第八章 哺乳动物基因工程
《动物基因工程》课件
动物基因工程面临的挑战
技术难度
动物基因工程涉及到复杂 的生物学和遗传学知识， 技术难度较大。
伦理和法律问题
动物基因工程涉及到伦理 和法律问题，需要制定相 应的法规和伦理规范。
社会接受度
动物基因工程需要得到社 会的广泛接受和支持，需 要加强宣传和教育。
增强农业生产力
动物基因工程可以提 高农业生产效率，保 障粮食安全。
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生态平衡维护
基因工程动物释放到环境中可能对生态平衡产生影响，引发伦理考 量。
基因歧视
基因工程动物可能引发对某些人群的基因歧视，需要关注平等和公正 的伦理原则。
国际动物基因工程法规
《关于转基因生物安全性的准则》
联合国粮食及农业组织与世界卫生组织共同制定的国际法规，旨在确保转基因生物的安全使用 和释放。
常见的基因修饰动物包括基因敲入动物、基因 敲除与敲入相结合的动物、条件性基因敲除动 物等。
基因修饰动物制备过程中需要关注基因修饰位 点的选择、修饰效率、表型变化等多个因素， 以确保基因修饰动物的制备成功和实验效果。
04
动物基因工程伦理与法规
动物基因工程伦理问题
动物权益保护
基因工程对动物福利的影响，如疼痛、疾病和死亡在实验过程中所 涉及的伦理问题。
福利。
动物基因表达调控
1 2
基因表达调控机制
包括转录水平调控、转录后水平调控和翻译水平 调控等。
调控方式
包括DNA甲基化、组蛋白修饰、miRNA调节等 。
3
调控的意义
通过调控基因表达，可以影响动物的生长发育、 生理功能和行为表现等。
基因工程知识点
基因工程各章知识点第一章绪论1．基因工程的首例操作实验三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用基因工程的诞生：72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌2．基因工程的基本概念基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA 技术。
供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。
3．基因工程的基本操作过程a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。
b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。
c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。
d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。
e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
第二章载体1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。
答案不确定PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：Tet r 基因内有7个酶切位点：Bam HⅠ，SalⅠ：Amp r基因内有3 个酶切位点：PstⅠ。
Eco RⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。
哺乳动物转基因技术
The first animal ever patented. This mouse, the so-called oncomouse, Harward University received a patent for the transgenic animals in 1988, has been genetically modified so that its cells are prone to cancer.It was produced by microinjection c-myc and mouse mammary tumor virus .
1.Introduction
⑴Definition and applications ⑵History of this technique
A. 1953年J. D. Watson & F. H. C. Crick 提出 DNA双螺旋结构.
Watson,Crick and Wilkins were awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine来自H. 转基因方法的探索
反转录病毒转染→显微注射→ 精子载体→ ES细 胞转染、基因打靶→ 性原细胞转染→体细胞转染、 打靶和细胞核移植转基因
1. Schnieke et al. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science. 1997, 278:2130-2133. 2. McCreath et al. Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells. Nature. 2000, 405:1004-1005. 3. Keefer et al. Generation of dwarf goat (Capra hircus) clones following nuclear transfer with transfected and nontransfected fetal fibroblasts and in vitro-matured oocytes. Biol. Reprod. 2001,64:849856. 4. Lai et al. Production of a-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning. Science. 2002,295:1089-1092.
基因工程概要
基因工程概要第一章：绪论让幸福的细胞不凋亡；让开心的基因多表达；让健康的质粒常转染；让快乐的双链不变异；让烦恼的片段永封闭。
一、基因工程的基本定义基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
二、四大里程碑遗传物质的明确——DNA；DNA双螺旋结构理论（半保留复制及其中心法则）；基因遗传密码子的破译；基因转移载体的发现。
三、三大技术发明工具酶的发明：内切酶、合成酶、连接酶；基因合成和测序（合成仪、测序仪）；PCR技术（PCR扩增仪）。
四、基因的现代概念移动基因；断裂基因；假基因；重复基因；重叠基因；或嵌套基因五、工具酶种类核糖核酸酶；脱氧核糖核酸酶； DNA连接酶；DNA聚合酶；RNA聚合酶；反转录；限制性核酸内切酶。
第二章：重组ＤＮＡ技术基础1、DNA组成与结构：核酸、一级结构、二级结构和高级结构；2、RNA的组成与功能：mRNA、tRNA、rRNA.3、核酸的理化性质：（1）一般性质：核酸的溶解度.；酸碱性；核酸的高分子性质粘度： DNA>RNA dsDNA > ssDNA；核酸的紫外吸收(OD260)单核苷酸 > ssDNA(或RNA) > dsDNA；核酸的化学性质：核酸中的嘌呤和嘧啶能进行脱氨、聚合、烷基化等反应等。
（2）DNA的变性：DNA变性的本质是双链间氢键的断裂；（3)DNA的复性与分子杂交 : DNA复性(renaturation)的定义:在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。
热变性的DNA 经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) ;减色效应: DNA复性时，其溶液OD260降低的现象.(4)核酸酶:核酸酶是指所有可以水解核酸的酶.(5)核酶:催化性RNA 作为序列特异性的核酸内切酶降解mRNA; 催化性DNA人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。
动物基因工程
第一节 哺乳动物基因转移的遗传选择标记
常用的选择基因有： 胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基 因(dhfr)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、细 菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因 (Eco-gpt)、细菌的新霉素磷酸转移酶基因 (Eco-neo)等。
二氢叶酸还原酶
嘌呤嘧啶的 生物合成
腺嘌呤磷酸核糖基转移酶 次黄嘌呤次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶 黄嘌呤黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶 次黄嘌呤次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶
利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序 利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序
病毒晚期基因启动子 插入外源基因 SV40 载体 去除细菌序列
ori
转化
重组分子
筛选
增殖
筛选标记 分离病毒DNA 分离病毒DNA 感染
缺陷的SV40 缺陷的SV40 辅助病毒
pcDNA3.1CAT
CAT： ransferase（氯霉素乙酰转移酶;用于分析表达量） CAT：Chloramphenicol Acetyl Transferase（氯霉素乙酰转移酶;用于分析表达量）
选择原理：
tk(thymidine kinase)基因及hprt基因的筛选：受体细胞必须是 相应的tk-或hprt-，将细胞培养在含HAT（H：hypoxanthine黄嘌呤， A：aminopterin氨甲喋呤，T：thiymidine胸苷）的培养基中。在A 存在下，核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合成AMP、TMP及GMP。 这三中核苷酸的合成只能有补偿途径合成，必须具有tk或hprt基因 的存在细胞才可生长。
二氢叶酸还原酶 胸苷激酶
互补选择的分子基础： 适当的使用这些抑制物，我们可以选择性的控 制某一个合成途径。这就是说，当细胞的一种代 谢途径发生缺陷时，可以从另一种代谢途径得到 补偿，从而能继续存活，因此容易得到突变体； 但是，另一种代谢途径也被一种特殊的药物所阻 断时除非导入野生型基因取代突变的基因，否则 细胞就会死亡。 另一方面，有一些对抑制补救合成途径的药物 呈抗性的基因，在没有补救前体合成的情况下， 也可以用作显性选择标记。
哺乳类基因工程的一些实验操作 实验10X噬菌体DNA 体外包装
微升新鲜配制的包装缓冲液，混匀。 离心，４，（ ８０
ｒｍ １ ｐ ， 小时 ，４ Ｃｏ １． 支 ４ 预 冷 的 Ｅ ｎｏ 离 心 管 中 分 里 ０每 Ｃ ｐ ｄｒ ｐ ｅ ｔ
１－ ２ ０ ０微 升。 仃即 浸 入 滴 氮 。 一 ７ ０ ＂ － ｆ＿ ０Ｃ９ Ｖ Ｓ Ｐ ＇ ， －
Ｅｇ ｅ ｉ ｎｉ ｅ ｎ ｎ ｒ ｇ Ｅ ｐｒｍ ｎ １ Ｉ ｖｒ Ｐｃａｎ ｘ ｅｉ ｅ ｔ ｎ ｏ ｋ ｉ ０ ｉ ａ ｇ ｇ ｔ
ｏ ；Ｐ ａｅ Ａ ｆ ｈｇ Ｄ Ｌ Ｎ 本 文于 １８ 年 １ ６日收到。 ９６ ２月
６尽可能除去残留液体。将沉淀物 悬浮在 ３ ． 毫：
预冷的蔗塘溶液：１０ ００ ／ 蔗糖／０ Ｍ ｉ Ｈ Ｉｐｌ ５ｍ Ｔｓ Ｃ， ｒ・ Ｈ
Ｚ ａ Ｓ ｏ ｙ ａ ： ｐｒ ｎｓ Ｍａ ｈｏ ｎ ｒｎ Ｅ ｅ ｍｅ ｔ ｏ ｈ ｔ ｘ ｉ ｆ ｍｍａａ Ｇ ｎｔ ｌ ｎ ｅ ｃ ｉ ｅ ｉ
４转人 ３－３℃水浴中振荡培养 ２ 小时。取 ． ８ ９ －３
少量菌液于玻璃管 中，加 １ 滴氯 仿， 如菌液很快变清 ， 则可停止培养。 ５离心。４００ １ 分钟， Ｃ， ． ，０ ｒｍ， ｐ ０ ４
Ｍ Ｍ Ｔ 用 Ｎ ，Ｈ中和 ） 微 升 ，琉基 乙醉 ｒ Ｐ（ Ａ ＨＯ ；１ ａ － ２从 一７℃冰柜中取出 Ｓ ． ０ Ｅ和 Ｆ Ｌ 冰上融化 《 Ｔ 置 ３ 按照下列次序加人 ： ７ ． 微升缓 冲液 Ａ １ ２ ； － 升 Ｄ Ａ １ 升缓冲 液 Ｍｌ ６ Ｎ ； 微 ； 微升 Ｓ ； 微 升 Ｆ Ｉ Ｅ １ ０ Ｔ 混匀。２ ℃保温 １ ５ 小时。 ４加 ，０ ． ０ 微升 ． ｌ ， Ａｉ液 混匀。 ５用宿主菌 （ Ｋ ０ ） ． 如 ８２ 侧定体外包装成 活的噬 Ｉ
哺乳动物细胞表达系统
据文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列 能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。
真核表达载体-启动子
外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关，主要 是启动子和增强子的强弱以及它们之间的搭配。
常用的高等哺乳动物受体细胞
迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规 模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细 胞（CHO），其优势有如下几个方面： 遗传背景清楚，生理代谢稳定 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞
Pei等用该细胞株表达分泌型的基质金属蛋白酶MMPI3，发现 高表达的阳性细胞克隆可占转染细胞的5％~l0％，其中一个 克隆的表达量可占细胞上清总蛋白的l5％~20％，在细胞单层 贴壁培养情况下表达量达10 mg/L。
对细胞株选择性地进行遗传改造
BHK/vl6细胞株是稳定表达单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白 的BHK细胞，由于VP16的转录激活作用，载体中的HSV 早期启动子在该工程细胞中有很高的活性。
Clontech公司开发的Tet-off系统中的启动子则由CMV启动 子的核心序列和7个Tet阻遏蛋白结合位点组成。
这些启动子在诱导前后活性可相差4个数量级。
真核表达载体-启动子
在哺乳动物细胞中已发现存在大量在低氧环境中可诱导转录 的基因，如编码红细胞生成素(EPO)、转铁蛋白、血红素加 氧酶-1等的基因，它们都有一个共同的顺式作用元件 (CGTG )，有利于在5’或3’侧翼区的低氧诱导作用因子1(HIF-1)和低氧反应增强子(HRE)结合，激活靶基因的转录， 在低氧浓度下可使重组蛋白大量表达。
遗传学(笔记)21-25
○原核染色体是褐露的DNA，染色质结构对基因的表达没有明显的调控。
真核的染色质DNA与组蛋白紧密结合形成的核小体，染色质结构对基因的调控是明显的。
○原核生物中有正调控（乳糖操纵子）和负调控。
真核生物迄今已知的主要是正调控，而且一个真核基因通常都有多个调控序列，必须有多个激活物同时特异地结合去才能启动基因的转录。
○原核生物：转录和翻译的在同一地点同时进行的。
真核生物：转录在细胞核中进行，翻译在胞质中进行。
○真核生物：多细胞，不同细胞表达不一样。
原核生物：单细胞。
遗传工程所谓的遗传工程就是在分子水平上，用人工方法提取（或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合。
然后通过载体把重组ＤＮＡ分子引入受体细胞，使外源ＤＮＡ在受体细胞中进行复制和表达。
按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。
所以基因工程也称为遗传工程、基因操作、ＤＮＡ重组技术。
有时人们还称它为基因克隆或分子克隆。
遗传工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制备，载体的选择，体外ＤＮＡ重组，重组ＤＮＡ引入受体细胞，克隆转化子的筛选，重组ＤＮＡ的检测等。
第一节基因工程的酶学基础一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶。
限制性内切酶本来是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。
根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类：Ⅰ型酶：分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。
这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，所以在基因工程中应用不大。
Ⅱ型酶：分子量较小（105Da），反应只需Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。
•识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。
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猴多瘤病毒DNA（SV40）
利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序
病毒晚期基因启动子 插入外源基因 SV40 载体 重组分子 筛选 增殖 转化
去除细菌序列
筛选标记
ori 分离病毒DNA
感染
缺陷的SV40 辅助病毒
猴多瘤病毒DNA（SV40）
SV40 DNA载体的特点
基因表达好 外源基因能高效表达 基因重排高 病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象
血影细胞介导法
血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环
境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，最后形成仅被细胞膜包裹的细胞
核结构。在溶血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的 同时，外源DNA也容易进入。当上述外界条件消失后，红细胞膜又可 恢复原来的通透性。因此，可先将外源DNA转入血影细胞，然后再将
哺乳动物细胞的物理转化法
脂质体介导法
将待转化的DNA溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面 活性剂的存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。 将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融 合，DNA随即进入胞质和核内。
利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLa
细胞。
子DRE，控制小鼠乳腺癌启动子MMTP，由其带动外源基因的表达。 SV40来源的启动子控制Neor 标记基因，以G418筛选重组子。
以此载体在人细胞系中表达b1-干扰素和单纯疱疹病毒B蛋白获得成功。
人牛痘病毒DNA
人牛痘病毒的生物学特性
人牛痘病毒是一个大型DNA病毒，基因组长185 kb，能在宿主细 胞质中自主复制。以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建 出的重组病毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的 病毒启动子的控制下高效表达。然而由于牛痘病毒基因组较大，体外 DNA重组很困难，因此通常采用体内重组的方式进行。
人腺病毒DNA
腺病毒DNA载体的特点
基因重排低 外源基因与病毒DNA重组后能稳定复制几个周期 安全性能好 不整合人的染色体DNA，不会导致恶性肿瘤
宿主范围广 对受体细胞是否处于分裂期要求不严格
使用效果好 外源基因在载体上容易高效表达
猴多瘤病毒DNA（SV40）
SV40的生物学特性
SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1、 VP2、VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为5224bp的双链环状DNA SV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白H2、H3、H4结合，从 而使其DNA形成类似核小体的微型染色体结构。
TK合成TMP
XGPRT合成GMP
XGPRT- 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸 ADA腺嘌呤核苷脱氨酶
腺嘌呤木酮糖苷 ADA灭活Xyl-A
常用的高等哺乳动物受体细胞
迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产
的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞（CHO），其优
势有如下几个方面：
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记
遗传标记 APHDHFR HPH编码产物 氨基糖苷磷酸转移酶 二氢叶酸还原酶 潮霉素B磷酸转移酶 筛选药物 G418 氨甲喋呤 潮霉素B 作用机理 APH灭活G418 DHFR变体抗氨甲喋
人牛痘病毒DNA
人牛痘病毒DNA表达载体的构建
目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒 其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌T7RNA聚合酶编码基因。在 外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大 量表达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启动子的细菌型重
GMP
次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP）
次黄嘌呤磷酸 核糖转移酶
AMP
胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）
（TK） 胸腺嘧啶 核苷激酶
（HPRT） 补救合成途径 次黄嘌呤核苷（HR）
胸腺嘧啶核苷（TR）
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
营养缺陷型的哺乳动物受体细胞
含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk -）
癌细胞，这是人们对肿瘤发生机制的最早理解。
哺乳动物细胞的物理转化法
电击转化法
将待转化的DNA溶解受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的 样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时 DNA片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞。 电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在 悬浮液中的淋巴细胞等。
SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，
便发生非同源整合而致癌。
猴多瘤病毒DNA（SV40）
SV40的基因组DNA
t / T基因编码病毒的小抗原和大
t ori
VP2
VP3
抗原与病毒的致癌作用密切相关 SV40在裂解宿主细胞前的晚期 状态时，每个宿主细胞含有105个病 毒DNA拷贝，因此十分适合用于高效 表达外源蛋白
人腺病毒DNA
腺病毒的基因组DNA
IVa2 ITR VA L1 L2 L3 L4 L5 ITR
E1
E2
E3
E4
腺病毒基因组DNA全长36 kb，其包装上限为原基因组的105%， DNA两端各有 一个反向重复序列（ITR）；E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的 表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子， L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期 基因；IVa2和VA均为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因。E3区缺失只会影响病毒颗粒 的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个2.2 kb的片段， 使得载体的装载量提高到4 kb以上。
态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。
高等哺乳动物受体细胞的条件
以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件
细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大
规模培养 遗传稳定性 合适的标记 生长快且齐 安全性能好 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存 便于转化株的筛选和维持 分裂周期短，生长均一，便于控制 不合成分泌致病物质，不致癌
不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基
上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补 含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞 （hprt -）
不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基
上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补
组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体
DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。
人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的。
人牛痘病毒DNA
利用人牛痘病毒载体表达外源基因的程序
感染 转化 培养
T7启动子
外源基因
收集
牛痘病毒 T7 RNA 启动子 聚合酶基因
细菌重组质粒
血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合，从而将外源DNA转入受
体细胞。
哺乳动物细胞的病毒转染法
以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒
共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导 入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围
D 高等哺乳动物的基因转移
哺乳动物细胞的物理转化法 哺乳动物细胞的病毒转染法
哺乳动物细胞的物理转化法
利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达
盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻 了负担。但外源基因表达盒进入受体细胞后，往往以多拷贝的形式随
机整合在染色体DNA上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。
pBR322 SV40 ori ori pV2-GPT gpt
pBR322
Apr
SV40
viral gene
pV2-GPT是一种SV40 DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其 中gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该 载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔b-珠蛋白.
腺病毒的生物学特性
腺病毒科为线状双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个 成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒
有6个亚属，其中常用来构建载体的主要是C亚属的2型（Ad2）和5型
（Ad5）病毒。 腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说， 绝大多数的腺病毒成员均能致癌。
遗传背景清楚，生理代谢稳定
与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS）
C 高等哺乳动物的载体系统
人腺病毒DNA 猴空泡病毒DNA（SV40）
人乳多瘤病毒DNA（BKV）
人牛痘病毒DNA
人腺病毒DNA
T
SV40 DNA
VP1
猴多瘤病毒DNA（SV40）
SV40 DNA-质粒DNA杂合载体的构建
重组的SV40 DNA分子必须经过 包装后才具有感染能力，因此插入的 外源DNA片段不能太大。为了尽量提 高SV40的装载量，必须删除一些基因 片段，因此重组的SV40分子必须与野 生型病毒共感染受体细胞，才能形成 有感染力的重组病毒颗粒。
正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征： 锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂 血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长 接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制 形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构 上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代 且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞 会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状