引物设计-初学者超级推荐
设计引物的方法
设计引物的方法
首先，确定目标序列是进行引物设计的第一步。
目标序列的选
择应该考虑到所需扩增的DNA片段的长度和特点，以及引物的位置
和方向。
在确定了目标序列之后，就可以根据目标序列的特点来选
择合适的引物设计方法了。
一种常用的引物设计方法是基于序列比对的方法。
通过对目标
序列与相关物种的序列进行比对，可以找到共同的保守区域，从而
设计出具有较高特异性的引物。
这种方法适用于目标序列与已知序
列高度保守的情况，可以有效地提高引物的特异性和扩增效率。
另一种常用的引物设计方法是基于引物特性的方法。
在这种方
法中，可以根据引物的特性来设计引物，例如引物的长度、GC含量、熔解温度等。
通过调整这些引物特性，可以提高引物的特异性和扩
增效率。
同时，还可以利用一些引物设计软件来辅助设计引物，这
些软件可以根据一定的算法和模型来预测引物的性能，提高引物设
计的准确性和效率。
除了以上介绍的两种方法外，还有一些其他的引物设计方法，
例如基于结构的方法、基于引物库的方法等。
这些方法都有各自的
优缺点，可以根据实际情况来选择合适的方法进行引物设计。
总的来说，设计引物的方法是一个复杂而又重要的过程。
在进行引物设计时，需要考虑到目标序列的特点、引物的特性以及实验条件等多个因素。
通过选择合适的引物设计方法，可以设计出具有较高特异性和扩增效率的引物，从而提高PCR扩增和测序结果的准确性和可靠性。
希望本文介绍的引物设计方法能够对研究人员在实验中有所帮助。
引物设计——手把手教新手
②Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。
⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。
3、用Oligo验证评估引物
①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。
引物设计知识点汇总
引物设计知识点汇总引物设计在分子生物学和遗传学研究中起着至关重要的作用。
引物是用于特异性扩增DNA片段的短寡核苷酸序列，需要准确设计以保证扩增效率和特异性。
本文将汇总引物设计的相关知识点，包括引物选择、引物设计策略和引物设计工具等。
一、引物选择引物的选择是引物设计的第一步，关键点如下：1. 引物长度：一般选择18-22个碱基对的短寡核苷酸作为引物长度，过短的引物可能导致非特异性扩增，过长的引物则增加了扩增难度。
2. 引物的GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致不稳定的引物结合和扩增效率下降。
3. 引物的翻译调谐能力：引物的序列应尽可能避免出现自身互补的二级结构，避免引物之间的相互结合，以保证扩增特异性。
4. 引物的特异性：引物应具有较高的特异性，即只特异性地扩增目标DNA片段，而不扩增非目标DNA。
二、引物设计策略在引物设计过程中，有以下几种常用的引物设计策略：1. 引物序列比对：将引物序列与目标序列比对，选择引物与目标序列高度互补的区域作为引物的设计区域。
2. 引物性能评估：使用引物设计工具对设计的引物进行性能评估，评估指标包括特异性、互补性、剪切位点等。
3. 引物序列调整：根据引物评估的结果，对引物序列进行调整，如调整引物的长度、GC含量等。
4. 引物结构优化：通过调整引物的二级结构和碱基组成，优化引物的稳定性和特异性。
三、引物设计工具引物设计工具可以帮助研究人员快速设计合适的引物，常见的引物设计工具有：1. Primer3：Primer3是一个广泛使用的引物设计软件，提供了丰富的设计选项和参数调整，可以根据用户需求生成高质量的引物序列。
2. NCBI Primer-BLAST：NCBI Primer-BLAST结合了引物设计和引物特异性评估的功能，能够为用户提供特异性较高的引物设计方案。
3. OligoAnalyzer：OligoAnalyzer是一款在线工具，可以评估引物的各项性质，如熔解温度、稳定性等。
引物设计的详细步骤
引物设计是PCR（聚合酶链式反应）技术中的关键步骤，以下是引物设计的详细步骤：选择合适的引物长度：通常选择18-30个核苷酸长度的引物。
引物太短可能降低特异性，
而太长则可能导致非特异性结合。
选择合适的引物GC含量：通常选择40%-60%的GC含量。
GC含量过高或过低都可能
影响PCR的效率。
避免引物二聚体和发夹结构：这些结构可能导致引物自身结合，从而影响PCR的效率。
可以使用软件工具检查引物的这种可能性。
避免引物间的互补：引物之间互补的序列可能导致引物结合，从而影响PCR的效率。
选择合适的引物位置：引物应位于目标基因的特异区域，通常选择基因的编码区。
此外，应避免选择有高突变率的区域，这可能影响引物的特异性。
使用软件进行引物设计：有许多在线和离线软件可以帮助设计PCR引物，如Primer3、Oligo 等。
这些软件可以根据输入的基因序列自动设计和选择最佳的引物。
实验验证：即使通过软件设计的引物看起来很好，也需要在实验中进行验证，以确保其特异性、有效性和可靠性。
引物浓度和退火温度的优化：引物的浓度和退火温度也是PCR的重要参数，需要针对特定的反应条件进行优化。
请注意，对于具体的实验和目的，可能需要更具体和详细的设计考虑，建议咨询相关领域的专家或具有丰富经验的实验员。
引物设计的详细步骤
引物设计的详细步骤详细步骤如下：步骤一：了解引物设计的基本原理引物设计是指为特定的DNA序列设计一对合适的引物，以便在PCR反应中扩增目标DNA序列。
引物是PCR反应的关键组成部分，引物的选择和设计对于PCR扩增的成功率和特异性非常重要。
因此，了解引物设计的基本原理对于有效设计合适的引物至关重要。
步骤二：确定PCR反应的目标序列在设计引物之前，我们需要确定PCR反应的目标序列，即我们需要扩增的DNA区域。
这个目标序列可以是已知的基因序列，也可以是未知的区域。
确定目标序列后，我们可以继续设计引物。
步骤三：确定引物的一些基本参数在设计引物之前，我们需要确定一些基本的参数，以便帮助我们选择合适的引物。
这些参数包括引物的长度、GC含量、Tm值以及避免二聚体形成等。
引物长度：通常来说，引物的长度应在18-25个核苷酸之间。
过长的引物可能导致不特异的扩增产物的形成，而过短的引物则可能导致低扩增效率。
GC含量：引物的GC含量对于引物的稳定性和特异性有影响。
在正常情况下，引物的GC含量应在40%-60%之间。
Tm值：引物的Tm值是指引物在PCR反应中的解离温度。
Tm值过低可能导致非特异的扩增产物的形成，而Tm值过高则可能导致低扩增效率。
避免二聚体形成：在设计引物时，我们还需要考虑引物之间的互补性以及避免引物形成二聚体。
引物之间的互补性可能导致引物形成二聚体，从而降低PCR反应的效率和特异性。
步骤四：选择合适的引物设计工具目前有很多在线引物设计工具可供选择，例如NCBI Primer-BLAST、OligoAnalyzer等。
这些工具可以根据输入的目标序列帮助我们快速选择合适的引物。
此外，还可以使用一些商业引物设计软件，如Primer Premier等。
步骤五：进行引物特异性分析设计好引物后，我们需要进行引物特异性分析，确保引物只扩增目标序列而不扩增其他非特异性产物。
这可以通过BLAST或其他相似性工具来完成。
特异性分析的目的是排除可能存在的非特异性扩增产物，以确保PCR反应的准确性和特异性。
lamp引物设计入门
选中Nucleotide 在此处输入需要查找的信息LAMP引物设计简介第一部分，如何查找序列首先，登录NCBI(美国国立生物技术信息中心)的网站，网址/，查找我们所需要的序列，具体操作如下：点开NCBI的主页，点开All Datebases，选中下拉菜单中的Nucleotide，然后在右边对话框中输入我们所需要查找的物种的拉丁名以及基因的英文名称。
比如说我要查找大肠杆菌的16S rDNA的序列，那么只需要将大肠杆菌的拉丁名Escherichia coli以及16S rDNA输入即可，如下图所示，然后点击search。
如果NCBI的GenBank数据库有这些序列，那么我们就可以找到我们所需要的序列了。
当然，数据库中可能会出现很多相关的序列，这时我们需要自己慢慢查找自己需要的序列信息，如下图所示：接下来我们就浏览这些信息，然后将我们需要的信息复制下来，粘贴到TXT或者Word里。
这里我们示例选中的是第20条信息，当然你可以打开所有的你需要的信息。
如下图所示，我们可以得到基因的全部信息，包括来源、出自那片文献、核酸序列等等。
这样，我们的序列查找就完成了。
当然并不是所有物种的基因都可以在这里找到，在查不到的情况下，就需要我们自己通过PCR的方法将我们所需要的基因扩增出来，然后测序获得序列信息。
第二部分序列比对目前有一些分子生物学软件可以用于序列比对分析，像DNASTAR、ClustalW、MEGA等等，这里我们以MEGA5.0为例进行讲解。
首先，将目标序列和其它需要与其比对的序列放入一个文本文档中，以大肠杆菌的16S rDNA为例，格式如下图所示：打开MEGA5.0软件，点击Alignment的下拉菜单，选取Alignment的下拉菜单，选取Edit/Build Alignment，出现一个Alignment Editor的对话框，然后选择Creat a new alignment，点击OK。
出现下面的对话框，选择DNA软件就会出现下图的界面，单击Edit，选择下拉菜单中的Insert Sequence From File然后我们就把大肠杆菌的16S rDNA的序列及其他细菌的16S rDNA序列上传，出现下图的对话框，点击Alignment，选择下拉对话框的Align by ClustalW，对这个序列进行比对。
引物设计——手把手教新手
引物设计——手把手教新手引物设计是指在实验室中用于特定目的的DNA序列，用于扩增特定的DNA片段。
引物设计在分子生物学研究和遗传工程方面起着至关重要的作用。
对于新手来说，如何设计合适的引物是一个基础且重要的技能。
下面将以一种扩增人类基因的引物设计为例，手把手地教新手进行引物设计。
首先，我们需要确定扩增的目标基因。
假设我们的目标基因是人类TNF-α基因。
TNF-α是一种调节免疫反应的细胞因子，与一些疾病如炎症性疾病、自身免疫性疾病等密切相关。
因此，深入研究TNF-α基因的功能和表达是非常重要的。
第二步是获取TNF-α基因的序列。
我们可以在公共数据库如NCBI （National Center for Biotechnology Information）中人类TNF-α基因的序列。
在NCBI的网站上，可以输入关键词“human TNF-alpha gene sequence”，并选择合适的结果进行。
我们可以找到人类TNF-α基因的RefSeq基因组序列。
然后，我们需要对所获得的基因序列进行分析，以确定扩增的目标区域。
在TNF-α基因中，选择合适长度的外显子或启动子区域作为目标区域进行扩增。
在选择时，需要考虑该区域的特异性和扩增效率。
接下来，我们需要使用一些在线工具来进行引物设计。
有许多免费的引物设计工具可供选择，如Primer3、NCBI Primer-BLAST等。
在这里，我们将使用Primer3进行引物设计。
在Primer3的网站上，可以将TNF-α基因的目标区域序列粘贴到“SEQUENCE INPUT”输入框中。
然后，可以设置一些参数，如引物长度、Tm值、GC含量等。
对于引物长度，通常选择18-25个核苷酸；Tm值通常在55-65°C之间；GC含量通常在40-60%之间。
设置好参数之后，点击“PICK PRIMERS”按钮，即可获得计算结果。
得到计算结果后，将得到一对引物的序列和其他相关信息，如引物的Tm值、GC含量、特异性等。
引物设计（特别有用,良心推荐）
引物设计（特别有用,良心推荐）引物篇1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
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Frq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件 中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。
用Oligo 设计引物时的3个标准
Tm 值曲线以选取5’到3’的下降形状有 利于引物引发聚合反应。 Frq 曲线宜选用3’端Frq 值相对较低的 片段。 Δ G 值在5’端和中间值比较高，而在3’ 端相对低
Primer Premier 5.0 的使 用技巧简介
主要功能: 1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析
简并引物设计
根据氨基酸序列来设计引物DNA引物 Premier Primer 5提供了8种生物遗传密 码使用的偏好选择
1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear） 2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion） 3、支原体（Mycoplasma） 4、植物线粒体（Plant Mitochondrion） 5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion） 6、一般标准（Standard） 7、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion） 8、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）
一般原则
6. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切 位点，应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定。
一般原则
7. 引物二级结构对PCR反应的影响。 尽可能少的引物二聚体。
常用的引物设计软件
Oligo 6 （引物评价）* Primer Premier （自动搜索）* Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar Primer3 （在线服务）*
一般原则
3，引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位 碱基在错配位置导致不同的扩增效率 ，末位碱基为A 的错配效率明显高于 其他3 个碱基，因此应当避免在引物 的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体 或发夹结构也可能导致PCR 反应失败 。5’端序列对PCR 影响不太大，因此 常用来引进修饰位点或标记物。
PCR引物设计及相关软件使 用
主要内容
背景 PCR引物设计原则 常用PCR引物设计软件 Primer Premier 5.0 介绍 Oligo 6.22 介绍 在线Primer3 介绍
PCR
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体 外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率 高、快速、简便、重复性好、易自动化等突 出优点；能在一个试管内将所要研究的目的 基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万 乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可 从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增 出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。
一般原则
引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp ，但不应大于38。 引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物 长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。 例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存 在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个 长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点 只有1/400个. 较长的引物（28-35bp) 一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用 于产生一些突变位点
选中引物
上游引物
下游引物 只是示意图
引物分析
首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体 形成的可能性。
引物分析
二项检查是发夹结构（hairpin）；与 二聚体相同，发夹结构的能值越低越 好。
引物分析
第三项检查为GC 含量，以45-55％为 宜。 第四False priming 检查
引物分析 Key information of primer
一般原则
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%， 过高或过低都不利于引发反应。上下 游引物的GC含量不能相差太大。 不同的算法推荐45-55%或50-60%
一般原则
5. ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由 能，该值反映了双链结构内部碱基对 的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值较 低（绝对值不超过9），而5’端和中间 ∆G 值相对较高的引物。引物的3’端的 ∆G 值过高，容易在错配位点形成双 链结构并引发DNA 聚合反应。（能值 越高越容易结合）
PCR引物设计
引物设计是PCR 技术中至关重要的一 环。使用不合适的PCR 引物容易导致 实验失败：表现为扩增出目的带之外 的多条带（如形成引物二聚体带）， 不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。 可以直接提交模板序列到特定网页， 得到设计好的引物，也可以在本地计 算机上运行引物设计专业软件。
Per 25-mer
GC% graph
Per 25-mer
Stability
Per 5-mer
Oligo 6.44 使用说明
主要功能：专门的引物设计软件
Oligo 6.44 启动界面
Open sequence file
3个弹出窗口
Melting temperature
∆G Internal Stability
引物设计界面 First you can design the primer
manually
Sense strand or anti-sense strand
Useful information of the primer
引物搜索选项设定
引物类型 搜索模式 引物长度
5’引物位置范 围
3’引物位置范 围
Dimer and cross Dimer Hairpin
GC%
Total PCR information
Final PCR information
Search for primer using Oligo 6.44
Search primer
Online primer3 service
/
引物设计的原则
引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚 体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
具体因素
如引物长度（primer length），产物长度 （product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部 稳定性(internal stability, 用∆G 值反映 )，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹 结构（duplex formation and hairpin）的 能值，在错配位点（false priming site） 的引发效率，引物及产物的GC 含量（ composition），等等。必要时还需对引物 进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进 突变等。
Tm值的计算 一般的公式 Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 对于长一些的引物可用更为准确的 nearest-neighbor （Frier et al. (1986) ）
一般原则
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较 高，尤其是3’端相似性较高的序列， 否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC， 也会使错误引发机率增加。
产物大小范 围
搜索结果
28对引物 引物分值 100分为满分 每对引物的信 息
双击选中一对 引物
回到主窗口
引物信息
引物及产物信息
是否出现 hairpin,dimer,false priming and cross dimer
一对理想的引物应当不存在任何一种上述结 构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有 But …引物编辑Fra bibliotek引物编辑
Edit primer here
Analysis the edit result
Accept the edit result Return to the main window
Some other useful function of PP5
Enzyme
Melting temperature graph
Primer Premier 5.0使用介绍 (1) Load sequence
Preimer Premier 启动界面
基本信息
Sequence name Original sequence
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好