枯草芽孢杆菌的发酵培养基优化研究
枯草芽孢杆菌产蛋白酶的发酵培养基优化
在 国 内外 蛋 白酶研 究 领域 中 ，在 不 同发 酵 工艺 下 ， 同菌株 或 同一菌 株 的酶 活也 有 较大 的差 异 ， 不 酶 活 的高低 直接 影 响着 酶的应 用效 果 。 因此 ， 高 蛋 白 提 酶酶 活 的研究 是很 有 必要 的 ， 近几 年 ， 内对 提高 最 国 蛋 白酶酶 活 的研究 有 了较 大进 展 ， 卓林 霞 等 艮 的 道 枯 草 芽孢 杆菌 ， 发酵 酶活 力可 达 ６ ８ ／ ； 继 平等 其 ４ Ｕｇ 郭
方 进 行优 化 ， 定 了影 响 Ｂ 一 确 ＤＴ ３菌株 发 酵 液 含 菌 量 的 ３个 重要 因 子依 次 为 玉米 粉 、 白胨 和 淀粉 ； 这 ３个 因子 进 蛋 对 行 爬 坡路 径 试 验 ， 过 响 应 面 分 析 法 确 定 了主要 影 响 因 子 的 最佳 条 件 。优 化 后 的 发 酵 液 酶 活 力 为 ５．Ｏ ｍＬ 相 比 通 ５ Ｕ／ ， ９ 采 用 初 始 发 酵 培 养基 提 高 了 １．９ １ ％。 ４ 关 键 词 ： 草 芽孢 杆 菌 ； 酵培 养基 ； 应 面 法 ； 白酶 枯 发 响 蛋 中图分类号 ： ９９ ７ Ｑ ３． ９ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：６４ ５ ６ ２ １ ）４ ０ ７ — ０ ５ １７ — ０ Ｘ（０ １Ｏ — ０ ７ ０ ０
Ｔ ｃ ｎ ｌｇ ，Ｗｕ ａ ３ ０ ８ Ｃ ｉａ ｅ ｈ ｏｏ ｙ ｈ ｎ ４ ０ ６ ， ｈｎ ）
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｐ ａ ｋ ｔ— ｒ ｎ ｄ ｓｇ ｎ ｅ ｐ ｎ ｅ ｓ ｒ ｃ ｎ ｌ ｓｓ ｗｅ ｅ ｓ ｄ ｏ ｐ ｉ ｚ ｈ ｅ ｍｅ ｔｔ ｎ ｍｅ ｉ ｍ ｆ ｓｒ ｃ ： ｌｅ ｅ ｔ Ｂｕ ｍａ ｅ ｉ ｎ ａ ｄ ｒ ｓ ｏ ｓ ｕ ｆ ｅ ａ ａ ｙ ｉ ａ ｒ ｕ ｅ ｔ ｏ ｔ ｍｉｅ ｔ ｅ ｆ ｒ ｎ ａ ｉ ｄ ｕ ｏ ｏ Ｂａ ｉ ｕ ｕ ｔ ｉ Ｂ ｃ ｌ ｓ ｓ ｂ ｉ ｓ ＤＴ－ ．Ｂ ｓ ｄ ｏ ｈ ｅ ｕ ｔ ｏ ｌｃ ｅｔ Ｂ ｒ ｎ ｄ ｓｇ ， ｏ ｔ ｎ ａ ｔ ｒ ｆｅ ｔ ｇ ｔ ｅ ｙｅ ｄ ｏ ａ ｉ ｕ ｌ ｌ ３ ａ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｓ ｌ ｆＰ ａ ｋ ｔ－ ｕ ｍａ ｅ ｉｎ ｉ ｓ ｍｐ ｒ ｔｆｃ ｏ ｓ ａｆｃ ｉ ｈ ｉｌ ｆＢ ｃ ｌ ｓ ａ ｎ ｌ ｓ ｂｉｓ ｕ ｔｉ ｌ ＢＤ － ｗ ｒ Ｏ Ｉ ｌ ｕ ， ｅ ｔ ｎ ， ｓ ｒ ｈ Ｔ ｅ ， ｅ ｈ ｅ ｆ ｃｏ ｓ ｗｅ ｅ ｕ ｔ ｅ ｐ ｉ ｚ ｄ ｓｎ ｒ ｓ ｏ ｓ ｓ ｒａ ｅ Ｔ ３ ｅ ｅ Ｃ Ｉｌ ｏ ｒ ｐ ｏ ｅ ｔ ｃ ． ｈ ｎ ｔ ｔ ｒ ｅ ａ ｔｒ ｒ ｆ ｒ ｒ ｏ ｔ ｆ ｐ ａ ｈ ｈ ｍｉ ｕ ｉ ｇ ｅ ｐ ｎ ｅ ｕ ｆ ｃ ｅ ａ ａｙ ｉ． ｈ ｈ ｅ ａ ｔｒ ｅ ｅ ｆ ｒｈ ｒｏ ｔ ｚ ｄ ｕ ｉ ｇ ｒ ｓ ｏ ｓ ｕ ｆｃ ｎ ｌｓｓ Ｔ ｅ ｅ ｚ ｍｅ ａ ｔ ｉ ｆ ｒｏ ｔｍｉａｉｎ ｆｒ ｎ ｌｓｓ ｔ ｅ ｔ ｒｅ ｆ ｃｏ ｓ ｗ ｒ ｕ ｅ ｐ ｉ ｅ ｓｎ ｅ ｐ ｎ ｅ ｓ ｒ ｅ ａ ａｙ ｉ． ｈ ｎ ｙ ｃｉ ｔ ａ ｔ ｐ ｉ ｚ ｔ ｏ ｔ ｍｉ ａ ｖｙ ｅ ｏ ５ ．０ ／ ， ｉ ｈ ｗａ ． ９ ｈ ｇ ｅ ａ ｎｔ ｌｍｅ ｉ ｍ． ５ ９ Ｕ ｍＬ ｗｈ ｃ ｓ １ ４ ％ ｉ ｈ ｒｔ ｎ ｉ ｉ ａ ｄ ｕ １ ｈ ｉ
饲用枯草芽孢杆菌发酵条件的优化
０ １ 大豆 粕 １ 淀 粉 ０３ ３０ ％浓 度 的硫 酸锰 ． ％、 ０ ％、 ．％、．８
７５ ７８ ８ ，在接 种 量 ５ ，温 度 ３ ℃ ，转 速 ２ ０ ．、 ．、 ． ０ ％ ０ ２
１ 材 料 与 方 法
１１ 材 ． 料
供 试 菌种 为枯 草 芽孢 杆菌 ， 由湖南
ｒ ｎ条 件下 培养 ２ ， 定其 Ｄ 鲫 值 。 ３转 速对 ／ ｍｉ ４ｈ 测 Ｄ （）
生长 量 的影 响 ： 取 １０ ２ ０ ２ ０ ２ ０ ３ ０ｒ ｉ 选 ５ 、０ 、２ 、５ 、０ ｍ ｎ５ ／
的优化培养基为 ： 葡萄糖 Ｏ５ 淀粉 ０３ 豆粕 ３ 磷酸氢二钾 ０３ 磷酸二氢钾 ０１％、 ．％、 ．％、 ％、 ．％、 ．５ 硫酸镁 ００ ％、 ． ５ 酵母膏 ００ ％、 ．２ 氯化铁 ０ １ 碳酸钙 Ｏ０ ％、．８ ． ％、 ０ ．１ ３０ ％硫酸锰 ０２ｍ 。最适 发酵条件为： ． Ｌ 发酵 温度 ３ ℃， Ｏ 初始 ｐ ．～ ．， Ｈ ７０ ７２ 摇床转速 ２ ０ｒ ｉ ， ２ ｍ ｎ 接种量 １ ％。 ／ ０ 发酵罐放大培养最佳放罐时间 ２ — ２ｈ 获得的菌体数量 约为 １８亿／ 。 ０ ２ ， ５ ｍＬ
７２基 础 发酵 培养 基 ： ．； 淀粉 ０１％、 ．５ 葡萄 糖 ０５ 尿 ． ％、 素 ０１ 磷 酸 氢二 钾 ０３ 磷 酸 二 氢钾 ０１％、 ． ％、 ．％、 ． ５ 硫
酸 镁 ００ ％ 、 母 膏 ００ ％、 化 铁 ００ ％、 酸 钙 ． ５ 酵 ．２ 氯 ．１ 碳
养 ２ ， ４ｈ测定其 Ｏ 鲫值。（ ） Ｄ ４ 接种量对生长量 的影 响 ：选 取 接 种 量 １ 、 ％ 、％ 、％ 、０ 、５ ， ％ ３ ５ ７ １ ％ １ ％ 在 ３ ℃ ， 始 ｐ ．， 速 ２０ｒａｎ条 件 培 养 ２ ， Ｏ 初 Ｈ ７２ 转 ２ ／ ｉ ｒ ４ｈ
枯草芽孢杆菌发酵制备花生饼粕、花生茎叶混合饲料条件优化研究
辽宁农业科学㊀2021(3):49~53Liaoning Agricultural Sciences文章编号:1002-1728(2021)03-0049-05㊀㊀㊀㊀㊀㊀doi:10.3969/j.issn.1002-1728.2021.03.011枯草芽孢杆菌发酵制备花生饼粕㊁花生茎叶混合饲料条件优化研究∗迟吉捷,石太渊(辽宁省农业科学院食品与加工研究所,辽宁沈阳㊀110161)摘要:以花生饼粕㊁花生茎叶混合饲料为原料,筛选最佳枯草芽孢杆菌培养条件为目标,研究料液比㊁接种量㊁发酵温度㊁发酵时间等因素对枯草芽孢杆菌培养的影响㊂结果表明,最优培养条件:加水量(料液比) 1ʒ0.83㊁培养时间62h㊁接菌量0.78g㊁培养温度30ħ,在该条件下所得枯草芽孢杆菌芽孢数为(195.222ʃ0.003)㊂关键词:花生饼粕;花生茎叶;枯草芽孢杆菌;芽孢数中图分类号:S816.46;TS201.3文献标识码:B㊀㊀花生是我国主要的油料作物,国家统计局信息显示2019年我国花生年产量约1750万t,居世界首位,花生在油料产业具有重要的地位㊂花生富含油脂㊁蛋白㊁维生素及多种矿物质,营养全面,具有保护心脑血管㊁降脂㊁降糖㊁抗癌㊁抗衰老等保健作用㊂近几年,我国花生用于食品加工的比例在逐年提升,已接近年产量的50%㊂目前,我国花生仍以榨油为主,花生种植㊁加工过程中会产生大量的花生粕㊁花生红衣㊁花生壳㊁根茎等副产物,其中花生饼粕850万t/年㊁花生茎叶1800万t/年以上,这些副产物中富含酚类㊁蛋白质㊁糖类等营养成分,但目前利用率却较低㊂对这些副产物进行综合利用及精深加工,不仅可以延长产业链,提高花生的经济价值,还可以减少资源浪费,避免因副产物废弃而造成环境污染[1~3]㊂花生饼粕的营养价值比较高其代谢能量是所有饼粕类饲料中最高的,粗蛋白质含量接近大豆粕,高达45%以上,粗纤维7%左右㊂精氨酸含量高达5.2%,是所有动㊁植物饲料中最高的㊂赖氨酸含量只有大豆饼粕的50%左右,蛋氨酸㊁赖氨酸㊁苏氨酸含量都较低㊂通过添加合成氨基酸或是添加其他的蛋白质饲料而使氨基酸得到平衡,畜禽的生长性能也可达到理想水平[4~6]㊂花生茎叶中营养物质丰富,花生茎叶中含有12.9%粗蛋白质㊁2%粗脂肪㊁46.8%碳水化合物,其中花生叶的粗蛋白质含量高达20%㊂花生秧中的粗蛋白质含量是豌豆秧的1.6倍㊁稻草的6倍,畜禽采食1kg花生秧产生的能量相当于0.6kg 大麦所产生的能量㊂花生饼粕以及花生茎叶很容易感染黄曲霉菌而产生黄曲霉毒素㊂黄曲霉毒素种类较多,其中毒性最大的是黄曲霉毒素B1㊂蒸煮㊁干热对去除黄曲霉毒素无效,因此,对花生粕中黄曲霉毒素含量应进行严格的检测,国家卫生标准规定黄曲酶毒素的允许量需低于0.05mg/kg㊂黄曲霉菌毒素易使猪的肝脏受到损害㊂少量的黄曲霉毒素就可对猪的生长性能产生显著的影响㊂花生饼粕和花生茎叶中的黄曲霉毒素及蛋白质组分的不理想,在复合饲料中添加量一般在10%左右,限制了饲料中的高效利用㊂因此,提高花生粕和花生茎叶的质量安全和品质,才能饲料行业中充分利用㊂目前,在豆粕饲料中利用枯草芽孢杆菌研究营养和安全方面研究很多,但对花生粕㊁花生茎叶的相关研究较少[7~9]㊂本研究以花生饼粕和花生茎叶为原料,采用固态发酵法,研究了枯草芽孢杆菌对花生粕和花生茎叶的发酵条件,得到最佳工艺,这对花生饼粕和花生茎叶在饲料行业中进一步利用提供理论数据㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料与设备1.1.1㊀材料㊀枯草芽孢杆菌1389中国农业微生物菌种保藏中心提供;热榨花生饼粕和花生茎叶市场购买㊂1.1.2㊀培养基㊀枯草芽孢杆菌斜面培养基:蛋白胨10g/L,牛肉膏3g/L,NaC15g/L,琼脂2g/L,pH值7.0;∗收稿日期:2020-08-11作者简介:迟吉捷(1980-),男,助理研究员,主要从事食品营养与质量安全工作㊂通讯作者:石太渊(1965-),男,研究员,从事食品营养与质量安全工作㊂辽宁农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀2021年枯草芽孢杆菌液体活化培养基:蛋白胨10g/L,牛肉膏3g/L,NaC15g/L,pH值7.0;枯草芽孢杆菌芽孢平板计数培养基:酵母浸粉2.5g/L蛋白胨5g/L,葡萄糖1.0g/L,琼脂1.5g/L,pH 值7.0㊂固体培养基:用植物粉碎机粉碎花生粕和花生茎叶,颗粒大小为120目㊂按每250ml培养瓶中加入25g固体(20g花生饼粕+5g花生茎叶)㊂以上培养基均121ħ下灭菌20min备用㊂1.2㊀试验方法1.2.1㊀固态发酵工艺流程㊀花生饼粕粉+花生茎叶粉ң灭菌ң冷却ң接菌ң发酵ң烘干ң平板培养ң芽孢数量ң最佳发酵条件㊂1.2.2㊀芽孢培养计数方法㊀取0.5g发酵物干燥产品加入到4.5ml无菌水中,在80ħ恒温水浴中,经10min灭枯草芽孢杆菌后3000r/min,离心10min,上清液稀释106倍,取200μl菌液涂板培养15h后检测枯草芽孢杆菌芽孢数㊂1.2.3㊀单因素试验设计㊀调查以不同的料液比㊁接种量㊁发酵温度㊁发酵时间和花生茎叶量为因素对枯草芽孢杆菌芽孢数目的影响㊂1.2.3.1㊀料液比对枯草芽孢杆菌芽孢数的影响㊀取20g花生饼粕和5g花生茎叶,加2g菌样,发酵温度为30ħ,发酵时间为72h,每隔12h搅拌1次,分别加15㊁20㊁25㊁30㊁35ml,料液比分别为1ʒ0.56,1ʒ0.74,1ʒ0.92,1ʒ1.11,1ʒ1.30测定样品的芽孢数㊂1.2.3.2㊀接菌量对枯草芽孢杆菌芽孢数的影响㊀取20g花生饼粕和5g花生茎叶,发酵温度为30ħ,发酵时间为72h,每隔12h搅拌1次,加25ml水,分别接种0.25g(接菌量为0.50%)㊁0.50g(接菌量为1.0%)㊁1.00g(接菌量为2.0%)㊁1.5g(接菌量为3.0%)㊁2.0g (接菌量为4.0%)㊁2.5g(接菌量5.0%)(枯草芽孢杆菌芽孢数为1.2ˑ108个/g)菌量,测定样品的芽孢数㊂1.2.3.3㊀培养时间对枯草芽孢杆菌芽孢数的影响㊀取20g花生饼粕和5g花生茎叶,加0.5g菌样和25ml水,培养温度为30ħ,每隔12h搅拌1次,分别培养24㊁36㊁48㊁60㊁72㊁84h枯草芽孢杆菌,测定样品芽孢数㊂1.2.3.4㊀培养温度对枯草芽孢杆菌芽孢数的影响㊀取20g花生饼粕和5g花生茎叶,加0.5g菌样和25ml水,培养时间为72h,每隔12h搅拌1次,分别在24㊁26㊁28㊁30㊁32㊁34ħ下培养,测定样品的芽孢数㊂1.2.3.5㊀花生茎叶含量对枯草芽孢杆菌芽孢数的影响㊀取20g花生饼粕,加0.5g菌样和25ml水,培养时间为72h,培养温度为30ħ,每隔12h搅拌1次,分别加0㊁2.5㊁5.0㊁7.5㊁10g的花生茎叶粉,测定样品的芽孢数㊂1.2.4㊀响应面法试验设计㊀以单因素试验数据为依据,采用Box-Behnken试验设计方法,对料液比(A)㊁接种量(B)㊁培养温度(C)和培养时间(D)等4个因素,设计4因素3水平的试验方案[10~15]㊂2㊀结果与分析2.1㊀单因素试验2.1.1㊀料液比对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响㊀由图1中可以看出,料液比对花生饼粕中的枯草芽孢杆菌发酵有较大影响,料液比1ʒ0.92(加水量为25ml)时枯草芽孢杆菌芽孢数量最高(芽孢数118.6ˑ107个/g)㊂这很可能是因为枯草芽孢杆菌是好氧菌,料液比大时水中氧气含量偏低,满足不了枯草芽孢杆菌生长,导致枯草芽孢杆菌芽孢数量减少㊂相反,料液比小虽然可以满足枯草芽孢杆菌氧气需求,但营养物质浓度过小,也影响枯草芽孢杆菌生长㊂图1㊀料液比对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响Figure1㊀Influence of the ratio of feed to liquid on the spore quantity of Bacillus subtilis2.1.2㊀接菌量对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响㊀由图2可以看出,随着接菌量的增加,发酵后的花生饼粕混合料中的芽孢杆菌芽孢数量呈现先增后降的趋势,接菌量0.5g时产生的草芽孢杆菌芽孢数量最多,达到2.3ˑ107个/g,随着接菌量增大,反而抑制枯草芽孢杆菌的繁殖㊂图2㊀接菌量对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响Figure2㊀The influence of inoculation amount on the spore quantity of Bacillus subtilis2.1.3㊀枯草芽孢杆菌种培养时间对芽孢数量的影响㊀由图3看出,枯草芽孢杆菌种培养时间对芽孢杆菌芽孢繁殖有明显的影响,随着培养时间延长枯草芽孢杆菌芽孢数量呈现先增后降的趋势,培养时间在24~36h之间㊃05㊃第3期㊀㊀㊀㊀㊀迟吉捷等:枯草芽孢杆菌发酵制备花生饼粕㊁花生茎叶混合饲料条件优化研究时,枯草杆菌繁殖缓慢,芽孢数量也较少,随着培养时间的增长,枯草芽孢杆菌的繁殖速度明显提高,培养时间到72h时达到高峰,枯草杆菌芽孢数为4.53ˑ107个/g,芽孢杆菌进入衰亡期,芽孢数量明显下降㊂图3㊀接菌量对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响Figure3㊀The influence of temperature on the spore quantity of Bacillus subtilis2.1.4㊀发酵温度对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响㊀由图4可以看出,培养温度对枯草芽孢杆菌芽孢数量有明显的影响,随着培养温度升高枯草芽孢杆菌的繁殖先增后降的趋势,芽孢数目呈现先升高后培养温度在30ħ范围内时,枯草芽孢杆菌芽孢数量最高,达到枯草杆菌芽孢数为28.5ˑ107个/g㊂图4㊀温度对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响Figure4㊀The influence of temperature on the spore quantity of Bacillus subtilis2.1.5㊀花生茎叶含量对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响㊀由图5可以看出,花生茎叶含量对枯草芽孢杆菌繁殖有一定影响,但不明显㊂花生茎叶添加含量5g时枯草芽孢杆菌芽孢数量最多,达到0.42ˑ107个/g㊂这可能与不同的花生茎叶含量改变枯草芽孢杆菌生长环境有关㊂适合地添加花生茎叶改善了发酵花生饼粕的透气性和碳㊁氮含量,有利于芽孢杆菌生长,否则花生茎叶添加量过多或过少都不利于枯草芽孢杆菌繁殖㊂2.2㊀响应面法培养条件优化在花生饼粕以及茎叶的枯草芽孢杆菌培养单因素试验基础上,采用Box-Behnken组合设计,以枯草芽孢杆菌芽孢数为响应值,以加水量㊁培养时间㊁接菌量㊁培养温度为自变量因素,进行响应面试验,优化花生饼粕以及茎叶的枯草芽孢杆菌培养条件,试验设计和分析采用应用De-sign-Expert8.0.6数据分析软件,试验设计与结果见表2㊂图5㊀花生茎叶含量对枯草芽孢杆菌芽孢数量的影响Figure5㊀The influence of Stem and leaf content of pea-nut on the spore quantity of Bacillus subtilis表1㊀响应面分析因数与水平试验设计Table1㊀Response surface analysis factors and horizon-tal test design水平加水量培养时间(h)接菌量培养温度(ħ)-11ʒ0.74480.252801ʒ0.92600.503011ʒ1.1172 1.0032表2㊀响应面试验设计与结果Table2㊀Response surface test design and results试验序号X1X2X3X4芽孢数107个110-10412-10-10883001-151400-1-1795010-113960011149700001808-100114590-10-1391010011911-1010161120-1108413011014614010111915-1-1001381600001801710104318000017019000018620-100-1562100-117922100-1672300001792401-1010025-1100135261-10023270-10110228110082290-1-10104㊃15㊃辽宁农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀2021年㊀㊀枯草芽孢杆菌芽孢数所得回归方程为:Y =179.00-37.33X 1+19.25X 2+11.92X 3+15.17X 4+15.50X 1X 2-17.75X 1X 3-34.25X 1X 4+16.50X 2X 3-20.75X 2X 4+24.50X 3X 4-55.96X 12-29.33X 22-40.08X 32-50.21X 42由表3可看出, Prob>F 值小于0.01,表明回归方程极显著,而且各因数之问差异很显著,说明该试验方法是可靠有效的㊂模型R 2值为0.9730,失拟项P 值为0.0534大于0.05,说明回归方程拟合程度良好,试验误差小,可以利用该方程预测枯草芽孢杆菌芽孢数的理论数值㊂通过比较回归方程中的各因数显著性分析,可判断各因数的作用大小,枯草芽孢杆芽孢数影响的大小依次为加水量㊁培养时间㊁培养温度㊁接菌量㊂由图6可知,响应面曲线越陡,相互作用的因素对花生饼粕㊁花生茎叶混合饲料中培养枯草芽孢杆菌芽孢数的影响越显著,该结果与方差分析结果一致㊂通过回归方程可以得到最优的预测值,即加水量(料液比)1ʒ0.83㊁培养时间时间62.15h㊁接菌量0.78㊁培养温度30.76ħ,此条件下枯草芽孢杆菌芽孢数理论值195.225㊂结合实际工作,优化工艺参数,即加水量(料液比)1ʒ0.83㊁培养时间62h㊁接菌量0.78㊁培养温度30ħ,枯草芽孢杆菌芽孢数为195.222ʃ0.003,所得参数比较为可靠㊂表3㊀枯草芽孢杆菌芽孢数量回归方程方差分析Table 3㊀Variance analysis of the regression equation of Bacillus subtilis spore quantity方差来源偏差平方和自由度均方F 值P 值显著性模型72950.47145210.7536.010.0001∗∗X 116725.33116725.33115.570.0001∗∗X 24446.7514446.7530.730.0001∗∗X 31704.0811704.0811.780.0041∗∗X 42760.3312760.3319.070.0006∗∗X 1X 2961.001961.00 6.640.0219∗X 1X 31260.2511260.258.710.0105∗X 1X 44692.2514692.2532.42<0.0001∗∗X 2X 31089.0011089.007.520.0159∗X 2X 41722.2511722.2511.900.0039∗∗X 3X 42401.0012401.0016.590.0011∗∗X 1220311.36120311.36140.35<0.0001∗∗X 225581.2615581.2638.57<0.0001∗∗X 3210421.67110421.6772.01<0.0001∗∗X 4216351.63116351.63112.99<0.0001∗∗残差2026.0814144.72失拟项1894.0810189.41 5.740.0534不显著纯误差132.00433.00总偏差74976.5528R20.9730㊀㊀注:∗∗表示显著极差异(P <0.01);∗表示差异显著(P <0.05)㊀㊀Note:∗∗indicated significant extreme difference (P <0.01);∗indicated significant difference(P <0.05)图6㊀工艺参数对枯草芽孢杆菌芽孢数量影响的响应面Figure 6㊀Response surface diagram of the influence of process parameters on Bacillus subtilis spore㊃25㊃第3期㊀㊀㊀㊀㊀迟吉捷等:枯草芽孢杆菌发酵制备花生饼粕㊁花生茎叶混合饲料条件优化研究3㊀结论3.1㊀在单因素试验的基础上,结合响应面分析法优化了各参数,并确定了花生饼粕㊁花生茎叶混合饲料中培养枯草芽孢杆菌的最优培养条件:加水量(料液比)1ʒ0.83㊁培养时间时间62h㊁接菌量0.78g㊁培养温度30ħ,在该条件下所得枯草芽孢杆菌芽孢数为(195.222ʃ0.003)㊂3.2㊀实验结果表明,对培养枯草芽孢杆菌芽孢数影响的大小依次为加水量㊁培养时间㊁培养温度㊁接菌量㊂3.3㊀优化枯草芽孢杆菌在花生饼粕㊁花生茎叶混合饲料中培养工艺效果好,培养枯草芽孢杆菌芽孢数量较多㊂为以后的花生饼粕和花生茎叶的利用提供理论依据㊂参考文献:[1]㊀乔治林.中国花生产业布局的影响因素分析[J].农业经济,2016(2):55~56.[2]㊀孙杰,张初署,毕洁,等.枯草芽孢杆菌发酵制备花生粕饲料条件优化[J].核农学报,2014,28(1):101~107. [3]㊀石太渊,叶春苗,于淼,等.低温压榨花生饼粕中蛋白质提取功能性质研究[J].食品工业,2017,38(12):111~113. [4]㊀Allen L H.Priority areas for research on the positionand health effects of tree nuts and peanuts[J].Journal of Nutri-tion.2008,138(9):1763~1765.[5]㊀YU J,Ahmedna M,Goktepe I.Peanut protein concentrate:pro-duction and functional properties as affected processing[J].Food Chemistry,2007,103(1):1121~1129.[6]㊀梅娜,周文明,胡晓玉.花生粕营养成分分析[J].西北农业学报,2007,16(3):96~99.[7]㊀刘劲松,王刚,董超,等.开花生茎叶化学成分研究[J].中成药,2008,30(3):419~420.[8]㊀组晓艳,王玮琼,熊光权,等.花生茎叶多糖提取工艺优化及抗氧化性研究[J].粮食与油脂,2017,30(7):99~102. [9]㊀焦昆鹏,马丽苹,朱文学,等.响应面法优化花生茎叶黄酮的提取工艺及其抗氧化活性研究[J].中国粮油学报, 2018,33(2):89~94.[10]㊀田莉,卢轶男,朱建,等.产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌发酵条件的响应面优化[J].武汉工程大学学报,2018,40(6):619~625.[11]㊀饶犇,周荣华,闵勇,等.枯草芽孢杆菌的发酵培养基优化研究[J].湖北农业科学,2018,57(21):127~129. [12]㊀刘文龙,刘胜利,王兴吉,等.枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件的优化[J].化学与生物工程,2019,36(1):47~52.[13]㊀郑强,位南南.枯草芽孢杆菌培养条件的优化[J].化工设计通讯,2018,44(10):117~118.[14]㊀张源洁,胡迎芬,马爱国,等.纳豆杆菌固态发酵花生粕的工艺条件研究[J].中国油脂,2017,42(3):99~102. [15]㊀张友维,张晖,王立,等.枯草芽孢杆菌发酵制备花生多肽及其自由基清除活力的研究[J].中国油脂,2017,36(10):25~29.Optimization of Peanut Meal and Peanut Stem and Leaf Mixed Feedby Fermentation of Bacillus subtilisCHI Ji-jie,SHI Tai-yuan(Liaoning Academy of Agriculture Sciences,Food and Processing lnstitute,Shenyang,Liaoning㊀110161) Abstract:Taking peanut meal and peanut stem and leaf mixed feed as raw materials,screening the best Ba-cillus subtilis culture conditions as the goal,to study the influence of factors such as the ratio of material to liq-uid,inoculum,fermentation temperature,and fermentation time on the culture of Bacillus subtilis.The results showed that the optimal culture conditions:water addition(material-to-liquid ratio)1ʒ0.83,culture time62 h,inoculation amount0.78g,culture temperature30ħ,the number of Bacillus subtilis spores obtained un-der these conditions is(195.222ʃ0.003).Key words:Peanut cake meal;Peanut stems and leaves;Bacillus subtilis;Spore number㊃35㊃。
枯草芽孢杆菌的发酵过程优化及产物提取技术探究
枯草芽孢杆菌的发酵过程优化及产物提取技术探究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然界中的细菌，具有良好的生物学特性和产物应用潜力。
本文将探讨枯草芽孢杆菌的发酵过程优化以及产物提取技术的相关研究。
首先，枯草芽孢杆菌的发酵过程优化是实现高产产物的关键。
发酵过程中的温度、pH值、培养基组分以及氧气供应等因素对产物生成具有重要影响。
在温度方面，研究表明最适合枯草芽孢杆菌生长和产物生成的温度是37°C。
此外，维持适宜的pH值（通常在6-8之间）有助于促进产物的生成。
培养基组分方面，通常采用含有碳源、氮源、矿物盐和生长因子等成分的培养基。
合理设计培养基组分的配比及优化培养条件，可以提高产物的产量和质量。
此外，提供充足的氧气供应也是枯草芽孢杆菌发酵过程的关键环节，通过调节搅拌速度和增加氧气传递效率，可以最大限度地提高产物产量。
其次，产物提取技术是从发酵液中纯化并得到目标产物的重要步骤。
产物提取的目标是高效、高纯度地获得目标产物，并保证较低的成本和良好的产物质量。
常用的产物提取技术包括有机溶剂提取、沉淀法、离子交换法、超滤法等。
有机溶剂提取是最常用的方法之一，通过将发酵产物与合适的溶剂相混合，在适当的温度和压力下进行搅拌和分离，从而得到相对纯度较高的目标产物。
沉淀法是利用添加特定的盐类或聚合物使产物发生沉淀，利用离心或过滤等方式将沉淀物分离出来。
离子交换法则通过将产物溶液通过具有相应固定相的离子交换树脂柱，利用产物与树脂之间的吸附和解吸作用来完成分离和纯化。
超滤法则是利用不同分子量的孔膜实现对产物的分离和提纯。
根据产物的特性和需求，选择合适的提取方法来实现产物的高效提纯是非常重要的。
此外，为了进一步提高产物的产量和质量，还可以通过辅助策略来优化枯草芽孢杆菌的发酵过程以及产物的提取技术。
常用的辅助策略包括基因工程技术、发酵反应动力学研究、传质芯片技术等。
基因工程技术可以通过改造枯草芽孢杆菌的菌株，使其具有更高的产物生产能力。
枯草芽胞杆菌B44菌株培养与发酵的优化条件研究
枯 草 芽孢 杆 菌在 自然 界 中广 泛存 在 ， 人畜 无 害 ， 污 对 不
染 环境 ， 有显 著 的抗 菌活 性 和极 强 的抗 逆 能 力『１ 具 ６， ， 并且 许 ７
多枯草 芽孢 杆 菌 的菌 株可 以产生 对 主 要植 物病 原 真 菌具 有 抑 制 活性 的代 谢 产 物 ， 具 有极 高 生 物 工 程 利 用价 值 和 开 是 发 前景 的 医用 抗生 素和 环 保 型生 物源 农 药１ 枯 草 芽孢 杆 菌 ８ １ 。
供 试 菌 株 ： 草 芽 孢 杆 菌 菌株 Ｂ４ 、 麦 全 蚀病 菌 、 枯 ４小 苹 果 腐 烂病 菌 ， 由青 岛 农 业 大学 农 业 仿 生 应 用 工 程技 术 研 均 究 中心提供 。
１ ． 培 养 基 ２
温度 、 应 的 时 间 、 ０／ ｉ 相 ２ ｒ ｎ下振 荡 培 养 之 后 ， 抗 细 菌培 ０ ｍ 拮
维普资讯
代农 业科 技 ） ０ ８年 第 ５期 ２０
植 物保 护
枯草芽胞杆 菌 Ｂ ４菌株培养 与发酵的优化条件研究 ４
梁桂淼 罗 兰 刘诚 诚 牛 新威 鲁 世伟 袁忠林
（ 青岛农 业大学植物保护学院 ， 山东青岛 ２６ ０ ） ６ １ ９
摘要
采 用单 因素试验 和 正 交试验 设计 法 Ｌ （ 对 拮抗 细 茵— — 枯 草 芽孢 杆茵 Ｂ ４的液 体 发酵 培 养基 和发 酵 条件 进行 优化 试 验 。 ４） ４ 确
防 治植 物病 害 非常 广泛 【 ５ ｌ 。
１ ． 拮 抗 细 菌培 养 基 的选 择 。 用 ５种培 养 基 。 ．２ ３ 选 各培 养基 的 ｐ 值 均 为 ７０ 装 液 量 为 ３ ｍＬ（ ５ ｍＬ三 角 瓶 ） 接 入 Ｈ ．， ０ ２０ 。 ｌ ｍＬ相 应 的 种 子 发 酵 液 ， ２ ℃ 、 ０ ｒ ｍｉ 下 振 荡 培 养 在 ８ ２０／ ｎ ４ ｈ。 草 芽 孢 杆 菌 细 菌 培 养 液 在 ４Ｃ、０ ０ ０／ ｉ 心 ８ 枯 ￣ １ ０ ｒｒ ｎ离 ａ １ｒｉ 菌体 ， 复 １次 ， 到上 清 液即 为枯 草 芽孢 杆 菌拮 ０ ｎ去 ａ 重 得 抗 物 质粗 提液 。 用环柱 测 定法 『测量 小麦 全 蚀病 菌与 苹果腐 １ ｑ 烂 病 菌在 ５种培 养 粗 提 液 下 的生 长 半 径 的大 小 ， 对 照试 其 验 用 无 菌水 处理 ， 个试 验 重复 ４次 ， 据 各培 养粗 提 液抑 每 根
枯草芽孢杆菌菌株发酵生产工艺优化
３ 结论 风干燥箱 ，上海产，型号 Ｉ Ｏ １ Ａ 一 ３ ；电热恒温培养箱 ，上海产 ，型号 对于培养基的选择应该遵循原料取材方便 ， 来源广泛 ， 价格低廉的 Ｄ Ｈ Ｐ 一 ９ １ ６ ２ ； 垂直流超净工作 台， 上海产 ， 型号 ２ Ｈ Ｊ Ｈ 一 １ １ １ ２ ； 显微镜 ， 日 原则， 酵母膏、 酵母粉这类药品成本较高， 不适用于工业化生产。 本研究 本产 ， 型号 Ｎ ｉ ｋ ｏ ｎ — Ｙ Ｓ １ ０ ０ ； 手提式高压灭菌锅 ， 哈尔滨市医疗器械厂制 在通用培养基中添加了不同比例的的工农业副产品——豆饼粉和麸子 造； 可控温式摇床， 哈尔滨市东联科学仪器厂制造。 即适量的碳源和氮源 ， 根据发酵过程中枯草芽孢杆菌菌体数量的变 １ ． ４方法 。１ Ａ ． １ 菌种活化。 将保存的枯草芽孢杆菌移接到斜面试管 粉 ， 化 ， 得到最佳培养基配方， 即通用培养基 ＋ １ ． ５ ％豆饼粉 ＋ １ ｍ 麸皮 ， 利用 培养基 中， 在恒温培养箱 ３ ７ ±１ 。 ｃ 培养 ２ ４ ｈ 。１ ． ４ ． ２种子液的制备。 取一 这一配方， 生产 出了成本低廉 、 菌活数达 １ ８ 亿 ／ ｍｌ 以上的枯草芽孢杆菌 环 已活化完成斜 面菌种接人到三角瓶种子培养基 中， ５ ０ ０ ｍＬ三角瓶 达到了促进枯草芽孢杆菌菌株生长的目的， 增加了发酵液中菌体 中，装量为 １ ０ ０ ｍ Ｌ种子培养基 ， ３ ７± １ ｏ Ｃ ， １ ８ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ， 摇床 中震荡培养 菌剂 ， 数 量 和代谢 产物 ， 为 工业 化发 酵生 产 和大 面积 推广应 用 提供 充足 的 、 廉 ２ ４ ｈ 。１ ． ４ ． ３ 菌株发酵培养。取 ｌ ｍ Ｌ培养好的种子液， 以２ ％的接菌量ｆ 即 价 的微 生物 菌体及 发酵 菌液 。 在每 ｌ Ｏ Ｏ ｍｌ 的液体培养基 中接入 ２ ｍ ｌ 浓度为 ｌ ｘ ｌ Ｏ ｇ ｅ ｆ ｕ ／ ｍ ｌ 的发酵液汾 参 考文 献 别接入到 ｌ ５ 个（ 每种培养基 ３ 个） 装有 １ ０ ０ ｍ Ｌ发酵培养基的 ５ ０ ０ ｍＬ １ 阿 红， 蔡 学清， 洪永聪等． 辣椒内生细菌的分 离及拮抗菌的筛选ｌ Ｊ １ ． 中国 三角瓶 中， ３ ７ ±１ ℃， １ ８ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ ， 摇床中振荡培养 。 １ Ａ ． ４ 测定方法。 将各摇 ［
枯草芽孢杆菌发酵探讨
枯草芽孢杆菌发酵探讨枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于环境中的革兰氏阳性细菌。
它具有较强的耐受性和适应性，可以在多种不良环境条件下生存和繁殖。
同时，枯草芽孢杆菌也是一种重要的工业微生物菌种，被广泛用于发酵生产中。
首先，枯草芽孢杆菌发酵具有较高的产酶能力。
它可以产生多种酶类物质，如蛋白酶、淀粉酶、葡萄糖酸酶等。
这些酶类物质在食品、饲料、纺织、制浆造纸等行业中具有广泛的应用价值。
其次，枯草芽孢杆菌发酵具有较高的产物纯度和活性。
枯草芽孢杆菌在发酵过程中，利用自身代谢产物形成的有机酸可以抑制其他微生物的生长和繁殖，从而保证产物的纯度。
同时，枯草芽孢杆菌产酶速度快，活性高，能够在较短的时间内生产出大量的酶类物质。
再次，枯草芽孢杆菌具有良好的耐受性和稳定性。
它对温度、pH值、盐浓度等环境条件的变化具有较强的适应性，能够在广泛的温度范围和pH值范围下生存和繁殖。
同时，枯草芽孢杆菌在发酵过程中也不容易受到其他杂菌的污染，具有较高的发酵稳定性。
最后，枯草芽孢杆菌发酵的过程相对简单。
它可以利用较简单的底物进行培养，如蔗糖、葡萄糖等。
同时，枯草芽孢杆菌的培养基成本相对较低，可以降低生产成本。
枯草芽孢杆菌发酵的应用十分广泛。
在食品工业中，枯草芽孢杆菌的产蛋白酶能够用于食品加工过程中的蛋白质降解和改善食品的口感。
在饲料工业中，枯草芽孢杆菌的产淀粉酶能够用于饲料中淀粉的降解，提高饲料对动物的消化吸收。
在纺织工业中，枯草芽孢杆菌的产脱涂酶能够用于纺织面料的漂白和去杂。
综上所述，枯草芽孢杆菌发酵具有较高的产酶能力、产物纯度和活性、耐受性和稳定性，以及相对简单的培养条件和低成本。
它在食品、饲料、纺织、制浆造纸等多个领域中有着广泛的应用前景。
然而，还有很多与枯草芽孢杆菌发酵相关的问题需要进一步研究和探讨，如不同发酵条件对产酶效果的影响、优化发酵过程以提高产量和质量等。
未来的研究将进一步推动枯草芽孢杆菌发酵技术的应用和发展。
枯草芽孢杆菌培养基优化
形、凸起、湿润。
枯草芽孢杆菌在培养过程中可产生多种代谢产物，如抗菌物质、酶等， 这些代谢产物具有潜在的商业价值。
03
培养基成分对枯草芽孢杆菌生长 的影响
碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响
氮源是培养基中重要的营养成分之一， 对枯草芽孢杆菌的生长和代谢具有重要
影响。
常用的氮源包括有机氮源和无机氮源， 其中有机氮源如蛋白胨、酵母粉等可以 提供丰富的营养物质，促进枯草芽孢杆 菌的生长，而无机氮源如硝酸盐、氨盐
等则对其生长作用有限。
在优化培养基时，需要选择适当的氮源 及其浓度，以获得最佳的生长效果。
实验操作
根据因素和水平数量，选择合适的均匀表 ，确保每个实验组合都包含所有因素和水 平，且每个水平的出现次数相同。
数据处理
根据均匀表进行实验操作，记录每个组合 下的枯草芽孢杆菌生长情况。
分析实验数据，找出最优的培养基组合。
05
培养基优化实验结果分析
正交试验设计结果分析
• 氮源种类：在正交试验中，不同氮源种类对枯草芽孢杆菌的生长和芽孢产量有显著影响。其中，牛肉膏、蛋白 胨和尿素为较优的氮源，牛肉膏与蛋白胨的组合或牛肉膏与尿素的组合为最佳氮源。
生长因子对枯草芽孢杆菌生长的影响
生长因子是促进微生物生长和代谢的一类微量营养成分。
不同的生长因子对枯草芽孢杆菌的生长和代谢具有不同的作用，如维生素B1可以促进其生 长和产酶，而其他一些生长因子则对其生长和代谢没有明显影响。
在优化培养基时，需要添加适量的生长因子，以促进枯草芽孢杆菌的生长和代谢。
培养基pH值对枯草芽孢杆菌生长的影响
枯草芽孢杆菌培养基的优化分析研究
目录枯草芽孢杆菌培养基的优化研究- 2 -1 枯草芽孢杆菌简介及应用- 3 -1.1 枯草芽孢杆菌简介- 3 -1.2 枯草芽孢杆菌应用- 3 -2材料和方法- 4 -2.1 实验材料- 4 -2.1.1 菌株- 4 -2.1.2 培养基- 5 -2.1.3 仪器与设备- 5 -2.2 培养基的优化- 5 -2.2.1 培养方法- 5 -2.2.2 检测方法- 5 -2.2.3含水量对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -2.2.4稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -2.2.5氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -2.2.6碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -2.2.7碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -2.2.8 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响- 7 -3 结果和分析- 7 -3.1含量水对枯草芽孢杆菌生长的影响- 7 -3.2稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响- 7 -3.3氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 8 -3.4碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 8 -3.5碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响- 9 -3.6 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响- 9 -参考文献- 10 -枯草芽孢杆菌培养基的优化研究摘要。
随着国家对农业的支持，微生物化肥有农业中的应用也越来越受到重视。
而枯草芽孢杆菌在农业方面和其它方面都有广泛的应用，因此，对枯草芽孢杆菌的研究也越来越多，对枯草芽孢杆菌的需要也越来越大。
为了在枯草芽孢杆菌的工业生产中，降低生产成本而又能提高枯草芽孢杆菌的产量，对枯草芽孢杆菌的发酵培养基进行研究。
本文先就培养基的主要原料，含水量，碳源，氮源，碳氮比，pH等几个因素作单因素实验。
研究表明最佳培养基是：稻草49.05%，玉M粉2.25%，尿素0.9%，CaCO 1.8%，KH PO 1.0% ，水含量57%，pH 7.8[1][2]。
关键词。
枯草芽孢杆菌。
培养基优化[3]。
应用Bacillus subtilis culture medium optimizationAbstract :along with the country the support to agriculture, microbialfertilizer has application in agriculture has been paid more and moreattention. And Bacillus subtilis in agriculture and other aspects of awide range of applications, therefore, on Bacillus subtilis are studiedmore and more, on Bacillus subtilis needs more and more. In order toBacillus subtilis in industrial production, reduce production cost andcan improve the yield of Bacillus, Bacillus subtilis fermentationmedium of.This article first medium main raw material, water content, carbonsource, nitrogen source, carbon and nitrogen ratio, pH and several otherfactors single factor experiment. Research shows that the optimummedium was49.05%: straw, corn flour 2.25% ,urea 0.9%,CaCO 31.8%,KH3 PO 4 1%, water content 57%, pH 7.8[1] [2].Key words:Bacillus subtilis。
枯草芽孢杆菌发酵探讨
枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，已被越来越多地研制成饲用微生态制剂。
因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。
枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能产生抗菌素，在动物肠道内具有较强生物夺氧能力。
这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率、防病和促进生长起到重要作用。
鉴于此，国内外专家学者对研究开发枯草芽孢杆菌制剂用于畜禽养殖日趋关注，从而也促进了这一产业的迅猛发展，但在现阶段的工业化生产中，存在着制约枯草芽孢杆菌发酵的诸多因素。
1、枯草芽孢杆菌的生物学特点杆菌：一般(0.7〜0.8 )X( 2.0〜3.0 )卩m电子显微镜测量为(0.5〜0.6 ) x( 1.1〜3.5 ) 革兰氏阳性，运动，有长而又丰富的周生鞭毛。
芽孢：椭圆形，中生或偏中生，即使孢囊膨大也不显著。
生长温度：最高温度45〜55 C;最低温度5〜20 C。
阳性反应：接触酶；V-P反应；在7 %的氯化钠中生长；pH5.7 生长；分解葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸；水解淀粉；利用柠檬酸作为碳源；还原硝酸盐为亚硝酸盐；分解酪素；石蕊牛奶产碱胨化。
阴性反应：厌氧生长；卵黄反应：在葡萄糖洋菜上或酪氨酸洋菜上形成可溶性黑色素；28C 4星期水解马尿酸盐；利用丙酸盐并分解酪氨酸。
在55C生长的菌株被0.02 %的叠氮化合物抑制。
变化的性质：在V-P液中产酸(pH5.0〜8.0);对溶菌酶的抗性；在10%的氯化钠中生长。
2、芽孢杆菌制剂的作用机理 2.1可产生酶类和营养物质研究表明芽孢杆菌能够分泌大量的胞外酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，有助动物对饲料的降解、消化，提高饲料利用率。
饲料中未被消化的蛋白质和一些含氮物质在肠道中被大肠杆菌和其他细菌脱梭生成具有潜在的毒性的腐胺、吲哚、酚类等物质。
一些芽孢杆菌可产生氨基氧化、SOE W、分解硫化氢的酶以及其他抗菌物质如过氧化氢，起到杀菌作用，从而减少动物体内有害物质的产生。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
收稿日期:2018-08-14基金项目:湖北省技术创新专项重大项目(2016ABA103);湖北省农科院重大研发成果培育专项(2017CGPY01);国家重点研发计划项目(2017YFD0200900)作者简介:饶犇(1983-),男,湖北孝感人,助理研究员,博士,主要从事发酵工程研究,(电话)156********(电子信箱)623253512@。
饶犇,周荣华,闵勇,等.枯草芽孢杆菌的发酵培养基优化研究[J].湖北农业科学,2018,57(21):127-129.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )是一种常用的微生物源生物农药。
枯草芽孢杆菌在防治水稻、小麦、花生、番茄、辣椒、大豆、玉米等作物的病害上有较好的效果,特别是针对小麦白粉病、赤霉病、纹枯病等病害的防治效果更佳,田间增产率达到了10%~50%[1-4]。
枯草芽孢杆菌具有很强的营养物质竞争能力以及氧气竞争优势;定殖、繁殖速度很快,迅速抑制其他病原微生物生存,起到保护植物、确保植物健康生长的作用。
此外,枯草芽孢杆菌对人畜无毒无害、不污染环境、对作物安全;能产生多种抗菌素和酶,具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力;还能分泌促进作物生长的活性物质,使植株叶片浓绿肥厚,提高作物免疫力,增产提质效果显著,发酵过程中产生多种氨基酸,对作物有生长调节的作用[5-9]。
枯草芽孢杆菌主要是以3种方式起作用,一是竞争作用:拌种或灌根后,枯草芽孢杆菌能够在作物周围、根表面、根内部以及通过植物导管传导到地上部分而在作物根表、根内、茎部、叶部等位点定殖和繁殖,保护作物根部不受病菌侵染和抑制作物体内枯草芽孢杆菌的发酵培养基优化研究饶犇,周荣华,闵勇,廖先清,刘芳,陈伟,张光阳(湖北省生物农药工程研究中心,武汉430064)摘要:为了得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )发酵的最佳培养基,应用Plackett-Burman 设计法对影响枯草芽孢杆菌芽孢形成的关键因子进行筛选,并进一步采用响应面分析法对影响芽孢产量的关键因素进行研究。
结果表明,影响枯草芽孢杆菌芽孢产量的关键因素为玉米淀粉和豆粕的浓度。
通过响应面分析法的拟合和推算,得到玉米淀粉和豆粕浓度分别为2.48、4.90g /mL 时,此时模型预测发酵最佳产量为105亿/mL ,验证值为110亿/mL ,预测值与验证值之间吻合较好,比优化前实际产量(80亿/mL )提高了37%。
关键词:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis );Plackett-Burman 设计法;响应面分析法中图分类号:Q813.1文献标识码:A文章编号:0439-8114(2018)21-0127-03DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2018.21.033开放科学(资源服务)标识码(OSID ):Optimizing on Fermentation Conditions of Bacillus subtilis by Response SurfaceAnalysis MethodologyRAO Ben ,ZHOU Rong-hua ,MIN Yong ,LIAO Xian-qing ,LIU Fang ,CHEN Wei ,ZHANG Guang-yang(National Biopesticide Engineering Technology Research Center,Wuhan 430064,China)Abstract :In order to obtain the optimal medium composition for Bacillus subtilis production,the Plackett -Burman design method was used to evaluate the effects of five variables,and the optimum levels of key factors affecting spore production were conducted by response surface analysis methodology.The results showedthat,the optimal values of the two parametersdetermined by response surface analysis methodology were corn starch 2.48g /mL and corn-soybean 4.90g /mL.The predicted spore production was 1.05×1010CFU /mL,and the actual experimental result was 1.10×1010CFU /mL,they were in agreement and it is 1.37folds of the production before optimization (8×109CFU /mL).Key words :Bacillus subtilis ;Plackett-Burman design method;response surface analysis methodology湖北农业科学2018年病原菌扩散,从而达到防病作用。
二是杀菌作用:枯草芽孢杆菌在作物根表、根内、茎部、叶部等位点定殖和繁殖过程中,能产生脂肽类和蛋白类等杀菌物质,从而杀死作物病原菌,达到防病效果。
三是促生作用:枯草芽孢杆菌具有解磷作用,可以将土壤中无效磷转化为能被作物吸收的有效磷,促进作物根系及植株生长,提高了作物的抗病性。
本研究以实验室自行分离得到的枯草芽孢杆菌NBF-809菌株为研究对象,对其培养基和培养条件进行Plackett—Buman试验,筛选显著的影响因子,然后通过响应面试验组合设计,拟合数学模型方程,从而找到最优条件组合,并对其试验结果进行评估,以期初步筛选比较合适的培养基配方。
1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1菌种实验室自行分离,鉴定为枯草芽孢杆菌,编号为NBF-809。
1.1.2培养基固体培养基为LB培养基。
种子培养基配方:淀粉10.0g/L,酵母浸粉5.0g/L,磷酸氢二钠0.5g/L,硫酸镁0.5g/L,pH7.0。
发酵培养基初始配方:淀粉15.0g/L,豆粕20.0g/L,磷酸二氢钾1.0g/L,磷酸氢二钠0.5g/L,碳酸钙0.5g/L,硫酸镁0.5g/L,硫酸锰0.2g/L。
后期采用优化后配方。
1.2试验方法1.2.1发酵培养条件接种体积分数2%,发酵温度30℃,摇床转速200r/min,发酵48h。
1.2.2Plackett-Burman试验采用Minitab的Plackett-Burman两水平法对培养基成分进行考察,筛选影响枯草芽孢杆菌芽孢数的重要因素,确定最佳配方。
设计水平和排列方式见表1。
1.2.3最陡爬坡试验根据Plackett-Burman试验得出的拟合方程安排最陡爬坡试验来确定因素取值中心点。
拟合方程中各变量系数确定爬坡方向和变化步长,另外步长确定亦与试验条件相关。
1.2.4中心组合设计和响应面分析对Plackett-Burman试验确定的因素,以最陡爬坡试验得到的中心点,根据中心组合设计原理安排响应面试验获得重要因素的最佳配方水平。
根据中心组合设计结果来拟合数据,得到描述响应值和自变量之间关系的二阶模型,即:Y=b0+∑i b i x j+∑i∑j b ij x i x j+∑b ii x i2+e其中,Y是产物能力测量值,b0是截距,b i是关键因素线性效果的系数,b ii是关键因素的二次效应系数,b ij是关键因素间交互作用的系数。
根据拟合的数学模型以及方差分析的结果,可以评价每个因子及其交互作用对过程的影响程度,利用响应面图和等高线图直观地描绘其结果,同时利用拟合的数学方程求解最优结果。
1.2.5培养基优化结果验证试验用优化后的培养基组分配制发酵培养基,发酵结束后测定发酵液中的菌丝重量。
2结果与分析2.1Plackett-Burman试验结果据前期研究结果,确定以玉米淀粉和葡萄糖为碳源,以蛋白胨、玉米浆和豆粕为氮源,共5种因素(X1玉米淀粉、X2葡萄糖、X3蛋白胨、X4玉米浆、X5豆粕)一起进行Plackett-Burman设计试验,设计方案和试验结果见表1。
由t检验结果可知,玉米淀粉和豆粕对枯草芽孢杆菌的生长和芽孢形成具有显著影响,可信度在95%以上,且两者对枯草芽孢杆菌的生长影响是正效应。
由上述Plackett-Burman试验得到的回归方程为Y=75+5.67X1+0.83X2+0.5X3-X4+11X5,方程拟合的相关性为R2=98.01%,表明此多项式方程很好地模拟和解释了Plackett-Burman的试验结果。
2.2最速爬坡试验结果找到对产物发酵影响最大的因素后,需要进一步对这些因素进行分析。
最速上升法以前述Plackett-Burman设计试验得到的一次方程为基础,以相应因素的系数比为基准进行步移,直到步移至最高点,然后以最高点附近的范围作为响应面优化的相应范围。
从Plackett-Burman设计试验得到方程中玉米淀粉和豆粕的系数(X1=5.67,X2=11),可以得表1Plackett-Burman试验设计与结果组数123456789101112因素X11.01.01.01.52.01.02.01.01.02.02.02.0X42.02.01.01.52.01.01.02.01.02.01.02.0芽孢数//亿/mL798254656781936159907271X32.01.01.01.52.02.02.02.01.01.02.01.0X20.500.500.501.250.502.002.002.002.002.000.502.00X5442324422422128第21期(上接第76页)蔓陀罗、黎和牵牛花等杂草的生长等[7]。
参考文献:[1]赵丰华,吕立哲,任红楼,等.茶园杂草的种类及无公害防治措施[J].安徽农学通报,2011(15):32-33.[2]姚朝富.无公害茶园病虫防治技术[J].植物医生,2003(1):28.[4]洪海林,刘恒贵,余安安,等.茶园蜘蛛的控害作用及其保护利用[J].中国植保导刊,2009,29(9):17-18.[5]洪海林.茶小绿叶蝉的天敌及其控制作用[J].中国茶叶,1989(6):14-15.[6]洪海林.茶园蜘蛛的种类及其消长分析[J].茶业通报,1991,13(1): 36-38.[3]袁倩.有机茶园病虫害防治技术[J].现代农业科技,2018(11): 163.[7]蒋光藻,谭和平,黄平.茶园杂草生态控制技术研究[J].西南农业学报,2003,16(3):58-60.到这两个因素步移的步长比为1.00∶1.94,即当玉米淀粉步移1.00个单位(0.20g/L)时,豆粕也步移1.94个单位(0.38g/L)。