调肝理脾方干预原发性胆汁性肝硬化小鼠肝损伤的组织学观察

科技股份有限公司， 许可号： SCXK（ 京） 20090004 。 试剂与仪器 （ 德国福克制药股份有限公司， 规 格 250mg / 粒） 、 聚肌胞苷酸
Email： 23945946@ qq． com ! 基金项目： 山西省卫生和计划生育委员会科技攻关项目（ No． 201301019 ） ； △通讯作者，
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管增生及纤维化形成。高剂量组汇管区周围可见少量的淋巴细 胞浸润， 部分胆小管畸形扩张 。 Masson 染色结果显示， 正常组小鼠肝小叶结构正常， 汇管 区未见明显蓝绿色胶原纤维分布 。模型组小鼠肝脏汇管区扩大 水肿， 汇管区及纤维间隔内胆小管数量明显增加， 胆小管管腔扩 相互连接且分布异 大并扭曲， 管周有大量的蓝色胶原纤维环绕 、 常， 向四周延伸， 形成较厚的纤维间隔， 个别出现索条状增生， 但 未见形成假小叶。与模型组比较， 阳性组胶原纤维有所减少， 少 量胆小管增生。TGLP 低剂量组汇管区周围有少量的胶原纤维 生成， 胆小管增生明显， 但未见明显破坏 。中剂量组小鼠肝脏汇 管区周围未见明显的胶原纤维及胆小管增生 。高剂量组小鼠肝 脏汇管压周围有少量蓝绿色胶原纤维增生， 未见纤维间隔形成 及明显胆小管增生。 2． 2 肝组织 CK19 表达情况（ 见插页图 1 ） 正常组小鼠肝脏 汇管区周围未见胆小管增生， 管腔正常， 胆管上皮细胞形态大小 汇管 规整， 细胞界限清楚。模型组小鼠肝组织 CK19 表达明显， 区和纤维间隔内阳性胆小管数量明显增加， 管腔小而畸形， 胆管 选取与常规 上皮细胞形态大小不规则， 排列紊乱， 部分细胞消失， 肝细胞索 间出现淡染的小胆管样上皮细胞和小胆管 。 与模型组比较， 阳 汇管区周围可见少量胆小管增 性组小鼠 CK19 表达有所降低， 生， 管腔小， 部分胆管上皮细胞消失 。 TGLP 低剂量组 CK19 表 达明显， 胆小管数量增多， 管腔畸形， 部分胆管上皮细胞结构破 坏。中剂量组小鼠汇管区周围胆小管结构正常， 未见明显增生 。 高剂量组小鼠汇管区周围未见明显的胆小管增生， 个别胆管上 皮细胞消失。 2． 3 肝组织超微结构情况（ 见插页图 2 ） 正常组小鼠肝细胞 结构清晰， 胞质丰富， 核膜完整清楚， 核仁致密核大而圆， 可见糖 原颗粒和少量溶酶体。肝血窦面及胆小管腔面微绒毛丰富 。胞 质内线粒体数量多， 包膜清晰完整， 嵴清晰可见并呈平行排列，
· 36· doi： 10. 3969 / j. issn. 10050264. 2015. 01. 012
中西医结合肝病杂志 2015 年第 25 卷第 1 期
调肝理脾方干预原发性胆汁性肝硬化小鼠肝损伤的组织学观察 *
郭晓霞 李良学 武玉鹏 刘改萍 冯玛莉 么新英 △
山西省中医院肝病科
（ 山西 太原， 030012 ）
中西医结合肝病杂志 2015 年第 25 卷第 1 期 CK19 抗体（ Santa Cruz 公司） 、 兔超 （ 太原博科生物有限公司） 、 敏二步法免疫组化检测试剂盒（ 北京中杉金桥生物技术有限公 司） 、 光学显微镜（ 日本奥林巴斯） 、 多功能真彩色细胞图象分析 管理系统（ 美国 Media Cybernetics 公司） 、 透射电子显微镜 JEM超薄切片机 LKB 型（ 瑞典） 。 1011 型（ 日立公司产品） 发性胆汁性肝硬化肝组织损伤的作用机制 。 方法： 建立 C57BL /6 小鼠原发性胆汁性肝
硬化模型， 观测肝组织病理 、 超微结构。结果： 与正常组比较， 模型组细胞角蛋白（ CK19 ） 阳性表达明显， 胆管增生活跃， 胆小管数量 断裂， 大量胶原纤维沉 增多， 管腔畸形， 胶原纤维沉积明显； 透射电镜显示胞质中含有大量脂滴， 线粒体肿胀畸形， 内质网囊性扩张 、 仅有少量增生的胶原纤维， CK19 积， 周边有嗜酸性粒细胞及浆细胞聚集 。调肝理脾方组胆小管增生较模型组和阳性组明显减少， 表达明显减弱； 透射电镜显示胞质中偶见脂滴， 胆管上皮细胞增生不明显， 窦周间隙偶有少量增生的胶原纤维 。 结论： 抑制胆小管 的增生及胶原纤维的沉积可能是调肝理脾方有效干预原发性胆汁性肝硬化的重要机制之一 。 关键词 调肝理脾方； 原发性胆汁性肝硬化； 肝组织损伤； 形态学观察
原发性胆汁性肝硬化（ primary biliary cirrhosis ， PBC ） 是一 种病因不明的慢性进展性自身免疫性疾病 。 目前 PBC 的发病 机制尚不完全清楚， 推测可能与自身抗体及 HLA 基因有关
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（ TGLP） 对原发性胆汁性肝硬化小鼠肝组织病理及超微结构改 变的影响， 并对其作用机制进行探讨 。 1 1． 1 1． 2 材料与方法 动物 SPF 级 C57BL /6 小鼠， 雌性， 购自北京华阜康生物 优思弗胶囊（ Ursodeoxycholic acid， UDCA ）
实验方法
取小鼠 30 只， 体质量（ 20 ± 2 ） g， 适应性饲养 1
周后， 随机取 5 只作为正常组常规饲养， 剩余 25 只小鼠按文 制备 PBC 模型， 并随机分为模型组、 阳性组、 TGLP 低剂量 组、 TGLP 中剂量组、 TGLP 高剂量组， 每组 5 只， 均给予 Poly I： C 5mg / kg 腹腔注射， 2 次 / 周， 直至 24 周。正常组小鼠给予等体积 生理盐水腹腔注射， 阳性组灌胃优思弗胶囊 20ml / kg； TGLP 低 中剂量组灌胃 TGLP 27g / Kg， 高剂 剂量组灌胃 TGLP 13． 5g / Kg， 量组灌胃 TGLP 54 / Kg， 1 次 / 日， 连续 24 周。 1． 4 肝组织病理学检查 24 周颈脱位法处死小鼠（ 处理前禁 食一天） ， 采集肝脏， 于冰生理盐水中清洗， 在 10% 缓冲福尔马 Masson 染色， 由我院 2 林固定液中固定， 石蜡包埋， 切片，HE、 名病理科医师独立读片 。 1． 5 细胞角蛋白 19 （ cytokeratin19 ， CK19 ） 的表达 HE 切片系同一个蜡块组织的连续切片， 根据 HE 切片中的组织 学表现， 选定各级别病变所对应的区域， 应用免疫组织化学 SP （ streptavidin- perosidase ） 法 检 测 肝 组 织 中 CK19 的 表 达 情 况。 CK19 为胆管上皮细胞的特异表达， 免疫组化 染 色 后， 棕色为 CK19 阳性表达， 应用多功能真彩色细胞图像分析管理系统分析 各组阳性细胞染色强度 。 1． 6 肝组织光电镜观察 样品经用 2% 戊二醛预固定， 用 1% OSO4 锇酸固定组织， 丙酮系列脱水， 环氧树脂 618 包埋， 半薄切 片光学定位， 超薄切片， 醋酸铀及枸橼酸铅双重染色， 日立 JEM1011 型透射电镜观察。 2 2． 1 结果 肝组织病理学表现 HE 染色结果显示， 正常对照组肝小
胞质粗面内质网成群分布， 呈层状排列整齐有序， 膜表面有核糖 核膜呈沟状凹入核内， 核仁 体分布。模型组小鼠肝细胞核畸形， 松散， 核内异染色质凝聚 、 趋边， 核基质空化。 胞间毛细胆管微 绒毛减少， 胆汁淤积。 胞质中含有大量脂滴， 毛细胆管明显扩 张， 管壁结构不清， 管腔内隐约可见无定型物 。细胞质内空泡较 多。线粒体肿胀畸形， 部分相互融合， 嵴减少 、 破裂及呈管泡状， 部分髓样变性。粗面内质网囊性扩张、 断裂， 同时出现大量溶酶 形成典型的管腔， 管腔宽大畸形， 体。肝组织内胆管增生活跃， 微绒毛散乱稀少甚至消失， 周围有大量的胶原纤维沉积和大量 的成纤维细胞聚集。部分胆管上皮出现坏死， 周边有嗜酸性粒 细胞及中性粒细胞聚集， 相邻细胞膜间有桥粒及紧密连接出现 。 肝窦周间隙扩张， 内有颗粒状蛋白沉着， 可见大量肝星状细胞， 细胞核形态不规则， 胞浆中可见脂肪空泡及少量的微管 。 阳性组小鼠肝细胞体积稍大， 核呈圆形或多边形， 细胞膜大 部分保持完好， 核仁明显， 可见少量块状的异染色质， 胞浆内偶 见脂滴； 与模型组比较， 胞质内线粒体轻度肿胀， 部分嵴减少 。
Intervention action of Tiaogan Lipi prescription on hepatic tissue of mouse with primary biliary cirrhosis
GUO Xiaoxia， LI Liangxue， WU Yupeng， YAO Xinying △ ， et al． Shanxi Hospital of Traditional Chinese Medicine （ Taiyuan Shanxi 030012 ） China Abstract Objective： To explore the intervention mechanism of Tiaogan Lipi prescription on the hepatic tissue ultrastructure of mouse with primary biliary cirrhosis． Methods： C57BL /6 mice were injected with cytidine polyinosinic acid to establish a primary biliary cirrhosis animal model． The ultrastructural changes of the liver tissues of the mice were observed in each group． Ｒesults： Compared to the normal group， the model group were obviously increased expression of CK19 accompanied with active bile duct proliferation，an increase in the numbers of bile canaliculi，lumen deformities and apparent collagen deposition． Transmission electron microscope was showed that the cytoplasm contained a large amount of lipid droplets． The mitochondria were swollen and deformed and the endoplasmic reticulum exhibited cystic expansion and even fracturing． Some of collagen fiber deposition were surrounded with collected eosinophils and plasmacytes． Fewer bile canaliculi， less collagen fiber hyperplasia and lower CK19 expression were observed in Tiaogan Lipi groups compared with the model group and ursodeoxycholic acid groups． Transmission electron microscope was showed that lipid drops occasionally appeared in the cytoplasm and the bile duct epithelial cell proliferation was not obvious． Few fibroblasts gathered around the perisinusoidal space． Conclusion： It is one of the important mechanisms of Tiaogan Lipi prescription to depress bile canaliculi hyperplasia and collagen fiber deposition in primary biliary cirrhosis． Key Words Tiaogan Lipi prescription； primary biliary cirrhosis； liver tissue pathology； morphological observation