烤烟品种南江3号均一化全长cDNA文库构建

２０１１年２１（２）生物技术４５
烤烟品种南江３号均一化全长ｃＤＮＡ文库构建
蔡刘体，胡重怡，张永眷，韩晓红
（贵州省烟草科学研究所，贵州贵阳５５００１８）
摘要：目的：为了获得功能基因的信息，构建烤烟品种南江３号的均一化ｅＤＮＡ文库。

方法：用ＲＮｅｎｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ提取烤烟南江３号叶片和花的ＲＮＡ，用反转录酶逆转录合成第一链ｅＤＮＡ。

以ＬＤ—ＰＣＲ扩增获得的双链ｅＤＮＡ为模板，采用基于双链特异性核酸酶（Ｄｕｐｌｅｘ—ＳｐｅｃｉｆｉｃＮｕｃｌｅａｓｅ，ＤＳＮ）的均一化ｅＤＮＡ文库技术，构建南江３号盛花期的均一化ｅＤＮＡ文库。

结果：构建了南江３号盛花期的均一化ｅＤＮＡ文库，文库重组率大为９７．４７％，库容量约为１．２６×１０６，插入片段平均长度大于１．２ｋｂ。

从文库中随机４８个克隆进行ＰＣＲ检测，挑取２０个克隆进行测序，序列通过ＢＬＡＳＴ比对结果显示文库可能包含大量基因和ＥＳＴｓ序列。

结论：该文库为研究南江３号的基因功能和资源提供材料来源。

关键词：烤烟；基因；均一化；ｃＤＮＡ文库；表达序列标签
中图分类号：￥５７２．０３２文献标识码：Ａｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４—３ｌＩＸ．２０１１．０２．０４５
ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＮｏｒｍａｌｉｚｅｄＦｕｌｌ——ｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｏｆＦｌｕｅ—．ｃｕｒｅｄ
ＴｏｂａｃｃｏＶａｒｉｅｔｙｏｆＮａｎｊｉａｎｇ—－３
ＣＡＩＬｉｕ—ｔｉ，ＨＵＺｈｏｎｇ—ｙｉ，ＺＨＡＮＧＹｏｎｇ—ｃｈｕｎ，ＨＡＮＸｉａｏ—ｈｏｎｇ
（ＧｕｉｚｈｏｕＴｏｂａｃｃｏＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５００１８。

Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＩｎｏｒｄｅｒｔＯｏｂｔａｉｎｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓ。

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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｆｌｕｅ—ｃ删ｔｏｂａｃｃｏ；ｇｅｎｅ；ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ；ｅＤＮＡｌｉｂｒａｒｙ；ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ
０引言
烤烟新品种南江３号（审定号）是从烤烟栽培品种红花大金元品种中通过系统选择培育获得的，它具有适应性强，易烘烤，中抗赤星病和青枯病等优良农艺性状；而且烟叶外观品质好，烟碱含量适中。

化学成分协调，其主要经济性状与Ｋ３２６比较，产量提高１５．７１％．产值增加３３．９３％，符合中式卷烟发展对原料的需求，具有生产应用价值。

也可以作为优异种质在烟草育种中研究和利用…。

均一化ｅＤＮＡ文库技术可以克服基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来的障碍，增加克隆低丰度ｍＲＮＡ的机会，有利于研究基因的表达和序列分析。

因此，基于均一化文库技术构建全长ｃＤＮＡ文库被广泛应用，如在植物中构建的水稻全生育期均一化ｅＤＮＡ文库悼】，棉花腺体形成时期的ｃＤ－ＮＡ文库【３】。

玉米杂交种雌穗均一化ｅＤＮＡ文库Ｈ１；亚洲棉全生育期均一化全长ｅＤＮＡ文库”’；玉米ＭＯｌ７的均一化文
收稿日期：２０１０—１０—２６：修回日期：２０１１—０３一０３
资助项目：贵州省烟草专卖局项目（“烟草病圃微生物多样性分析及烟草抗病性基因研究”，黔烟科２００９—０１５）；国家烟草专卖局项目（“烟草ｅＤＮＡ文库构建及重要基因表达谱研究”，ｌ１０２００７０１０２１）资助
作者简介：蔡刘体（１９７４一），男，博士，助理研究员，研究方向：烟草发育分子生物学，Ｅｍａｉｌ：ｃａｉｌｉｕｔｉＯｌ＠１６３ｍ，Ｔｅｌ：０８５１—４１ｉ７０８９。

Ｆａｘ：０８５１—４１１６９呻库№Ｊ。

烤烟新品种南江３号的基因资源文库资源未见报道，为挖掘其基因信息和保存基因资源，本文采用均一化文库技术构建烤烟新品种南江３号盛花期的均一化ｅＤＮＡ文库。

ｌ材料与方法
１．１材料
１．１．Ｉ植物材料
烟草品种南江３号（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ脚蝴ＣＶ．Ｎａｎｊｉａｎｇ３），取南江３号盛花期的幼叶和花蕾，液氮速冻，－８０。

Ｃ保存备用。

１．１．２试剂１ＲＮＡ提取试剂盒ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ和文库构建试剂盒ＳＭＡＲＴｅＤＮＡＬｉｂｒａｒｙＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＫｉｔ为ＱＩＡＮＧＥＮ公司产品；ＤＮＡ纯化回收试剂盒为大连ＴａＫａＲａ宝生物公司产品；反转录酶、ＤＮａｓｅＩ、ＤＬ２０００和蛋白酶Ｋ等试剂为上海生物有限公司产品。

１．２方法
１．２．１ＲＮＡ提取纯化
南江３号叶片和花蕾的总ＲＮＡ的提取按照ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ说明书操作，通过ＤＮａｓｅＩ消除ＤＮＡ纯化回收后，用琼脂糖凝胶电泳和紫外分析检测。

１．２．２均一化ｅＤＮＡ文库构建
文库构建按照ＳＭＡＲＴｅＤＮＡＬｉｂｒａｒｙＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＫｉｔ说明。