免疫组化
免疫组化的原理及流程介绍
免疫组化原理及流程介绍
(2)封闭内源性过氧化酶
其主要目的是降低内源性过氧化 物酶的活性。在传统的ABC法和SP 法中，免疫组化反响结果简洁受到 内源性过氧化物酶的干扰，必需用 过氧化氢等进展灭活。
免疫组化原理及流程介绍
具体操作:
1)用封闭通透液浸润切片 30 min〔RT 避 光〕。 其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30％H2O2。
80年月 Hsu 等建立了抗生物素—生素 〔ABC〕法之后，免疫金—银染色法、半 抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 90年月 分子杂交技术、原位杂交技术、免 疫细胞化学分类方法快速进展。 2023年 各种免疫组化技术更加成熟，使免 疫组化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合争论的一项有力工具。其应用范 围深达医学各个学科，是目前生命科学工作 者应当把握的根本技术之一。
免疫组化原理及流程介绍
留意事项：
• 1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳 性染色的位置。
• 2.切片脱蜡和水化要充分；加反响液时要掩 盖组织充分；每次加 液前甩干洗涤液，但 又防止干片 。
免疫组化原理及流程介绍
• 3.以下缘由可能导致片子着色不均匀： • ① 脱蜡不充分。可以 60 ℃烤 20 min，马上放入新颖
具体操作：
1)将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次； 2)用滤纸将圆圈四周的水吸去，参加已 稀释的二抗后放入 37℃恒温烤箱中 30 min。 3)用 PBS 洗 5 次×5 min
7.SP反响
SP染色法即链霉素抗生物素蛋白 生 物素过氧化酶连接法。
该法是ABC法根底上的进一步改进， 使卵白素与链霉〔而非生物素〕结合， 而后再结合PO基。
免疫组化
什么是免疫组化免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。
（一）免疫组织化学技术的基本原理免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。
即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。
只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。
免疫组化 定义和原理
免疫组化定义和原理免疫组化，这听起来是不是有点高大上的名字呢？其实呀，它就像是微观世界里的一个超级侦探呢！那免疫组化到底是啥定义呢？简单来说，免疫组化就是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，来对组织细胞中的某些特定抗原进行定位、定性和定量研究的技术。
你可以把组织细胞想象成一个超级大的社区，里面住着各种各样的居民，这些居民呢就相当于不同的抗原。
而免疫组化就像是拿着特殊的“身份证”（抗体）去这个社区里找特定的居民（抗原）。
比如说，我们想找到社区里那个穿红衣服的居民（特定抗原），那我们就拿着专门识别穿红衣服居民的“身份证”（特异性抗体），在这个大社区（组织细胞）里找呀找。
再来说说它的原理吧。
这原理可有趣啦！抗原和抗体就像是一把锁和一把专门开这把锁的钥匙。
每一种抗原都有它独特的结构，就像每一把锁的锁芯都不一样。
而抗体呢，就是根据抗原的这个独特结构制造出来的特殊“钥匙”。
当我们把含有抗体的试剂放到组织切片上的时候，这个抗体就会像小侦探一样，在组织细胞这个微观世界里到处寻找和它匹配的抗原。
一旦找到了，它们就会紧紧地结合在一起，就像钥匙插进锁里一样严丝合缝。
那找到之后怎么能让我们看到呢？这时候就有一些神奇的“小助手”出场啦。
比如说，我们可以给抗体带上一个有颜色的标记，就像给小侦探戴上一个彩色的帽子。
当抗体和抗原结合的时候，这个有颜色的标记就会显示出来，我们就能在显微镜下看到啦，就像在社区里看到那个穿红衣服的居民头上顶着一个彩色的气球一样显眼。
还有一些更高级的标记方法，像用荧光标记，在特殊的光线下，结合的地方就会发出漂亮的荧光，就像在黑暗里发现了闪闪发光的宝藏一样。
免疫组化在医学上可帮了大忙呢！比如说在肿瘤的诊断中，它就像是一个火眼金睛的小助手。
肿瘤细胞就像是隐藏在正常细胞中的“小坏蛋”。
免疫组化可以通过检测肿瘤细胞特有的抗原，来确定这个肿瘤是良性的还是恶性的，是从哪里起源的。
这就好比是发现了一个捣乱的家伙，然后通过他身上的一些特殊标记，知道他是从哪个地方来的，是小偷小摸的小坏蛋（良性肿瘤），还是特别危险的大坏蛋（恶性肿瘤）。
免疫组化项目及意义
免疫组化项目及意义
【最新版】
目录
1.免疫组化项目的定义
2.免疫组化的意义
3.免疫组化项目的应用
4.免疫组化项目的发展前景
正文
1.免疫组化项目的定义
免疫组化是一种实验室技术，它通过检测组织或细胞中特定蛋白质的表达，帮助研究人员了解这些蛋白质在生物体内的功能和作用。
免疫组化项目是通过这一技术来研究蛋白质在疾病发生、发展和治疗中的角色。
2.免疫组化的意义
免疫组化在生物医学研究中有着重要的意义。
首先，它可以帮助研究人员了解蛋白质的功能和作用，为疾病的诊断和治疗提供新的思路和靶点。
其次，免疫组化可以用于疾病标志物的发现和验证，为疾病的早期诊断和预后评估提供依据。
最后，免疫组化还可以用于药物筛选和药效评估，为新药研发提供支持。
3.免疫组化项目的应用
免疫组化项目在临床医学、基础研究和药物研发等领域有着广泛的应用。
在临床医学中，免疫组化主要用于疾病诊断、预后评估和疗效监测。
在基础研究中，免疫组化可以用于研究蛋白质的功能和作用，揭示疾病的发病机制。
在药物研发中，免疫组化可以用于药物筛选和药效评估，提高药物研发的成功率。
4.免疫组化项目的发展前景
随着生物医学研究的深入，免疫组化技术也在不断发展和完善。
病理报告中“免疫组化”是什么意思
免疫组化，即免疫组织化学检测，是病理诊断中一种常用的检测手段。
即对送检的标本，无论是小标本还是大标本，进行切片、染色，进而根据化学反应使标记抗体的显色剂显色，以此来确定组织细胞内的抗原，对其进行定位、定性及定量的研究。
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免疫组化对于病理诊断中肿瘤的鉴别诊断、肺癌类型的判断，甚至对肺癌后续治疗都是十分有帮助的（
此外，免疫组化可用于肺癌分子分型的判断，即运用免疫组化的方法进行基因检测。
“+”就是指免
疫组化中染色为阳性，即有基因突变，反之，“- 就是指染色为阴性，没有基因突变。
“ + ”“ -”在鉴别诊断当中都有临床意义，并不能说“ + ”就是好, “-”就是不好。
(整理)免疫组化知识
免疫组织化免疫组织化学免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。
它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
1．发展简史——1941年Coons首先用荧光素标记抗体一检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
60年代Nakane建立酶标抗体技术铁蛋白标记Ab技术。
——70年代Stemberger改良上述技术，建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。
——80年代Hsu等建立了抗生物素一生素（ABC）法之后，免疫金一银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。
——90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。
——2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。
其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。
2．免疫组织化学的技术分类（1）根据染色方式分成：①贴片染色；②漂浮染色。
（2）根据Ag—Ab结合方式分成：①直接法；②间接法；③多层法。
（3）按标记物的性质分成：①免疫荧光技术（免疫荧光法）；②免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、ABC法）；③免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）。
3．标记物（1）必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。
（2）常用标记物①荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC）荧光显微镜下呈绿色荧光四乙基罗达明（rho—damineRB200）——荧光显微镜下发橙红色荧光；②酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
③生物素：（Biotin）④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。
其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）4．应用凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。
免疫组化项目及意义
免疫组化项目及意义免疫组化是一种广泛应用于生物医学研究中的技术，主要用于检测和鉴定细胞、组织和生物官能表达的抗原、蛋白质或染色体。
下面将介绍免疫组化项目及其意义。
一、免疫组化项目1. 抗原检测：免疫组化技术可以通过检测特定的抗原来帮助研究人员了解细胞特异性，从而揭示病理过程的机制，并且有助于早期诊断和预后评估。
2. 蛋白定位：免疫组化可以揭示蛋白质在细胞器或细胞间相互作用网络中的定位和表达水平。
通过检测免疫组化染色的结果，可以定位和定量感兴趣的蛋白质，从而为相关研究提供重要信息。
3. 组织分型：免疫组化技术在临床诊断中具有重要意义。
通过检测组织切片中的特定抗原，可以帮助确定肿瘤类型、分级和预后，从而为医生提供更准确的诊断和治疗方案。
二、免疫组化项目的意义1. 疾病诊断和预后评估：免疫组化技术可以帮助研究人员识别和定位疾病标志物，进而提供准确的疾病诊断和预后评估。
在癌症研究中，通过检测肿瘤标志物的表达水平，可以对患者的预后进行评估，以指导治疗方案的选择。
2. 新药研发：免疫组化技术在新药研发过程中起着关键作用。
通过检测特定的分子标记物，可以评估药物的疗效和安全性，从而为临床试验提供重要的依据。
3. 疾病机制研究：免疫组化技术可以揭示细胞和组织中蛋白质的分布和表达情况，从而帮助研究人员深入了解疾病的发生机制，为疾病的预防和治疗提供理论基础。
4. 个体化治疗：免疫组化技术可以帮助医生根据患者的病理特征和分子标记物，制定个体化治疗方案。
通过检测特定蛋白质的表达水平，可以预测患者对特定治疗方法的响应和耐受性，从而最大限度地提高治疗效果。
免疫组化项目在生物医学研究中具有广泛的应用价值和重要意义。
通过检测特定抗原和蛋白质的表达情况，可以帮助了解疾病的发生机制、诊断和治疗方法的选择，进而促进疾病的预防和治疗。
免疫组化和病理活检
免疫组化和病理活检
免疫组化和病理活检是病理检查中比较常规的技术，二者的区别如下：
１．准确性不同。
免疫组化根据抗原表达推断，准确性稍
逊于病理活检；病理活检能直接观察肿瘤细胞结构和细胞学特征，准确性较高。
２．侵入性不同。
免疫组化是一种非侵入性检查；病理活
检是一种小手术，属于有创检查。
３．检查目的不同。
免疫组化主要用于判断肿瘤的起源及
分类型别；病理活检不仅可以判断肿瘤类型，还可以观察癌细胞的结构、分级、淋巴结状态等，以全面了解肿瘤属性。
４．结果解释不同。
免疫组化结果较难直接解释，需要与
病理活检等结果联合判断，以确定肿瘤性质；病理活检结果易于理解和判断。
５．重复性不同。
免疫组化检查重复性较差；病理活检结
果重复性较好。
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Dm （平滑肌肉瘤）
actin （乳腺导管）
MGB（横纹肌）
血管（淋巴管）源性:
Ⅷ因子相关抗原（FⅧRag）－血管内皮细胞、 外皮细胞阳性
荆豆凝集素（UL）－ 血管内皮、外皮细胞阳性 CD 34 --血管（淋巴管）内皮细胞
FⅧRag
表3. 神经组织常用标志物
--------------------------------------------------------------------------------------------
免疫组化hp阳性
一. 检测致病原
（一）外源性
1. 细菌类 溶链球菌M蛋白 － 肾小球肾炎、风湿热 伤寒杆菌Vi抗原 － 肾小球肾炎 葡萄球菌抗原 － 肾小球肾炎 白喉杆菌抗原 － 肾小球肾炎
2. 病毒
肝炎病毒（甲、乙、丙型肝炎病毒等） 病毒性肝炎 肝细胞肝癌
肝 HBsAg+
肝 HBcAg+
肝 HCV Ag+
45-400
内脏器官上皮
桥粒蛋白
DSP
215-285
细胞连接结构
甲状腺球蛋白
TGB
670
甲状腺上皮
前列腺特异抗原 PSA
34
前列腺上皮
组织多肽抗原
TPA
20-25
肝、胆管上皮
-------------------------------------------------------------------------------------------------------
(一)物质基础
● 间质细胞群 － A壁平滑肌样细胞 肝星状细胞 肾小球系膜细胞 肺成纤维细胞
● ECM
胶原蛋白 间质型 － Ⅰ、Ⅲ型胶原 基膜型 － Ⅳ、Ⅴ型胶原
Col-I
Col-IV
粘连性糖蛋白 FN、LN、TBS、透明质酸 糖胺聚糖（蛋白氨基多糖）:
硫酸化氨基多糖 － 软骨素、肝素、肤质 小分子氨基多糖 － 胶原修饰蛋白等
名称
英文缩写
分子量（KD） 意 义
----------------------------------------------------------------------------------------------------
全白细胞抗原
CD45
180-200
T、B 细胞
表面免疫球蛋白 SIg
· 肾小球肾炎
发病机制 免疫复合物型 － 颗粒状荧光 抗GBM型 － 线状荧光
球蛋白类型 IgG为主 － 感染后肾炎、膜性肾炎、 膜增生性肾炎
IgA为主 － IgA肾病、紫癜性肾炎 IgM为主 － IgM肾病、FSGS λ、κ － 淀粉样肾病、轻链肾病
IgAN
FSGS
● SLE 血浆 － 自身抗体种类多
胃壁细胞抗原
二. 免疫性损伤
（变态反应性疾病）
㈠ 免疫活性细胞 1. T 细胞
● 静止T细胞 CD1～CD8,可分为CD4＋细胞、CD8＋细胞 ● 活化T细胞 CD9（J2）、CD25（IL－2R）、Ia(HLA-D) ● 其他标志：CD80、CD95、CDw109、CDw122
2. B 细胞
溶菌酶
肺α1-ACT
肿瘤溶菌酶
肾小球MAC387+细胞
代表性疾病：
● 移植物排异反应 ● 甲状腺炎 ● 干燥综合征 ● 病毒性肝炎
㈡ 抗体介导的变态反应性疾病
免疫球蛋白 － IgG、IgA、IgM、IgE、 λ、κ链
补体 -- C1、C2、C3、C4 － 经典途径 C3备介素 － 替代途径
代表性疾病：
2.间叶组织类抗原
间叶细胞性: 波形蛋白（Vm）－ 间叶性肿瘤
Vm ( 结肠间质 )
Vm ( 恶性纤维组织细胞瘤 )
肌源性: 结蛋白( Dm ) － 肌源性肿瘤 肌动蛋白( actin ) － 肌源性肿瘤 肌凝蛋白( myosin )－ 骨骼肌 肌红蛋白( myoglobin，MGB )－ 横纹肌肿瘤
血管、淋巴管
(FⅧ-RAg)
肌红蛋白
MG
17.8
横纹肌、中胚叶组织
溶菌酶
14.4
组织细胞
α1-抗胰蛋白酶 α1-AT
α1-抗糜蛋白酶 α1-ACT
---------------------------------------------------------------------------------------------------------
肾组织 － 复合物中球蛋白和补体种类多、数量大、 范围广
皮肤 － 狼疮带
IgG
IgA
IgM
SLE
C3
C1q
● 变态反应性血管炎（结节性多A炎、显微镜型多血管炎）
IgG、IgM、IgA沉积
ANCA － CANCA（胞浆型） － 韦格纳肉芽肿 pANCA（核周型） － 显微镜型多血管炎等
● 移植物排异反应 血管壁 － IgG、C3沉积 肾小球 － 复发性肾炎
● 静止B细胞 SIg(G、M、D), CD19-22、CD24、 Ia（HLA-D）
● 活化B细胞 CD23（Blast-2, BCGF) CD25(IL-2R)
● 其他标志 CD80、CD86
3.NK细胞
CD11b、CD11c、CD16、CD35、CD57、CDw122等
4.单核巨噬细胞
CD16、CD23、CD32、CD115 酶类：α1抗胰蛋白酶、α1抗糜蛋白酶
实用性 对疾病作出诊断
举例：乳头状瘤病毒 － 宫颈癌、乳头状瘤、湿疣
HBV抗原 － 病毒性肝炎、HBV相关性肾炎、
食道鳞幽癌门-HP螺V 杆菌 – 慢性胃炎
食道腺癌-HPV
慢性胃炎胃溃疡的病因发现 马歇尔获2005年诺贝尔医学奖
1979年， 沃伦教授初 步发现幽门 螺杆菌，之 后马歇尔与 他合作开展 研究,最终 发现幽门螺 杆菌与慢性 胃炎的关系。
肾小球肾炎 （乙、丙型肝炎病毒）
肾小球 HBcAg +
肾小管 HBcAg +
人类免疫缺陷病毒 乳头状瘤病毒
单纯疱疹病毒 巨细胞病毒 EBV病毒
人类T细胞病毒Ⅰ型 Ⅱ型
AIDS 病 湿疣（6，11型） 宫颈癌（16，18，31型） 宫颈癌 巨细胞病毒性肺炎等 Burkitt 淋巴瘤 鼻咽癌 传染性单核细胞增生症 急性T细胞白血病 蕈样霉菌病
突触囊泡蛋白
Sy
38
神经元突触前囊泡、
肾上腺髓质等
-------------------------------------------------------------------------------------------
3. 神经源性 神经微丝( neurofilament, NF )－神经元及神经 内分泌肿瘤 S－100 － 神经胶质细胞、鞘膜细胞、黑色素 细胞、肌上皮来源肿瘤
名称
英文缩写
分子量（KD）
意义
---------------------------------------------------------------------------------------------------
波形蛋白
Vm
57
间叶组织
结蛋白
Dm
53
肌组织
血友病因子
VWF
200-240
● 其他自身免疫性疾病 混合性结缔组织病：血管、 肾小球内IgG、C3沉积 硬皮病：结缔组织、 血管壁IgG沉积
硬皮病
三. 修复、纤维化机制的研究
肉芽组织是不完全性修复的物质基础
常见疾病
A粥样硬化 － 冠心病 肝硬化 － 肝昏迷、上消化道大出血 肾小球硬化 － 肾功能衰竭 肺纤维化 － 肺心病、肺性脑病
名称
英文缩写 分子量（KD）
意义
---------------------------------------------------------------------------------------------------------
细胞角蛋白
CK
40-68
上皮（腺、鳞上皮）
上皮细胞膜抗原 EMA
1. 上皮细胞类抗原
细胞角蛋白（CK）低分子量 － 腺状上皮 高分子量 － 鳞形上皮 全细胞角蛋白 － 腺、鳞和移行上皮
CK（宫内膜 ） CK（ 卵巢黏液腺癌 ） CK ( 食管腺癌 )
CK ( 皮肤 )
特异性上皮标志
甲状腺球蛋白（TGB）－甲状腺滤泡上皮 前列腺特异性抗原（PSA）－ 前列腺上皮 甲胎蛋白（α-FP）－ 肝癌细胞、生殖细胞肿瘤 胚胎性硫糖蛋白（FSA）－ 胃癌细胞
β 2类 动脉内皮细胞表面粘附分子
β3 类
血小板gpⅡb/Ⅱa：Fb、FN、vWF、Vn α v β 3 ：Vn、Fb、vWF、TBS
● 基质降解酶及其抑制因子 纤溶酶降解系统: PAs（uPA、tPA）－ PAI-1,2,3,4 基质金属酶降解系统: MMPs － TIMPs
● 细胞内传递信使 PKC依赖途径 非PKC依赖途径 Smad信号通路
TGB（甲状腺） PSA（前列腺癌） PSA（转移癌）
α-FP（卵黄囊癌）
上皮膜抗原（EMA） 特异性较CK差，因浆细胞瘤、 淋巴瘤细胞等可为阳性
癌胚抗原（CEA） 腺癌的标记物
EMA（乳腺癌）
EMA（肾癌）
CEA（结肠癌）
表2. 间叶组织常用标志物
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