引物设计部分使用说讲义明初学者超级推荐
引物设计-初学者超级推荐
Frq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件 中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。
用Oligo 设计引物时的3个标准
Tm 值曲线以选取5’到3’的下降形状有 利于引物引发聚合反应。 Frq 曲线宜选用3’端Frq 值相对较低的 片段。 Δ G 值在5’端和中间值比较高，而在3’ 端相对低
Primer Premier 5.0 的使 用技巧简介
主要功能: 1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析
简并引物设计
根据氨基酸序列来设计引物DNA引物 Premier Primer 5提供了8种生物遗传密 码使用的偏好选择
1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear） 2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion） 3、支原体（Mycoplasma） 4、植物线粒体（Plant Mitochondrion） 5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion） 6、一般标准（Standard） 7、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion） 8、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）
一般原则
6. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切 位点，应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定。
一般原则
7. 引物二级结构对PCR反应的影响。 尽可能少的引物二聚体。
常用的引物设计软件
Oligo 6 （引物评价）* Primer Premier （自动搜索）* Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar Primer3 （在线服务）*
引物设计的原理和程序
1 引物的设计以及初步筛选引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成的，目前运用软件Primer Premier 5 或美国 whitehead 生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费在线PCR引物设计程序 Primer 3来设计引物，再用软件Oligo 6进行引物评估，就可以初步获得一组比较满意的引物。
但是对于初学者来说，运用软件和程序来设计引物好象无从着手，其实只要我们掌握了引物设计的基本原则和注意事项，所有问题便迎刃而解。
因为无论是软件还是程序，都是以这些基本原则和注意事项为默认标准来进行引物设计的。
所以，我们在进行引物设计的时候大可不必在软件和程序的参数上花费过多的时间来思考，如果没有特殊要求我们完全可以把一些参数设为默认值。
下面我们主要讨论一下引物设计的原则和注意事项。
①引物的长度一般为15-30 bp，最好在18~24 bp，因为太短易形成错配(F alse priming) 降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量[21。
②引物在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。
特别是3’端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。
③引物序列的GC 含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或C。
④DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5’端向3’端递减，3’端AG最好不要高于9．0 keaf mol[31。
⑤避免形成稳定的引物二聚体(Dimer and Cross DimeO 和发夹结构(Hairp in)，AG高于4．5 keal／mol时易引发上述两种结构的产生。
⑥引物所在的模板区域应该位于外显子区，最好跨越一个内含子区，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。
⑦如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100—600 bp比较理想。
而以m RNA为模板设计引物时，产物长度在150—300 bp比较理想。
引物设计——手把手教新手
②Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。
⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。
3、用Oligo验证评估引物
①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。
引物设计知识点汇总
引物设计知识点汇总引物设计在分子生物学和遗传学研究中起着至关重要的作用。
引物是用于特异性扩增DNA片段的短寡核苷酸序列，需要准确设计以保证扩增效率和特异性。
本文将汇总引物设计的相关知识点，包括引物选择、引物设计策略和引物设计工具等。
一、引物选择引物的选择是引物设计的第一步，关键点如下：1. 引物长度：一般选择18-22个碱基对的短寡核苷酸作为引物长度，过短的引物可能导致非特异性扩增，过长的引物则增加了扩增难度。
2. 引物的GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致不稳定的引物结合和扩增效率下降。
3. 引物的翻译调谐能力：引物的序列应尽可能避免出现自身互补的二级结构，避免引物之间的相互结合，以保证扩增特异性。
4. 引物的特异性：引物应具有较高的特异性，即只特异性地扩增目标DNA片段，而不扩增非目标DNA。
二、引物设计策略在引物设计过程中，有以下几种常用的引物设计策略：1. 引物序列比对：将引物序列与目标序列比对，选择引物与目标序列高度互补的区域作为引物的设计区域。
2. 引物性能评估：使用引物设计工具对设计的引物进行性能评估，评估指标包括特异性、互补性、剪切位点等。
3. 引物序列调整：根据引物评估的结果，对引物序列进行调整，如调整引物的长度、GC含量等。
4. 引物结构优化：通过调整引物的二级结构和碱基组成，优化引物的稳定性和特异性。
三、引物设计工具引物设计工具可以帮助研究人员快速设计合适的引物，常见的引物设计工具有：1. Primer3：Primer3是一个广泛使用的引物设计软件，提供了丰富的设计选项和参数调整，可以根据用户需求生成高质量的引物序列。
2. NCBI Primer-BLAST：NCBI Primer-BLAST结合了引物设计和引物特异性评估的功能，能够为用户提供特异性较高的引物设计方案。
3. OligoAnalyzer：OligoAnalyzer是一款在线工具，可以评估引物的各项性质，如熔解温度、稳定性等。
PCR使用说明引物设计技巧
PCR使用说明引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，可用于扩增DNA片段以及进行基因分型、疾病诊断和DNA克隆等应用。
在PCR实验中，引物的设计是非常关键的步骤之一，合理的引物设计可以确保PCR反应的特异性和高效性。
以下是一些PCR引物设计的技巧和原则。
1.引物长度：引物长度应该在18到30个核苷酸对之间，一般来说，较短的引物可以提高反应的特异性，但也容易导致非特异性扩增。
较长的引物可以提高特异性，但也会降低PCR反应的效率。
2.引物的碱基组成：引物的G+C含量应在40%到60%之间，避免过高或过低的含量，以确保引物的熔解温度适中。
3.引物之间的互补性：引物之间不应有任何互补性，以避免引物之间的杂交和产生非特异性扩增。
4. 引物的熔解温度：引物的熔解温度（Tm）应该相近，通常设计为60℃至70℃之间。
可以使用一些在线工具来计算引物的Tm，例如NCBI的Primer-BLAST。
5.引物的位点选择：引物应该选择在目标序列上独特的位点，避免引物在其他不需要扩增的区域上产生扩增。
可以使用序列比对工具，如BLAST，来确定引物的特异性。
6.引物的末端设计：引物的末端应该避免酶切位点，以防止引物被酶切和降解。
此外，末端的碱基对的GC含量应保持平衡，以确保引物的稳定性。
7.引物的序列结构：引物的序列中应避免重复和倒序重复的碱基序列，因为这些序列容易形成引物间的二级结构和非特异性扩增。
8.引物的交叉反应：引物的序列应该经过认真筛选，避免与其他非目标序列发生交叉反应。
在引物设计前，可以先使用基因序列比对工具，如BLAST，来检查引物是否会与其他区域发生交叉反应。
9.引物的引导方向：引物的引导方向应与目标序列的末端互补，以确保正确的扩增方向。
总而言之，PCR引物的设计应遵循特异性、高效性和可重复性的原则。
合理设计的引物对PCR实验的成功至关重要，可以提高扩增产物的特异性和产量，并避免非特异性扩增和交叉反应的发生。
引物设计——手把手教新手
引物设计——手把手教新手引物设计是指在实验室中用于特定目的的DNA序列，用于扩增特定的DNA片段。
引物设计在分子生物学研究和遗传工程方面起着至关重要的作用。
对于新手来说，如何设计合适的引物是一个基础且重要的技能。
下面将以一种扩增人类基因的引物设计为例，手把手地教新手进行引物设计。
首先，我们需要确定扩增的目标基因。
假设我们的目标基因是人类TNF-α基因。
TNF-α是一种调节免疫反应的细胞因子，与一些疾病如炎症性疾病、自身免疫性疾病等密切相关。
因此，深入研究TNF-α基因的功能和表达是非常重要的。
第二步是获取TNF-α基因的序列。
我们可以在公共数据库如NCBI （National Center for Biotechnology Information）中人类TNF-α基因的序列。
在NCBI的网站上，可以输入关键词“human TNF-alpha gene sequence”，并选择合适的结果进行。
我们可以找到人类TNF-α基因的RefSeq基因组序列。
然后，我们需要对所获得的基因序列进行分析，以确定扩增的目标区域。
在TNF-α基因中，选择合适长度的外显子或启动子区域作为目标区域进行扩增。
在选择时，需要考虑该区域的特异性和扩增效率。
接下来，我们需要使用一些在线工具来进行引物设计。
有许多免费的引物设计工具可供选择，如Primer3、NCBI Primer-BLAST等。
在这里，我们将使用Primer3进行引物设计。
在Primer3的网站上，可以将TNF-α基因的目标区域序列粘贴到“SEQUENCE INPUT”输入框中。
然后，可以设置一些参数，如引物长度、Tm值、GC含量等。
对于引物长度，通常选择18-25个核苷酸；Tm值通常在55-65°C之间；GC含量通常在40-60%之间。
设置好参数之后，点击“PICK PRIMERS”按钮，即可获得计算结果。
得到计算结果后，将得到一对引物的序列和其他相关信息，如引物的Tm值、GC含量、特异性等。
引物设计（特别有用,良心推荐）
引物设计（特别有用,良心推荐）引物篇1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
微生物 通用引物设计-概述说明以及解释
微生物通用引物设计-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容可以包括对微生物和引物设计的简要介绍。
以下是一个例子:引言部分会对微生物和引物设计进行概述。
微生物是一类单细胞或多细胞的微小生物，包括细菌、真菌、病毒和藻类等。
这些微生物广泛存在于地球上的各个环境中，包括土壤、水体、大气等。
微生物在生态系统中起着至关重要的作用，如参与养分循环、有机物降解、生物防治等。
此外，微生物还对人类和动植物的健康具有重要影响，既可以致病也可以为人类提供有益的功能。
引物是在分子生物学研究中常用的工具，用于扩增特定基因片段或序列。
引物的设计是进行分子生物学实验的关键步骤之一。
引物必须具有与目标序列互补的碱基序列，以便能够特异性地结合并扩增目标序列。
引物设计的好坏直接关系到实验结果的准确性和可靠性。
在本文中，我们将探讨微生物的重要性以及引物设计的意义和原则。
深入了解这些内容将有助于我们更好地理解微生物世界，加强对微生物的研究和应用。
在接下来的章节中，我们将详细讨论微生物的重要性和引物设计的意义，以及引物设计的一些基本原则。
通过阅读本文，读者将能够更好地理解微生物的重要性和引物设计的关键作用。
1.2 文章结构文章结构部分的内容如下：文章结构部分旨在介绍本篇长文的整体架构和章节划分，以及每个章节的内容安排。
本文共包括引言、正文和结论三个部分。
引言部分将在开始时对微生物通用引物设计进行概述，介绍其背景和相关概念。
接着，将详细说明文章的结构，列举各个章节的标题和内容，以让读者了解全文的组织结构。
正文部分是本篇长文的核心部分，将涵盖微生物的重要性、引物设计的意义以及引物设计的原则三个小节。
在微生物的重要性一节中，将介绍微生物在自然界和人类生活中的重要作用，以引起读者对微生物的关注。
在引物设计的意义一节中，将阐述设计合适的引物对于微生物研究的重要性，以及有效引物设计的意义。
在引物设计的原则一节中，将详细解释引物设计中需要考虑的因素和原则，并介绍一些常用的引物设计方法。
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Primer Premier 5.0使用介绍(1) Load sequence Preimer Premier 启动界面
基本信息
Original sequence
Sequence name
Choose a function
ห้องสมุดไป่ตู้
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a
一般原则
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%， 过高或过低都不利于引发反应。上下 游引物的GC含量不能相差太大。
不同的算法推荐45-55%或50-60%
一般原则
5. ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由 能，该值反映了双链结构内部碱基对 的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值 较低（绝对值不超过9），而5’端和 中间∆G 值相对较高的引物。引物的 3’端的∆G 值过高，容易在错配位点 形成双链结构并引发DNA 聚合反应。 （能值越高越容易结合）
引物设计的原则
引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚 体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
具体因素
如引物长度（primer length），产物长度 （product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部 稳定性(internal stability, 用∆G 值反映 )，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹 结构（duplex formation and hairpin）的 能值，在错配位点（false priming site） 的引发效率，引物及产物的GC 含量（ composition），等等。必要时还需对引物 进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进 突变等。
Primer Premier 5.0 的使 用技巧简介
主要功能: 1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析
简并引物设计
根据氨基酸序列来设计引物DNA引物 Premier Primer 5提供了8种生物遗传密
码使用的偏好选择
1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear） 2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion） 3、支原体（Mycoplasma） 4、植物线粒体（Plant Mitochondrion） 5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion） 6、一般标准（Standard） 7、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion） 8、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）
protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好
引物设计界面 First you can design the primer manually
Sense strand or anti-sense strand
Useful information of the primer
一般原则
6. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶 切位点，应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定。
一般原则
7. 引物二级结构对PCR反应的影响。 尽可能少的引物二聚体。
常用的引物设计软件
Oligo 6 （引物评价）* Primer Premier （自动搜索）* Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar Primer3 （在线服务）*
一般原则
引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp ，但不应大于38。 引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物 长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。 例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存 在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个 长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点 只有1/400个. 较长的引物（28-35bp) 一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用 于产生一些突变位点
PCR引物设计
引物设计是PCR 技术中至关重要的一 环。使用不合适的PCR 引物容易导致 实验失败：表现为扩增出目的带之外 的多条带（如形成引物二聚体带）， 不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。 可以直接提交模板序列到特定网页， 得到设计好的引物，也可以在本地计 算机上运行引物设计专业软件。
引物设计部分使用说 明初学者超级推荐
主要内容
背景 PCR引物设计原则 常用PCR引物设计软件 Primer Premier 5.0 介绍 Oligo 6.22 介绍 在线Primer3 介绍
PCR
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体 外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率 高、快速、简便、重复性好、易自动化等突 出优点；能在一个试管内将所要研究的目的 基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万 乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可 从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增 出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。
Tm值的计算 一般的公式
Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 对于长一些的引物可用更为准确的 nearest-neighbor （Frier et al. (1986) ）
一般原则
1. 2. 引物序列在模板内应当没有相似 性较高，尤其是3’端相似性较高的 序列，否则容易导致错配。引物3’ 端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。
一般原则
3，引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位 碱基在错配位置导致不同的扩增效率 ，末位碱基为A 的错配效率明显高于 其他3 个碱基，因此应当避免在引物 的3’端使用碱基A。另外，引物二聚 体或发夹结构也可能导致PCR 反应失 败。5’端序列对PCR 影响不太大， 因此常用来引进修饰位点或标记物。