氨基酸的薄层层析
氨基酸的薄层层析
氨基酸的薄层层析[原理 ]氨基酸薄层层析属于吸附层析，主要根据各种氨基酸在吸附剂表面的吸附能力不同进行分离或提纯的一种方法。
将硅胶（吸附剂—作为固定相的支持剂）均匀地铺在玻璃片上，并将氨基酸样品点于吸附剂上。
在密闭容器中，由于吸附剂的毛细管作用使展开剂上行将样品展开。
被分离的氨基酸因结构不同，在吸附剂上的吸附亲和力也不同。
吸附力大的就容易被吸附剂吸附，而较难被溶剂所冲洗（即解吸）；吸附力小的就容易被溶剂携带至较远的距离。
氨基酸在吸附剂和展开剂之间反复多次的进行吸附和解吸附，从而使不同的氨基酸达到分离的目的。
[试剂 ]（一）硅胶G（二） 0.2%羧甲基纤维素钠称取羧甲基纤维素钠1g 溶于蒸馏水100 ml中，在沸水浴中煮沸至无气泡，冷却，置冰箱储存，临用前稀释至0.2%。
（二）氨基酸溶液制备下列各氨基酸的异丙醇（90%）溶液各10ml。
1． 0.01mol/L 精氨酸精氨酸15.9mg溶于90%异丙醇10ml中。
2． 0.01mol/L甘氨酸甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇10ml中。
3． 0.01mol/L酪氨酸酪氨酸18.1mg溶于90%异丙醇10ml中。
将上述溶液各取出1ml ，混合均匀作为氨基酸混合溶液。
（三）展开剂按4：1：1体积比例混合正丁醇，冰乙酸及水。
临用时配置。
（四） 0.5%茚三酮丙酮溶液茚三酮0.5g溶于无水丙酮100ml 中。
[ 主要器材 ]（一）玻璃板（4× 10cm）（二）层析缸。
（三）喷雾器。
（四）长颈漏斗。
（五）玻璃毛细管。
（六）恒温干燥箱。
[ 操作步骤 ]（一）薄板的制备1．称取硅胶G 0.5g 放入研钵中，加 1.5ml0.2% 羧甲基纤维素钠，研磨成均匀的稀糊状。
2．将上述糊状物倾倒在4× 10cm 的玻璃片（图11）上，使之均匀地布满于玻片，将玻片轻轻地晃动，使硅胶 G 均匀分布，表面平坦，光滑，无水层及气泡，然后水平放置在空气中使其自然干燥。
氨基酸的薄层层析(TLC)
氨基酸的薄层层析（TLC）【实验原理】聚酰胺薄膜层析是60年代以后发展起来的一种新的层析方法，特别适用于氨基酸及其衍生物的分析。
具有灵敏度高、分辨率强、操作方便快捷等特点。
聚酰胺是一类化学纤维素原料，即锦纶（尼龙）。
由乙二酸和乙二胺聚合而成的，称锦纶66。
由于分子中含有大量的酰胺基团，故称聚酰胺。
聚酰胺薄膜是在涤纶片基上涂上一层锦纶制成的。
聚酰胺对许多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的-C=O和 -NH- 能与被分离物质的一定基团形成H键。
如酚类（黄酮类、鞣质）和酸类（氨基酸、核苷酸）能以其羟基与酰胺键的羰基形成H键。
在层析过程中，当样品随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于聚酰胺与各极性分子产生H键吸附能力的强弱不同，从而可将样品中各成分分离。
物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在滤纸上的移动速率，用Rf来表示。
在一定条件下，每个物质都有特定的Rf值，因此，用Rf可鉴定不同的物质。
无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外照射）或显色法鉴定。
氨基酸层析图谱常用茚三酮作显色剂。
本实验利用单向上行层析法鉴定氨基酸。
【实验试剂和器材】(一) 试剂1. 氨基酸标准液(10mg/ml)：三种氨基酸是赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸，分别配成上述浓度的溶液。
2. 氨基酸混合液（每种氨基酸5mg/ml）3. 展层剂：正丁醇：12％氨水：95％乙醇＝13: 3: 3（V/ V）4. 0.1%茚三酮－正丁醇液。
(二) 器材聚酰胺薄膜，毛细管，层析装置，电吹风机，喷雾器，塑料手套等。
【实验方法】(一) 薄膜的剪裁取薄膜（7cm×10cm）一张，在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一直线，在此直线上每隔1厘米作一记号为点样处（外侧两点距边缘2c m）。
(二) 点样氨基酸的点样量以5ul为宜。
点样时，用毛细管吸取氨基酸样品，与薄膜垂直方向轻轻碰点样处，每点在纸上扩散的直径最大不超过2mm。
点样过程中，必须在第一点样品干后再点第二滴。
氨基酸的分离原理
氨基酸的分离原理
氨基酸的分离原理主要是基于它们在不同条件下的溶解性、酸碱性和极性的差异。
以下是常用的氨基酸分离方法：
1. 薄层层析法：将氨基酸溶液均匀涂布在薄层层析板上，通过上机进行高效层析分离。
根据氨基酸在固定相和流动相中的相互作用力的不同，氨基酸在薄层上的迁移距离也不同，从而实现分离。
2. 离子交换色谱法：利用带电的树脂固定相对氨基酸进行分离。
树脂可以选择正离子交换树脂或阴离子交换树脂，根据氨基酸的酸碱性质进行选择。
溶液中的氨基酸通过与固定相发生离子交换，从而实现分离。
3. 气相色谱法：利用气相色谱仪将氨基酸蒸发后送入色谱柱进行分离。
根据氨基酸在固定相和载气中的分配系数不同，氨基酸在色谱柱中的保留时间也不同，从而实现分离。
4. 高效液相色谱法：利用高效液相色谱仪将氨基酸在流动相中进行分离。
根据氨基酸与固定相之间的亲疏水性差异，通过调节流动相组成及流速，实现氨基酸的分离。
综上所述，氨基酸的分离原理主要是利用它们在不同条件下的物理化学性质的差异，通过各种色谱方法实现分离。
氨基酸的薄层层析_实验报告
氨基酸的薄层层析_实验报告实验目的：掌握薄层层析法的基本原理和实验操作技巧，了解氨基酸在薄层层析中的分离和检测方法。
实验原理：薄层层析法是以薄层硅胶或薄层纸片为固定相，利用液相作为移动相的一种物理分离技术。
氨基酸薄层层析法主要是将混合的氨基酸样品在薄层硅胶或薄层纸片上沿着其表面作为移动相的有机溶剂慢慢地溶解，不同的氨基酸成分会因吸附在薄层硅胶或薄层纸上的程度不同而在其中分离。
不同的氨基酸在薄层层析图谱上的Rf（相对移动率）值不同，是区分不同氨基酸的一种物理性质。
Rf值的计算公式为：Rf=色谱前行距离÷色谱柱高度。
实验操作：1、制备薄层层析板。
将硅胶胶涂在薄层层析板上，晾干后烘箱烘干。
2、制备样品。
将6种不同氨基酸分别以氨基酸质量浓度相等的方式混合制成样品，并分别标记。
3、将样品分别滴在薄层层析板上，注意每滴之间需使它们相距一定的距离，并在板子内侧写上标记。
4、放入有机溶剂。
将有机溶剂铺在盛有一点水的薄层层析槽中，使得铺上的有机溶剂厚度大约为硅胶层的三分之一。
5、将涂有样品的薄层层析板放在槽中，让它与槽中的有机溶剂接触，但不要使样品浸泡在有机溶剂中。
6、密闭容器，放置在不受光照的地方，等待样品进行分离。
7、取出薄层层析板，把它们晾干并用紫外灯照亮，用标尺测出不同色序分离的距离并计算它们的Rf值。
实验结果：对应不同氨基酸的Rf值，可以得出该试验的结果。
结果应与理论值相近，判断是否失真并计算误差。
氨基酸的薄层层析法是一种快速、简便的分离和检测氨基酸的方法，适用于从实验中得到定性和定量信息。
由于薄层层析板具有良好的重现性和灵敏度，它在生物化学和分析化学领域得到了广泛的应用。
氨基酸的薄层层析
实验4 氨基酸的薄层层析一、实验原理薄层层析是一种将固定相在固体上铺成薄层进行层析的方法。
由于该方法具有操作简便、层析展开时间短、灵敏度高、结果可视化等优点，已被广泛应用于生物化学、医药卫生、化学工业、农业生产和食品等领域，对天然化合物的分离和鉴定也已广泛应用。
薄层层析时一般将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。
当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。
即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开。
本实验应用硅胶作为固相支持物，用羧甲基纤维素钠作为粘合剂，以正丁醇、冰醋酸及水的混合液为展开剂，测定混合氨基酸中各分离斑点的R f值（R f值详见第一篇第三章第五节），以分离和鉴别混合氨基酸的成分。
氨基酸的显色反应：茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸发生羧基反应生成还原茚三酮、氨基醛，与此同时，还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成蓝色化合物而使氨基酸斑点显色。
二、实验材料（一）样品1．氨基酸标准溶液：（1）0.01mol/L丙氨酸：称取丙氨酸8.9mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。
（2）0.01mol/L精氨酸：称取精氨酸17.4mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。
（3）0.01mol/L甘氨酸：称取甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。
2．混合氨基酸溶液：将0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等体积制成混合溶液。
（二）试剂1．硅胶G(C.P.)2．0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）：取羧甲基纤维素钠5g溶于1000ml蒸馏水中，煮沸，静置冷却，弃沉淀，取上清备用。
3．展开溶剂：按80:10:10比例（V/V）混合正丁醇、冰醋酸及蒸馏水，临用前配制。
4．0.1%茚三酮溶液：取茚三酮（A.R.）0.1g溶于无水丙酮（A.R.）至100ml。
氨基酸的薄层层析
氨基酸的薄层层析[原理]氨基酸薄层层析属于吸附层析，主要根据各种氨基酸在吸附剂表面的吸附能力不同进行分离或提纯的一种方法。
将硅胶（吸附剂—作为固定相的支持剂）均匀地铺在玻璃片上，并将氨基酸样品点于吸附剂上。
在密闭容器中，由于吸附剂的毛细管作用使展开剂上行将样品展开。
被分离的氨基酸因结构不同，在吸附剂上的吸附亲和力也不同。
吸附力大的就容易被吸附剂吸附，而较难被溶剂所冲洗（即解吸）；吸附力小的就容易被溶剂携带至较远的距离。
氨基酸在吸附剂和展开剂之间反复多次的进行吸附和解吸附，从而使不同的氨基酸达到分离的目的。
[试剂]（一）硅胶G（二）0.2%羧甲基纤维素钠称取羧甲基纤维素钠1g溶于蒸馏水100 ml中，在沸水浴中煮沸至无气泡，冷却，置冰箱储存，临用前稀释至0.2%。
（二）氨基酸溶液制备下列各氨基酸的异丙醇（90%）溶液各10ml。
1．0.01mol/L精氨酸精氨酸15.9mg溶于90%异丙醇10ml中。
2．0.01mol/L甘氨酸甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇10ml中。
3．0.01mol/L酪氨酸酪氨酸18.1mg溶于90%异丙醇10ml中。
将上述溶液各取出1ml，混合均匀作为氨基酸混合溶液。
（三）展开剂按4：1：1体积比例混合正丁醇，冰乙酸及水。
临用时配置。
（四）0.5%茚三酮丙酮溶液茚三酮0.5g溶于无水丙酮100ml中。
[主要器材]（一）玻璃板（4×10cm）（二）层析缸。
（三）喷雾器。
（四）长颈漏斗。
（五）玻璃毛细管。
（六）恒温干燥箱。
[操作步骤]（一）薄板的制备1．称取硅胶G 0.5g放入研钵中，加1.5ml0.2%羧甲基纤维素钠，研磨成均匀的稀糊状。
2．将上述糊状物倾倒在4×10cm的玻璃片（图11）上，使之均匀地布满于玻片，将玻片轻轻地晃动，使硅胶G均匀分布，表面平坦，光滑，无水层及气泡，然后水平放置在空气中使其自然干燥。
1．薄板上硅胶干后，放入105℃的恒温干燥箱内活化，半小时后取出，晾凉备用。
试验一 氨基酸的分离鉴定——薄层层析法
试验一氨基酸的分离鉴定——薄层层析法注：每组带一个小格尺，一支铅笔一、实验目的1、掌握分配层析的原理2、学习氨基酸薄板层析的操作方法二、实验原理薄层层析（thin layer chromatography ）又称薄层色谱，是将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板上，形成薄层后，在此薄层上进行层析分离的分析方法。
例如：以纤维素作为支持物，将其均匀的涂布在玻璃板上成一薄层，然后在此薄层上进行层析，即纤维素薄层层析。
纤维素是一种惰性支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。
层析时吸着在纤维素上的水是固定相，有机溶剂是流动相，当被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，即可被分开。
三、实验材料和仪器1、实验材料：绿豆芽、黄豆芽或萌发小麦种子2、主要仪器：玻璃板5cm×15cm；层析缸；毛细管；喷雾器；研钵；吸管5mL；洗耳球；量筒10mL（或25 mL）；10mL塑料离心管；电吹风或烘干箱；电子天平；离心机四、实验试剂1、硅胶板2、层析溶剂系统：正丁醇（分析纯）：冰醋酸（分析纯）：水＝4：1：1（V/V）。
上述溶剂需在临用时配制。
每组配25~30mL。
层析缸内平衡几分钟。
3、显色剂：0.1％茚三酮－丙酮溶液。
4、若干种氨基酸混合标准液：天冬、亮、苯丙、脯氨酸等各取5mg，溶于1mL 0.01mol/L 盐酸溶液中，每种氨基酸浓度为5mg/mL。
五、实验步骤1、氨基酸的提取：取已萌发好的小麦种子2g左右（或绿豆芽下胚轴2g），放入研钵中，加入95％乙醇4mL及少量的石英砂，研成匀浆后，倒入离心管中3000r.min-1离心15min，上清液为氨基酸提取液，用滴管小心吸入点样瓶备用。
2、点样：用刀片将薄层板上薄层的左右两边各让出0.5cm，防止边缘效应。
在纤维素薄板上距一端1.5cm处，用铅笔轻轻划出点样记号。
点样间距合适（1.3cm左右）。
用毛细管吸取样品，在记号处点样，即分次滴加在薄板原点处，样品斑点直径控制在2mm左右。
氨基酸的薄层层析实验报告
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman ；标题用：四号，黑体，加粗。
需强调的地方请用蓝颜色标出。
不得出现多行、多页空白现象。
一、实验目的1、掌握薄层层析法的一般原理。
2、掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。
3、掌握如何根据移动速率（Rf 值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。
二、实验原理1、薄层层析原理：将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。
液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不同，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不同，因此，不同的氨基酸样品在固定相上的移动速度也不同，可以彼此分离，以此分离鉴别不同氨基酸。
2、氨基酸显色反应原理：茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。
三、材料与方法：以流程图示意Rf 值= 原点到层析斑点中心的距离 原点到溶剂前沿的距离1、材料：层析板、尺子、铅笔、烧杯、玻璃棒、量筒、毛细管、层析缸、药匙、烘箱、氨基酸标准溶液（0.01mol/L丙氨酸、0.01mol/L精氨酸、0.01mol/L甘氨酸）、混合氨基酸溶液、0.5%的羧甲基纤维素钠、硅胶、展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液）2表格 1 氨基酸的薄层层析实验步骤四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。
1、结果：①实验数据：表格 2 制作层析板的试剂及用量表格 3 各氨基酸色斑中心至样品原点中心距离及展层剂前沿至样品原点中心距离记录表格 4 结果记录 ② 现象：图一制板图二层析图三显色（从左到右分别为丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、混合氨基酸）表格 5 实验现象2、讨论：①由表格4可知，混合点1Rf值与精氨酸相近，混合点2Rf值与甘氨酸相近，混合点3Rf值与丙氨酸相近。
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生物化学实验报告
姓名：
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生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称氨基酸的薄层层析
实验日期2018-11-7 实验地点
合作者指导老师
评分教师签名批改日期
一、实验目的
1、掌握薄层层析法的一般原理。
2、掌握氨基酸薄层层析法的制版、点样、层析和显色等基本操作技术。
3、掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即本次实验中氨基酸混合液）。
二、实验原理
1、薄层层析原理（色谱分析技术的一种）：
一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。
当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。
（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）
2、氨基酸与茚三酮的显色反应：
茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。
3、以相对迁移率-Rf值来判定氨基酸的种类：
层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。
Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到对应斑点前沿的距离
由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。
三、材料与方法：
1、实验材料：
（1）实验试剂：氨基酸的异丙醇溶液：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸
分析样品：混合氨基酸溶液
吸附剂：硅胶
粘合剂：0.5%的羧甲基纤维素钠
展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液）
（2）实验器材：天平、层析板、尺子、铅笔、烧杯、玻璃棒、量筒、毛细玻璃管、层析缸、药匙、烘箱
2、实验方法：
（1）实验流程：
（
2）实验步骤：
步骤操作
①制作硅胶层析板1、调浆称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫
升，调成均匀的糊状。
2、涂布取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。
3、干燥将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。
4、活化70℃烘干30分钟。
切断电源，待玻璃板面温度
下降至不烫手时取出。
②在层析板上加氨基酸样品1、标记：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点。
每个样品间相距约1cm。
2、取样：用毛细管分别吸取氨基酸溶液，取样量为毛细
管柱高5cm。
3、点样：点样毛细管轻轻接触薄层表面点样。
加样后原
点扩散直径不超过2mm。
③对氨基酸样品层析将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低
于点样线。
盖好层析缸盖，上行展层。
当展层剂前沿离薄
板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂
前沿界线
④对氨基酸样品显色用热风吹干或在85℃下烘干，即可显出各层斑点。
3、注意事项：①吸附剂：薄层层析用的吸附剂硅胶的颗粒大小一般以通过200目左右
筛孔为宜
②点样：次数依照样品的溶液浓度而定，样品量太少有的成分不易显示；
样品量太多易造成斑点过大，相互交叉或拖尾。
③避免污染，切勿用手直接接触薄层板面，必要时戴上手套。
四、结果与讨论：
1、实验现象：
（1）制作层析板时，硅胶粉末加入羧甲基纤维素钠的乳酸后搅拌变为淡白色糊状。
（2）层析缸中的展层-显色剂无色透明但具有强烈刺激性气味，将薄层板置入其中氨基酸无显色。
（3）烘干后的层析板可见深浅不一的斑点精氨酸较深，丙氨酸次之，甘氨酸最浅。
氨基酸混合液中出现了3个斑点。
2、图片展示：
3、数据记录：
从点样线到溶剂前沿线之间的距离为6.90cm
公式：Rf =原点到层析斑点中心的距离/原点到对应斑点前沿的距离
样品
斑点-原点 溶剂前缘-原点 Rf 值 Arg
0.50 6.30 0.08 Gly
1.80 5.10 0.35 Ala
2.70 4.20 0.64 混合点1
混合点2
混合点3 0.40 1.90 2.70 6.50 5.10 4.30 0.06 0.37 0.63
物质在一定的溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率也是恒定的，因此可根据Rf 值来鉴定被分离的物质。
混合氨基酸溶液的混合点1、2、3与丙氨酸、精氨酸和甘氨酸显点样线
溶剂前沿界线 2.70cm 4.20cm 0.5.cm
6.30cm 1.80cm
5.10cm
色反应所出现的位置及Rf值均相似，因此混合氨基酸的成分可能为丙氨酸、精氨酸和甘氨酸的混合物，本次实验结果有效。
6、误差分析：
（1）薄层板的平整度及硅胶分布的均匀程度均会影响实际试验结果。
（2）每个人测量时所取的中心点不同，测量的距离也会有所不同进而影响到实验结果。
（3）层析时间、点样的量以及用手直接接触薄层板面也会影响到结果。
7、思考题：
（1）硅胶的吸附力与含水量的问题：硅胶属于极性吸附剂含水量过多会导致单位体积硅胶颗粒的减少，从而降低硅胶的吸附力。
硅胶的吸附力与含水量呈负相关，含水量越高，活度级数越高。
（2）实验中吸附剂的选择依据：
依据被吸附的吸附质和实验温度。
如果被测成分极性大应选择吸附性较弱的吸附质，若具有亲脂性则选择吸附性强的吸附质。
（3）氨基酸纸层析，两者的区别：
层纸析不用铺板，固定相是水，吸附性较弱，展开剂的极性较强；薄层层析要用硅胶做层析板，固定相是硅胶，吸附性较纸层析强，展开剂的极性一般。