T-RFLP精讲
免疫2015课件T细胞-PPT文档
主要存在于活化的CD4+T细胞，起信号转导作用。
ü LFA-1; ICAM-1
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✓CD2（LFA-2, SRBC受体）
存在所有成熟T细胞表面的分子，可以结合绵羊红 细胞，形成玫瑰花环.
T cell
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u 丝裂原受体
T细胞表面有多种与丝裂原结合的膜分子
– ConA: T细胞 – PHA：T细胞 – PWM：T和B细胞
• CD8
存在于Tc细胞表面，主要与MHC I 类分子结合， 起信号转导作用
CD4和CD8分子又称为T细胞的共受体。
11
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u 共刺激分子
ü CD28
存在于大部分成熟T细胞，是协同刺激分子B7 的受体，提供细胞协同刺激信号。
ü CTLA-4(CD152)
表达于活化的T细胞，是协同刺激分子B7的受体， 亲和力高于CD28，提供细胞抑制信号。
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T细胞的检测
免疫荧光（Immunofluorescence）
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荧光标记流式细胞仪检测(Flow Cytometry,FCM)
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E-玫瑰花环实验
T cell
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淋巴细胞转化实验
（Lymphocyte transformation reaction） 淋巴细胞培养 加入T细胞丝裂原 观察转化为T淋巴母细胞的数量 T细胞丝裂原主要包括PHA和ConA
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CD8+ 具有特异性杀伤靶细胞作用的T细胞
杀伤机制：
• 分泌穿孔素、颗粒酶、淋巴毒素 • Fas /FasL途径诱导细胞凋亡
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CTL杀伤病毒感染的靶细胞
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• 调节性T细胞（Treg, T regulatory cell）
RFLP分子标记及其在牧草研究中的应用
RFLP分子标记及其在牧草研究中的应用史威威,董宽虎山西农业大学动物科技学院,山西 太谷 (030801)E-mail:shiweiwei45@摘 要：RFLP分子标记是用限制性酶(RE)消化不同个体的同源DNA分子,经电泳表现的限制性片段长度的差异。
它反映了DNA 分子水平上的变异,可能是限制性内切酶识别位点的改变,也可能是部分片段的缺失、插入、易位、倒位等, 显示出丰富的多态性。
本文综述了RFLP分子标记技术在牧草个体识别、绘制遗传图谱、目的基因定位、检测群体内或群体间序列差异程度以及辅助育种研究中的应用等，并对该技术在牧草研究中的应用作了展望。
关键词：RFLP分子标记;牧草研究;应用;展望引 言：分子标记技术从20世纪80年代初期发明以来在人类、动物、植物以及微生物的研究中得到了广泛的应用。
广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA 序列或蛋白质。
狭义的分子标记只是指DNA标记，而这个概念现在被广泛采纳[1]。
DNA 分子标记技术（DNA molecular markers）的本质是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA 片段。
由于DNA分子中碱基的缺失、插入、易位、倒位、重排或由于长短与排列不一的重复序列等而产生多态性，DNA分子标记便是检测这种多态性的技术，故DNA 分子标记技术又称作分子诊断技术[2]。
DNA分子标记主要指RFLP(restriction fragment length polymorphism 限制性片段长度多态性)、RAPD (random amplified polymorphic DNA 随机扩增多态性DNA)、SSR(simple sequence repeats 简单重复序列)和AFLP(amplified fragment random polymorphism 扩增片段长度多态性)。
本文主要介绍RFLP分子标记。
末端限制性片段长度多态性技术_T_省略_微生物群体分析上的应用与技术优化_李献梅
中国农业大学学报 2009,14(4):1-9Journal o f China A g ricultur al U niv ersity末端限制性片段长度多态性技术(T -RFLP)在微生物群体分析上的应用与技术优化李献梅 王小芬 崔宗均*(中国农业大学农学与生物技术学院/中国农业大学生物质工程中心,北京100193)摘 要 末端限制性片段长度多态性技术(T-RFL P)是以荧光标记引物P CR 为基础,根据末端限制性片段长度区分出微生物群体组成的一种微生物群体图谱法。
本文综述了该方法在群体微生物分析上的应用及DN A 提取、PCR 扩增、酶切和数据分析等步骤的技巧与优化,总结了科学应用该技术的要求以及和多重PCR 、gy r B 基因等相结合的观点。
关键词 T -RF LP ;微生物群体;图谱分析;PCR;克隆中图分类号 Q 936 文章编号 1007-4333(2009)04-0001-09 文献标志码 A收稿日期:2008-10-27基金项目:国家/十一五0科技支撑计划(2006BAD07A 01;2006BA D25B04)第一作者:李献梅,博士研究生,E -mail:staro fchina@g 通讯作者:崔宗均,教授,主要从事生物质资源利用与微生物生态研究,E -mail:acuizj@Applications and optimizations of T -RFLP in fingerprintingenvironm ental microbial populationsLI Xian -mei,WANG Xiao -fen ,CUI Zong -jun *(College of Agronomy and Biotechnology/Center of Biomas s Engineeri ng,Chi na Agricul tural U nivers i ty,Bei jing,100193,China)Abstract Terminal re stric tio n fra gment leng th polymorphis m (T -RFLP)is one o f micro bia l popula tio n fing erprinting me tho ds tha t is ba sed o n labele d primers -PCR to ide ntify microbial co mposition a ccording to diffe re nt terminal re stric tio n frag me nt leng ths.The applic ations and te chnica l o ptimizations we re o ve rv iew ed o f T -RFLP thro ugh the pro cedures of DNA preparation,PCR,enzyme dig estion and da ta analysis.The sc ientific applic ation re quire me nts and new view s of combination with multiple -PCR o r g yr B g e ne we re dra wn.Key words T -RFLP;microbial po pulation;fing erprinting ana lysis;PCR;clone libra ry当前环境微生物组成及生态研究已经成为微生物领域的一大热点[1]。
酶联荧光RFLP技术标准
酶联荧光RFLP技术标准1 全血或冻溶血抽提DNA1.1 全血溶解注：1）细胞溶解液（cell Lysis Buffer）和蛋白酶K（pro-k）在使用时，置放在冰盆内。
2）蛋白溶解液（Protein Lysis Buffer）应放在室温。
3）操作中全部试剂的用量是依据0.5ml血液样本而设定的，应精确保用各试剂用量。
①移取0.5ml全血，加入标记5ml管。
②加1.8ml细胞溶解液到各试验管，加盖，倒转数次使其混匀，置于冰盆内待到全部试验样本操作完备后，准备离心。
③在水平台式离心机上离心，1250rpm，离心时间5min，注意在离心前一定要配平。
④从离心机取出样本，仔细地倒去上清液，用新华滤纸吸取残剩上清液。
注意，不要将离心沉淀物（pellet）丢掉。
假若沉淀物被悬浮，就将样本管垂直放置，小心吸弃上清液。
⑤在旋涡混合器上，用残存上清液悬浮沉淀团。
⑥每样本管加2ml细胞溶解液，加盖，在旋涡混合器上，混匀沉淀团，重复第3-4步骤。
⑦再在旋涡混合器上，混匀样本。
⑧在第6步骤离心时，按下列配方准备蛋白酶混合液。
每个样本×10 ×20 ×30 ×40 ×50 ×60 Protein233.8μl 2.338ml 4.676ml 7.014ml 9.352ml 11.69ml 14.028ml lysisBufferPro-k 3.7μl 37μl 74μl 11μl 140μl 185μl 222μl SDS 12.5μl 125μl 250μl 375μl 500μl 625μl 750μl Total 250μl 2500ml 5ml 7.5ml 10ml 12.5ml 15ml⑨每样本管加蛋白酶混合液250μl，加盖，轻轻地倒转数次，禁止剧烈振荡。
⑩将全部样本管放入恒温水浴摇床内，37±1℃培养2hrs，中速摇动。
⑾每管加50μl高氯酸钠（Sodium Porchlorate）加盖，轻轻地倒转数次，进入抽取步骤。
PCR—RFLP
三、实验目的
通过此实验操作， 通过此实验操作，掌握琼脂糖凝胶电 泳技术、 泳技术、DNA的分离鉴定及基因型判 的分离鉴定及基因型判 定方法。 定方法。
实验材料、 四、实验材料、仪器和试剂
材料： 材料：DNA样品 样品 仪器：电泳液、水平凝胶电泳槽、移液器、 仪器：电泳液、水平凝胶电泳槽、移液器、 紫外透射仪、 头 紫外透射仪、Tip头 试剂
PCR反应体系 反应体系
DNA模板 模板 dNTP Taq DNA聚合酶 聚合酶 引物 Mg2+ 缓冲液
PCR反应程序 反应程序
预变性 94℃ 3~5min ℃ 35循环： 循环： 循环 30s~1min 变性 94 ℃ 退火 50~65 ℃ 30~60s 1~2min 延伸 72 ℃ 5~10min 后延伸 72 ℃
动物遗传学实验
鸡基因组的PCR-RFLP分析 实验七 鸡基因组的 分析
一、实验方法
1、鸡基因组DNA的提取 、鸡基因组 的提取 2、目的基因的PCR扩增 、目的基因的 扩增 3、内切酶消化PCR产物 、内切酶消化 产物 4、琼脂糖凝胶电泳（检测基因型） 、琼脂糖凝胶电泳（检测基因型）
鸡DNA的获取 的获取
PCR产物电泳检测结果 产物电泳检测结果
内切酶消化PCR产物 产物 内切酶消化
PCR产物 缓冲液 内切酶 产物+缓冲液 产物 缓冲液+内切酶
5‘-TCATGA-3’ 3’-AGTACT-5’
电泳检测基因（ ） 电泳检测基因（1）
A B
电泳图谱
AA BB AB
电泳检测基因（ ） 电泳检测基因（2）
六、结果分析
1. 将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于自动成像系统的平脑中观察图像； 开通紫外光 3.关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像； 关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像； 关上紫外光电源 4.根据图像结果判定不同个体基因型。 根据图像结果判定不同个体基因型。 根据图像结果判定不同个体基因型
RFLP限制性内切酶片段长度多态性
一、基本原理限制性核酸内切酶（restriction end nuclease）能够识别DNA双链上特异的碱基序列并能将之切断。
不同的限制性核酸内切酶有各自特异的识别序列。
在同源染色体相应的DNA区段，用一种限制性核酸内切酶消化，由于碱基组成不同，就会产生不同长度的酶切片段，然后用标记好的相应的DNA探针与这些片段杂交，显示出的图谱就可以反映出基因组DNA碱基序列组成是否存在差异。
这一技术的基础是通过限制性核酸内切酶切片段长度多态性来揭示DNA碱基序列组成的异同，因而称为限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorp hism，缩写为RFLP）技术。
它可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、还是由缺失、插入造成的。
二、RFLP技术的基本步骤这一技术主要包括三大步骤：1、靶DNA的准备先将基因组DNA抽提出来，选用合适的限制性核酸内切酶酶解基因组DNA，将酶解出来的具有各种长度的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳分离，使其按片段的长短排列，将D NA片段变性后转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，称印迹（Southernb1ot）转移，并在80℃烘烤或用长波紫外线照射，将DNA固定在膜上。
2、核酸探针的标记将准备作为探针的DNA片段纯化（这些DNA片段可以是基因组DNA的一个片段，或是cDNA，或是人工合成的寡核苷酸），用放射性元素（如α－32p）或非放射性元素（如Dig－dUTP等）标记，经纯化后再用。
探针的获得最先用内切酶处理植物的 DNA获得DNA片段，再将其重组到质粒上，使它能插人细菌寄主细胞并在里面进行复制，通过稀释繁殖，每个菌落一般由携带某一段 DNA的细菌繁殖而来，这种在细菌细胞中扩增、纯化DNA 片段的过程称做DNA克隆,这—系列的克隆经放射性同位素标记就成了一系列的探针。
3、杂交显示将标记好的探针与硝酸纤维膜或尼龙膜上的单链核酸杂交，洗膜去除未杂交的标记探针后，进行放射自显影或加入酶的底物进行显色反应，再对显示出来的谱带进行分析。
RFLP-ppt精讲
01 2)变异更稳定。其表现不受环境条件的影响, 其他变异均是从表型或基因作用产物来研究 遗传和变异的 , 而 RFLP 则是直接研究基因的 构成
02
03
比生化标记更丰富,区分能力更强。
其标记为共显性 , 能区分纯合显性和杂 合显性,而且非等位基因间无互作。
04
2 基本实验程序和主要影响因素
01
DNA的提 取
14cm左右停止。
基本实验程序
04
转移
DNA支持膜现在均采用带正电荷的尼龙膜。将经酸碱
处理的琼脂糖凝胶放在玻璃板上 , 上面铺上尼龙膜,
其上压约10cm 的吸水纸,用磷酸转移液, 转移24h后, 取出尼龙膜,在94℃烘烤2h以固定DNA。
放射自显影 标记探针,每泳道探针DNA用量为5ng。分子杂交,探针与尼龙膜 保温在65℃ ,缓慢转动16～18h。洗膜压片,取出杂交膜,用SSC、SDS洗去 末杂交上的探针, 直到杂交膜上的放射性到100～200counts /min为止。 用保鲜膜将尼龙膜包好, 压上X光片, 在- 70℃下放射自显影5～ 15d 。洗 片、显影结束后取出,定影、凉干保存。
2 RFLP用于作物育种研究
一副高度饱和的 RFLP 连锁图 , 为基因选择、回交育种、预 测杂种优势以及基因克隆等方面提供了诸多方便。利用与 目标基因连锁的 RFLP 标记进行间接选择 , 就能克服传统育 种方法进行基因选择和回交育种中所遇到的种种困难和麻 烦。因为知道目的基因与 RFLP 标记连锁 , 这使我们相信在 选择 RFLP 的同时 , 也选择了目的基因 , 因为使二者分开的 重组机率太小。另一方面 , 连锁的 RFLP 标记能在植株苗期 进行测定记录 , 因为只需提取少量 DNA, 故不必毁坏整个植 株。不带目的基因的植株能在早期被剔除 , 节省了空间和 费用。
RFLP,SNP标记
SNP的应用
1、人类基因单体型图的绘制 2、SNP与疾病易感基因的相关性分析 3、指导与药物设计 通过研究SNP与个体对药物敏感或耐受的 相关性研究，可能阐明遗传因素对药效的 影响，另外，随着SNP的研究与药物基因 组学的结合，根据特定的基因型来设计药 物将成为可能。
SNP优缺点：
RFLP， SNP标标记原理及应用
——分子标记法 主讲人：石 波
四、 RFLP标记
定义：RFLP即DNA限制性片段长度多态性， 它是指应用特定的核酸限制内切酶切割有关的 DNA分子所产生出来的DNA片段在长度上的变 化。对于每一个DNA/限制性内切酶组合来说， 所产生的片段是特异性的，它能作为某一DNA （或含这种DNA的产物）所特有的“指纹” （即片段差异的多态性）。 基本原理：RFLP标记是由于不同基因型之中内 切酶位点的碱基插入、缺失、重组或突变 ,利用 限制内切酶消化基因组DNA 时 , 会产生大小
1.遗传学图的构建 结合RFLP连锁图， 任何能用RFLP探针检测出的基因及其 DNA片段都可以通过回交，快速有效地 进行转移。 2.基因定位 利用RFLP技术能够准确地 标记定位种质中的目标基因，结合杂交， 回交及组织培养等技术就可以快速有效的 将所需目标基因的DNA片段引入栽培品 种中，实现品种改良。
Байду номын сангаас
RFLP的应用
3.遗传多态性分析 运用RFLP技术可以尽 可能多地保存那些在已知位点上有异态的 品系，以求最大程度地保持品种的多样性。 4.细胞质遗传研究 RFLP技术是对DNA 序列自然变异的直接检测，只需选择 适 当的限制性内切酶或DNA探针作分子标 记，因而对植物不同种属或杂种后的的细 胞质遗传变异及基因型的鉴定具有较高的 灵活性和灵敏性。因而能较好地应用于细 胞质遗传的研究。 ←
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下面是一张酶切不完全的电泳图
四、送去做T-RFLP的测序
这个实验测序是送去生工做的测序， 用的是DNA测序仪ABI3730，大约3~4 天能拿到，因此我的实验部分大约两周 能做一次。
五、图谱分析和数据分析
这是两个 同组样本 的图谱， 波峰大致 上是相同 的，这样 表明这两 个样本数 据是比较 可靠的。
选用HhaⅠ作为实验的限制性内切酶，酶切位点是GCG^C 酶切体系采用40 μL, PCR 产物为6 μL,在37 °C 酶切6 h, 反应完成后, HhaⅠ在65 °C 水浴中20 min失活。酶切时 间一定要控制好，不能太短，酶切没有结束就停止，因此 要酶切一段时间进行一次电泳，看条带结果，决定是否停 止酶切，一般都需要4~8小时。
T-RFLP技术
桂林医学院生物技术学院
——程骏
T-RFLP简介
T-RFLP中文全称是末端限制性片段长度多态性
（Terminal restriction fragment length polymorphism ）,又可以称为16sRNA基因的末端限制 性片段分析技术。它是将目标DNA片段的一个末端(通常 是5′端)用荧光标记，这样在酶切后，分析的目标只限 于有荧光标记的末端限制性片段上。酶切后产生长度不 等的末端限制性长度片段经过毛细管电泳分离，并经ABI 自动测序仪上检测和计算后，输出末端限制性片段长度 的大小和荧光强度图。测序仪上输出的图谱含有的不同 波峰越多，则表明微生物种类越丰富。通过比较不同样 品图谱间波峰的异同，就可以得到不同样品中菌群的差 异。
T-RFLP原理
T-RFLP的技术原理是根据的保守区设计通用引物，其 中一个引物的5‘末端用荧光物质标记，常用荧光物质有 HEX,TET,6-FAM等。提取待分析样中的DNA，以它为模板 进行PCR扩增，所得到的PCR产物的一段就带有这种荧光 标记，然后PCR产物用合适的限制性内切酶进行消化，一 般选用酶切位点为4bp的限制性内切酶。由于在不同细菌的 扩增片段内存在核苷酸序列的差异，酶切位点就会存在差 异，酶切后就会产生很多不同长度的限制性片段。消化产 物用自动测序仪进行测定，只有末端带有荧光性标记的片 段能被检测到。因为不同长度的末端限制性片段必然代表 不同的细菌，通过检测这些末端标记的片段就可以反应微 生物群落的组成情况。 这种方法还可以进行定量分析，在基因扫描图谱上， 每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段 的相对数量，即末端限制性片段的数量越大其所对应的面 积越大 。
我提取的是小鼠粪便的基因组，用自己实验室配制 的粪便基因组提取试剂盒来抽提，基因组提取的结 果良好。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
二、PCR
PCR条件： 95℃，5 min 变性95℃，30 S 退火55℃，30 S 37个循环 延伸72℃，2min 72℃，10 min，4℃保存。 然后用DNA凝胶回收试剂盒（上海中亚）对PCR产 物做一个回收，以去掉PCR反应中的杂带，保证只 有800bp大小的DNA片段，去掉杂带。
总结
IL-10基因的发现及IL-10细胞因子在动物体中的重要作用越来越 引起大家的注意，特别是其在免疫系统中的作用。通过T-RFLP技术 得到的数据，我们可以初步判定IL-10基因对于小鼠的肠道菌群是有很 大影响的，正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠之间肠道菌群存在很大差异 ，至少有一种或多种菌群在数量上差异很大。 由于在时间、知识和现有条件的情况下，这个实验没有得到关于 具体菌群方面的结论。不过仅仅是通过数据我们就能得到比较丰富的 结论了，随着T-RFLP技术越来越被广泛应用在医学、环境学、地质 地理学和微生物学的研究中，我想这项技术在国内会发挥重要作用。
T-RFLP统计学分析
对于每个图谱数据 的预处理，去除荧光强 度小于100和片段大小 ≦35或者≥500的片段数 据，将剩下片段的峰面 积进行标准化处理，并 去除相对丰度小于1％的 片段[7][8]。这批样本一共 十六个，分为对照组和 干预组，通过统计学分 析得到右边的数据，和 图谱吻合。
此外还作了聚类分析，就是将T-RFLP的数据 转换成1～0矩阵（1表示有，0表示无），利用 SPSS16.0中的聚类分析工具（Classifiyhierarchical Analysis），采用非加权配对算法平 均法对每组样本进行聚类分析。 接下来用软件SPSS16.0进行物种丰度（S） 、BCI和Shannon-Weiner指数（H）的计算，就 不再一一赘述。
下面是一次实验十六个样本PCR后的电泳图，我们PCR得到的DNA 片段一定要是800bp位置的，不可出现杂带，而且对于PCR的污染 要求很严格，因为这个实验用的引物是通用引物，基本上所有的生 物基因组都可以P出这样的条带，所以对于所用试剂、耗材、环境要 求很高，否则最后结果没有说服性。
750bp
三、酶切
我的实验目的和实验方法
最初是要研究IL-10这个基因对于人体有什么 作用，因此用了两种小鼠来做研究，一组是正常 小鼠，一组是IL-10基因敲除的小鼠，通过TRFLP这个技术来研究两组小鼠在肠道菌群上的 差异，从而了解IL-10基因对于动物肠道菌群的 影响，得到这一方面的研究成果。
具体的实验步骤
一、提取样本的基因组
T-RFLP流程
简单的流程图：
PCR（纯化）
3.1把样本的基因组提取出来 3.2以提取出来的基因组DNA为模板进行PCR反应，引物的5′端带有荧光标记物
3.3将纯化过的PCR产物用限制性酶进行酶切
3.4将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳得到大概的电泳条带图，以方便检测酶切是否 完全 3.5酶切产物在DNA测序仪(ABI 3730，美国)中进行毛细管电泳检测，所得电泳图 谱用片段分析软件Genescan(ABI，美国)进行分析 3.6图谱分析及数据分析