变检测方法和效率。
方法：选取2013年12月~2015年12月间我院收存的100例结直肠癌标本作为研究对象。
对其分别进行荧光定量PCR检测和Sanger测序检测,对比观察两种方法检测效果。
结果：在本次研究中,基因总体突变率高达80%,而荧光定性PCR检测的准确率为91%,而Sanger检测准确率为96.35%。
两组数据对比差差异具有统计学意义（P 〈0.05）。
结论：在对结直肠癌患者的临床检测中,对Kras和Nras基因突变进行临床检测,可以为临床治疗提供有力的依据,进而可以提升患者的治疗效果。
【期刊名称】《生物技术世界》【年(卷),期】2016(000)004【总页数】1页(P125-125)【关键词】结直肠癌 Kras基因 Nras基因基因突变【作者】徐利芬【作者单位】贵州医科大学附属医院，贵州贵阳550004【正文语种】中文【中图分类】R73随着人们生活质量的不断提升，结直肠癌的机率在逐渐升高。
医学研究人员认为，结直肠癌与Kras基因突变和Nras基因突变之间存在较大的关联，并且在运用靶向药物进行治疗时，传统的治疗方案对于基因突变患者明显的缺乏实效性［1］。
因此，加强对患者两种基因的检测研究，可以为患者的临床治疗提供可靠的依据，现报道如下。
1.1 一般资料选取2013年12月～2015年12月间我院收存的100例结直肠癌标本作为研究对象。
所有患者中，男性47例，女性53例，年龄18～82岁，平均年龄为（44.21±1.81）岁。
纳入标准：（1）经过临床诊断，患者均为结直肠癌患者。
（2）本次研究经过伦理委员会批准，并且患者签署知情同意书。
1.2 方法1.2.1 仪器与试剂的选择选择的检测试剂盒及石蜡标本DNA提取试剂盒均由厦门艾德生物医药科技有限公司生产，荧光定量PCR仪为美国生产。
肺癌KRAS突变意义
肺癌KRAS突变意义20%-30%的非小细胞肺癌（NSCLC）患者存在KRAS基因突变，其中腺癌患者突变比例较高。
近年来的研究越来越明确认定KRAS基因突变对NSCLC患者是一个不良预后因素。
对KRAS基因突变的检测，可以为肿瘤患者的个体化治疗提供更确切的依据，也是判断预后、确定治疗方案的重要依据。
突变的KRAS基因导致瘤细胞增殖、转移以及抵抗凋亡。
KRAS基因是野生型还是突变型，将传统意义上的一种疾病被分成两种独立的疾病。
研究显示，非小细胞肺癌患者KRAS突变型约占22%，这类患者不能从抗EGFR治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费用。
而KRAS野生型患者就很有可能从这类药物治疗中获益。
同时这些研究结果被写入了美国NCCN临床实践指南，将KRAS突变的重要性更醒目的呈现在世人眼前。
相关研究表明KRAS突变不仅预示NSCLC患者的生存结果较差，还提示其对铂类／长春瑞滨化疗无效。
越来越多的数据显示KRAS突变患者辅助化疗和EGFR-TKI靶向治疗疗效欠佳，目前，针对KRAS基因突变的NSCLC患者仍没有较为明确的治疗方案。
在研的各种治疗肿瘤的靶向药物中，只有少数将KRAS作为靶点。
针对KRAS突变的NSCLC 患者治疗方案的研制迫在眉睫。
各大药企都非常关注KRAS抑制剂的研发。
台在研KRAS抑制剂安卓健目前已于全球开展二期临床研究，与临床研究全球排名第二的ICON公司正式签约，由美国Johns Hopkins Medicine约翰霍普金斯大学医学院综合癌症中心著名教授David S. Ettinger担任二期临床计划总主持，欲进一步证明新药安卓健对KRAS突变肺癌患者疗效。
据悉，国内目前亦有针对该药开展相应临床试验，KRAS突变患者已可在国内取得药物的使用权。
肺癌KRAS突变基因检测手段及其重要性
肺癌KRAS突变基因检测手段及其重要性肺癌在我国的发病率和死亡率均呈不断上升趋势的恶性肿瘤之一，大约有15%的患者在首次就诊时伴有恶性胸腔积液即胸水，一些肺部良性疾病如肺结核、肺炎等也可伴有胸水，所以区分胸水的性质具有十分重要的意义。
胸水癌细胞学检查是临床上鉴别良恶性胸水最可靠的方法，具有很高的特异性，但阳性率较低，所以临床上良恶性胸水的鉴别诊断仍存在一些困难。
近年研究表明p16基因和KRAS基因突变均与肺癌有关。
Ras基因是常见的癌基因，包括三种：KRAS，HRAS和NRAS，大约30%的人类肿瘤细胞中出现RAS基因突变，其中KRAS基因对人类癌症影响最大。
KRAS基因与一些肿瘤的发病机理和预后相关，主要以结直肠癌、肺癌和胰腺癌的突变率比较高。
KRAS基因突变发生在肿瘤恶变的早期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致。
其中与肺癌关系最为密切的是KRAS。
KRAS基因位于12号染色体上，其主要功能是编码P21蛋白，P21蛋白与GTP结合时细胞内信号转导系统开放，P21蛋白具有GTP酶活性，可水解GTP为GDP，P21转而与GDP结合而失活，细胞内信号转导系统关闭。
当ras基因突变后，GTP酶减弱，水解GTP为GDP的作用受抑制，P21持续与GTP结合，细胞内信号转导系统持续开放，细胞无休止地分裂和增殖，导致细胞转化和恶变。
KRAS基因突变的热点位于第1外显子的12、13位密码子和第二外显子的61位密码子，其中以12位密码子突变率最高。
目前全球唯一在研的直接抑制RAS基因的小分子靶向药物安卓健已进入FDA二期临床试验。
探讨p16和KRAS基因在良恶性胸水细胞中的突变情况及对肺癌的诊断作用。
方法：研究组为54例伴有恶性胸水的肺癌患者，对照组为28例出现胸水的结核性胸膜炎和其他炎性胸膜炎患者。
常规抽取胸水，提取胸水细胞DNA，采用PCR-SSCP方法，分别对p16基因和KRAS基因第1、2外显子进行突变分析。
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KRAS基因突变的检测及其临床意义
RAS基因家族由KRAS、HRAS 和NRAS组成，基因家族各成员间同源性可达85%。
RAS 基因编码p21蛋白，分子量为21KD，位于细胞膜的内表面，具有GTP酶活性，参于传导细胞增殖信号的调控系统。
其激活状态为GTP结合状态，失活状态为GDP结合状态，其转变为活性致癌基因的主要部位是第12、13 和61 密码子的突变，其中以第12 密码子点突变最常见。
RAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因，该基因的体细胞突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15%-30%，在结直肠癌患者中为20%-50%。
作为EGFR信号通路下游最重要的的效应因子，KRAS在肿瘤信号转导中发挥重要作用。
对KRAS基因突变的检测，可以为肿瘤患者的个体化治疗提供更确切的依据。
西妥昔单抗和帕尼单抗都是特异性针对人类EGFR胞外区的单克隆抗体。
美国FDA批准该药单药用于治疗难治性结肠癌，及在放疗基础上治疗进展性头颈部癌。
已知EGFR信号途径下游的基因突变则会使患者对西妥昔单抗和帕尼单抗治疗产生耐药性。
2009年7月15日，美国FDA批准了对帕尼单抗和西妥昔单抗的说明书的修改，在西妥昔单抗和帕尼单抗说明书的“适应证和用法”部分明确指出，KRAS基因第12或13密码子突变的患者接受治疗无生存获益；不推荐这两种表皮生长因子受体（EGFR）抗体用于KRAS基因突变的转移性结直肠癌（mCRC）患者治疗。
根据这一提示，临床医生可以将KRAS基因突变的患者排除在接受抗EGFR单抗治疗之外，重新安排其接受其他药物替代治疗，避免对不能获益的患者进行不必要的治疗。
此外，研究表明，K-ras基因突变状态与非小细胞肺癌对吉非替尼、厄罗替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关，直肠癌患者中K-ras的突变对西妥昔单抗等药物的耐药性有关。
美国国家癌症综合网络(NCCN) 2011年版临床治疗指南指出：K-ras基因突变是EGFR酪氨酸激酶抑制剂疗效的预测指标，肿瘤患者在接受EGFR靶向药物治疗前必须进行K-ras基因突变检测，以帮助决定患者是否接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂类药物（易瑞沙/特罗凯/埃克替尼等）治疗。
携带K-ras永久激活性突变的患者本检验所不建议使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂类药物（易瑞沙/特罗凯/埃克替尼等），建议使用靶向的Ras抑制剂药物治疗。
作为RAS/FTI（法尼基转移酶抑制剂）的安卓健通过抑制Ras 的活性，进而影响其下游讯息传递因子，包括抑制PI3K 的表现量与降低Akt 的磷酸化程度；以及活化AMPK促使TSC1/TSC2 结合更紧密，进而大大的降低mTORC1 的活性，开启癌细胞的自噬作用机制；安卓健同时会活化MEK1/ ERK1/2 的路径，促进癌细胞的自噬作用机制；另外，安卓健会使线粒体不稳定，降低Bcl-2、Bcl-XL 与MCl-1 的蛋白质量，使癌细胞程序性凋亡。
由于安卓健能同时诱导癌细胞启动自噬作用与程序性凋亡的机制，而实验室的细胞毒性测试亦指出安卓健对多数的癌细胞（脑癌、淋巴癌、血癌、肺腺癌、乳癌、肝癌、胰脏癌、胃癌、直肠癌、前列腺癌与膀胱癌等) 都有药用效果。
上海佳辰投资发展有限公司联合上海张江转化医学研发中心研发K-ras基因突变检测，详细如下：
检测内容：K-ras基因突变
检测方法：ARMS法
主要材料：ABI荧光定量试剂盒
主要设备：ABI 7500荧光定量PCR仪
检测项目和样本类型：
基因检测流程：送检单填写→收集样本→集中送检→拿取报告。