总RNA提取,cDNA文库构建与基因克隆
基因克隆过程及注意事项
以猪APOA2基因为例一．提取总RNATRIzol法提取RNATRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。
它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和总蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用Trizol试剂可以快速提取人、动物、植物、细菌不同组织的总RNA，该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。
TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。
所有的操作可以在一小时内完成。
TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。
故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。
如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总RNA。
并且利用DNA、RNA和蛋白质在不同溶液中的溶解性质，可以通过分层分别将不同层中的RNA（上层）、DNA（中层）、蛋白质（下层）分离纯化出来，效率极好。
Trizol试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。
例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。
当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8使用TRIzol注意事项TRIzol对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。
cDNA和基因组文库DNA的构建
结构 环状
线状 环状
E.coli E.coli E.coli 酵母细胞
环状 环状 环状 线性染色体
哺乳动物细胞 动物细胞
环状 环状
动物细胞和细 菌
环状
插入片段 很小,<8kb
9-24kb <10kb
35-45kb 约300kb 100-800kb
1002000kb >1000kb
举例 pUC18/19 ,某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体；cDNA是指含有所有重组cDNA的克隆群体.
基因组：来源于基因组DNA,反映基因组的全部信息,用 于基因组物理图谱的构建,基因组序列分析,基因在染色体上的定位, 基因组中DNA (互补DNA）
第二条DNA链
1：反转录酶催化合成cDNA第一链
• 1 . 1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成： poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl 1mol/L KCl 3.5μl 250 mmol/L MgCl2 2μl dNTP溶液（含4种dNTP,每种5mmol/L） 10μl 0.1 mol/L DTT 2μl RNase抑制剂（选用） 25单位 加H2O至 48μl 1 . 2.当所有反应组在0℃混合后,取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内. 在这个小规模反应管中加入0.1μl α-32P dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）.
4：接头或衔接子的连接
cDNA末端的削平 4.1.cDNA样品于68℃加热5 min. 4.2.将cDNA溶液冷却至37℃并加入下列试剂： 5×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 10μl dNTP溶液,每种5 mmol/L 5μl 加H2O至 50μl 4.3.加入1~2单位T4噬菌体DNA聚合酶（500单位/ml）,37℃温育 15min. 4.4.加入1μl 0.5mol/L ED . 5.在所有四小份样品（来自步骤2和步骤4）加入 100 ng质粒DNA或500 ng的λ噬菌体DNA.这些未甲基化 的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率. 3 . 6.所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37℃ 温育1h. 3 . 7.于68℃加热15min,用酚：氯仿抽提大体积反应液 一次,再用氯仿抽提一次. 3 . 8.在大体积反应液中加入0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠 （pH5.2）和2倍体积的乙醇,混匀后贮存于-20℃直至获 得小样反应结果.
总RNA提取,cDNA第一条链合成,cDNA纯化,3‘端加尾实验,荧光定量PCRprotocol
RNA Extraction Protocol1.实验原理异硫氰酸胍/苯酚法-----目前实验室使用的方法！✓细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放✓释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离细胞或组织1. 样品裂解2. 分离总RNA2.实验试剂与器材2.1实验试剂RNA提取试剂Trizol（Invitrogen）、氯仿、异丙醇、75%乙醇、无水乙醇、DEPC 水，反转录试剂盒（Fermentas），cDNA纯化试剂盒（Promega），末端加尾酶TdT （Thermo）。
2.2实验器材微量移液器（Eppendorf），电泳仪，电泳槽，超净工作台，4℃低温离心机（Eppendorf），常温离心机（Eppendorf），匀浆机（IKA），高压蒸汽灭菌锅，通风橱，紫外分光光度计（Eppendorf），PCR仪（Takala），剪刀，镊子，0.2mL、1.5mL离心管，枪头。
3.实验前准备工作实验前将要用到的试剂配好（75%乙醇：75mL的无水乙醇+25mL的去离子水；DEPC水：在1000ml双蒸水中加入DEPC原液1ml，然后摇匀过夜），与离心管、枪头、剪刀、镊子（用DEPC水处理过的，浸泡过夜）一起灭菌（126℃，90min），之后剪刀和镊子最好在紫外灯下照射半小时。
提前20min打开低温离心机预冷。
准备两幅手套，一个口罩，塑胶手套不能离开通风橱，整个实验过程尽量降低外源RNA酶对样品中RNA的降解。
4.实验步骤4.1取样（1）组织样品：将组织在RNA保护液中用剪刀剪碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。
样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
（2）贴壁培养细胞：不须消化，直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。
cdna法获得目的基因科学家故事
CDNA法是一种基因克隆技术，它通过合成RNA的互补DNA链来获取特定基因的DNA序列。
下面我们将介绍一个科学家在使用CDNA法获得目的基因的故事，展示了这一技术在生命科学领域的重要应用。
一、科学家背景这位科学家名叫李明，是一位优秀的分子生物学家。
他在大学时就展现出对生物学的浓厚兴趣，毕业后前往美国一家知名的生物技术公司工作。
在这家公司，李明深入研究了CDNA法的原理和应用，并成功地利用该技术克隆了多个目的基因。
二、CDNA法的原理CDNA法是一种重要的基因克隆技术，它利用了生物体中DNA的转录和逆转录过程。
具体来说，CDNA法通过以下步骤获得目的基因的DNA序列：1. 提取RNA：从目的细胞或组织中提取总RNA。
这一步需要严谨的实验操作，以确保RNA的完整性和纯度。
2. 逆转录：利用逆转录酶将RNA转录成互补的DNA链，即cDNA。
这是CDNA法的关键步骤，也是其得名的原因。
3. 克隆cDNA：将得到的cDNA插入到适当的载体中，经过转化、筛选等步骤，最终获得目的基因的克隆。
三、科学家故事李明在公司工作期间，获得了一个重要的研究项目：克隆一种与人类疾病相关的基因。
这个基因对研究某种遗传疾病的发病机制非常重要，因此克隆它具有重要的科学意义和潜在的医学应用价值。
在这个项目中，李明首先需要获取这种基因的DNA序列，并将其插入适当的表达载体中，以便在细胞中表达其蛋白。
通过查阅文献和分析公开数据库，李明确定了这种基因在人类组织中的表达模式和序列信息，然后开始着手使用CDNA法进行克隆。
他从实验室中获得了大量的人类细胞系，并提取了其中的总RNA。
这一步骤需要精密的实验技术和仪器，以确保RNA的完整性和纯度。
经过多次尝试和改进，李明终于获得了满意的RNA样本。
他使用逆转录酶将RNA逆转录成cDNA。
由于目标基因的转录水平并不高，在这一步骤中需要特别小心地选择适当的引物和反应条件。
经过一段时间的努力，李明成功地得到了目的基因的cDNA序列，并将其插入了表达载体中。
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。
其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。
（2）cDNA第一条链的合成。
（3）cDNA第二条链的合成。
（4）双链cDNA的修饰。
（5）双链cDNA的分子克隆。
（6）cDNA文库的扩增。
（7）cDNA文库鉴定评价。
一、Superscipt II—RT合成第一链1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAC TAGTCTCGAGTTTTTTTT TTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。
）。
2. 混匀后，70℃反应10分钟。
3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。
4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂：（1）4 ul 5×first strand buffer（2）2 ul 0.1 M DTT（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。
7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。
二、cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。
cDNA 文库的构建
第二节cDNA 文库的构建cDNA 文库中的外源 DNA 片段是互补 DNA （complementary DNA , cDNA）。
cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链 cDNA 。
cDNA 文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。
cDNA 文库的构建cDNA 文库的构建共分四步（图 8-2）：第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；第二，第一链 cDNA 合成；第三，第二链 cDNA 合成；第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。
图 8-2 ： cDNA 文库构建流程图一、RNA 的分离cDNA 文库构建是以 mRNA 为起始材料的， mRNA 在总RNA 中所占比例很小，因此从总RNA 中富集mRNA 是构建cDNA 文库和其它应用所必需进行的步骤。
通过降低rRNA和tRNA 含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。
目前纯化mRNA 的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[ oligo（dT）]链，由它与mRNA 的Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住mRNA ，进而将mRNA从其它组分中分离出来的。
1．mRNA 的完整性指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽的能力，mRNA 的大小，总mRNA 制剂指导合成cDNA 第一链长分子的能力。
2．mRNA 的丰度高丰度mRNA ：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特定细胞中占50-90% 。
低丰度mRNA ：含量 0.5% 被称为低丰度或稀有mRNA 。
3．mRNA 的富集3.1按大小对 mRNA 进行分级分离3.2 cDNA 的分离级分离近年来多采用此方法，特别是大mRNA ，可避免降解mRNA , agarose 分离大小易辨。
cdna基因克隆的基本原理和流程
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
cdna基因文库名词解释 概述及应用场景
cdna基因文库名词解释概述及应用场景1. 引言1.1 概述CDNA基因文库是指利用互补式DNA（complementary DNA）技术构建而成的一类基因文库，其中包含了特定细胞或组织内所表达的mRNA分子的DNA 复制品。
通过将mRNA转录为cDNA，并将其插入到合适的质粒载体中，科学家们可以获取到特定时期或特定条件下细胞中所表达的全部转录本信息。
CDNA基因文库构建技术是基于反转录酶作用原理而来，通过选取合适的引物和核苷酸，在体外将mRNA逆转录合成相应的cDNA。
这些cDNA分子可进一步克隆到质粒载体中，并在宿主细胞内扩增。
最终形成一个包含大量不同cDNA 片段的基因文库，可供后续研究使用。
1.2 文章结构本文首先会对CDNA基因文库进行详细的名词解释，包括其定义、合成过程及特点以及构建方法与步骤。
接着，将进一步讨论CDNA基因文库在不同领域中的应用场景，尤其是在基因表达研究、蛋白质研究以及新药研发方面的应用。
最后，我们将总结已有的研究成果，并展望CDNA基因文库在未来的发展前景和应用潜力。
1.3 目的本文的目的是为读者提供关于CDNA基因文库的详细解释和应用场景的介绍。
通过阅读本文，读者将更全面地了解CDNA基因文库的概念、构建过程以及其在科学研究中的重要性和广泛应用。
同时，本文也旨在展示CDNA基因文库在基因表达、蛋白质研究以及新药研发等领域所起到的关键作用，为读者理解该技术在科学研究中所扮演的角色提供深入了解。
最后，通过总结已有研究成果并展望未来发展前景，让读者对CDNA基因文库技术有一个更加清晰的认识，并认识到其仍然具有巨大的发展潜力。
2. CDNA基因文库名词解释2.1 CDNA基因文库的定义CDNA基因文库，即亦称为互补脱氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）文库，是一种由转录反应合成的DNA序列集合，其中包含了从细胞中提取的mRNA分子逆转录合成的互补DNA。
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LD PCR中获得ds cDNA产 物产量低或没有 可区分的 亮带
1、循环数不够，可导致产量低或片段大小<4 kb 或<2-3 kb，增加循环数。 2、第一链cDNA的产量低或起始的RNA 量不足， 导致产量低，从头开始。 3、如果整个smear比较亮而不可区分，可能是循 环数太多，少2-3个循环重新合成第二链。 4、电泳所用的琼脂糖凝胶也可能改变条带亮度， 建议用1XTAE，1.1%-1.2%琼脂糖，电压60-90V。 对于哺乳动物来源的RNA可能因结构复杂而无亮 带；增加2-3个循环来重复引物延伸步骤；电泳所 用的琼脂糖凝胶也可能改变条带亮度，建议用 1XTAE，1.1%-1.2%琼脂糖，电压60-90V。
退火：根据引物的Tm值确定，一般退火温 度=Tm-5℃; 延伸:70-75℃，一般选择72℃。
时间设置
变性：30-60s，根据变性温度和模板基因长度确 定，普通PCR选择95℃变性30s即可； 退火:取决于引物的长度、碱基组成和浓度，一般 选择30-60s； 延伸：取决于模板基因的长度，常规体系72 ℃ 60s可延伸1000bp左右。6、测定质粒滴度ຫໍສະໝຸດ
计算菌落数来确定滴度colonies on plate/ [plating volume(ml) x dilution factor] 之前进 行实验； 使用推荐的抗生素浓度的培养基，以确保质粒的稳定性； 通常情况下，用于长期保存的质粒滴度要达到108 cfu/ml 。
引物延伸法获得的ds cDNA 没有可区分的亮带
3、蛋白酶K消化与酶切
所用的ds cDNA的量为50 μl，加入2 μl蛋白 酶K消化，使DNA聚合酶失活。 进行纯化，沉淀ds cDNA时，注意要加入室 温下的95%乙醇，且室温下离心，不要在 离心前将试管置于冰上，以免因低温导致 杂质的共沉。 酶切后加入2 μl 1%的二甲苯氰，作指示剂。
Mg2+浓度
Mg2+对PCR反应的特异性和产量有显著影响；
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性 扩增。浓度过低会降低DNA聚合酶活性，使反应 产物减少。
PCR反应条件的选择
温度 时间 循环次数
温度设置
变性：90-95 ℃，温度过高会影响DNA聚合 酶的活性，温度过低则需延长时间使变性 充分；
PCR原理
变性：95 ℃
退火：60℃
延伸：72℃
PCR反应五要素
引物（primer）
酶（DNA polymerase）
dNTP（dATP, dGTP, dCTP, dTTP）
模板（template） Mg2+（magnesium）
引物-PCR特异性反应的关键
引物长度15-30bp； G+C含量：40%-60%； Tm值与G+C含量有关，通过调整G+C含量使Tm值处于6070℃； ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶成串排列； 引物3’末端的碱基要求严格配对，且最末端核苷酸避免用 腺嘌呤A； 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补； 特异性引物/兼并引物
Electrophorese a sample on a gel
Sfi I digestion
cDNA size fractionation
续上页
Ligate cDNA to pDNR-LIB vector
Transform cells and plate out
The unamplified library & check % recombinant clones
不同的仪器要摸 索一下最佳的循 环数。 此时获得的ds cDNA约2-3 μg/50 μ l。
1、2小结
容易遇到的问题
无ds cDNA产物
ds cDNA产物的片段偏小
分析 原因和 解决的办法
可能漏加反应成分，只能重做
起始材料RNA 可能降解、不纯，要重新制备RNA； 可能是浓度过低，则增加RNA的加量；可能是稳 定性差，就要更换制备RNA的方法。
几种分子生物学常规实 验技术介绍
王义鹏 2013年10月9日
主要内容RNA提取 cDNA构建 基因克隆（PCR）RNA提取
Trizol法提取RNA
试剂和耗材准备
Trizol试剂 氯仿 异丙醇 75%乙醇（DEPC处理水配制） DEPC处理水 枪头、PCR管（购买商品化产品或DEPC水浸泡）
分级分离要注意的问题
尽可能只收集前三管，避免混入小片段，以免影 响载体连接，造成重组效率低。 如果经检测有小片段没有驱除干净，要重复双链 合成和分级分离的话，要注意: 不要让基质主体过干； 柱子室温储存备用； 不要有气泡； 双链混合物要混合均匀以免导致不能有效分离。
5、连接与转化
连接
转化
同时做阴性对照和阳性对照实验检测感受态细胞； 结果：阴性对照无菌落生长；阳性对照长满了菌落； 实验组平板上的菌落形成汇片，这样的平板可包含几千个菌落。简介cDNA构建的基本步骤：
总RNA提取；
逆转录合成cDNA第一链； cDNA第二链合成； 接头的加
常规建库：
加adaptor，相应酶切后插入载体；低丰度或较长信息丢失； 加相同adaptor，因插入载体的方向性，可能有50%信息丢失； 加不同adaptor，双酶切问题影响产率。 表达框架问题，正向插入后的正确产物几率1/3。
实验小结
保证获得数量足够的高质量的起始RNA。 反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。
层析柱cDNA分级很关键。这一步稍不注意会影对连接产物转化大肠杆菌的效率要求很高。
基因克隆(PCR)
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）：简称 PCR，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以 特定引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸等步骤，体 外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程，是一项 在短时间内大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。
Amplify and titer library
1、第一链cDNA合成
50 ng of total RNA or 25 ng of poly A+ RNA
1 μg poly A+ RNA
适用于原始材料有限或 RNA较难获取的实验材料， 但是如果起始RNA越多， PCR的循环数则越少，这 样可以减少非特异性产物 的扩增； 反应体系相同；但进行下 一步时只需用2 μl的反转 录产物，其余可保存在-20 ℃冰箱内（3个月）
4、cDNA片段的分级分离
应用CHROMA SPIN-400 Column
上样前的准备：混匀柱子内的基质，去除气泡； 去除底部封口，液体自然流出至流干，直 到看到基质处于1 ml刻度处； 流速大约1滴/40-60 sec，每滴大约40 μl。 当储备液流干后，加700 μl 缓冲液洗柱子。 上样：当缓冲液停止流出15-20 min后，加入样品液。 洗涤：保证样品完全吸附于柱内，再加入缓冲液洗涤。直至 液滴停止，此时染料带进入柱子几毫米处。 洗脱：准备好回收管，加入600 μl 缓冲液开始回收 （16）。 检测：每管3 μl 电泳，150V 10 min。 回收：收集包含cDNA的前三管。浓缩、沉淀后，7 μl 溶解。
果实或种子：多糖/多cDNA Library Construction KA经反转录产生的cDNA片段分别与克 隆载体重组，并将其引入到相应的宿主细 胞中（一般为E.coli.）繁殖和扩增，理论上 此群体就包含有该物种的全部RNA or 25 ng of poly A+ RNA 1 μg poly A+ RNA
Synthesize first-strand cDNA
Synthesize first-strand cDNA
cDNA Synthesis by LD PCR
cDNA Synthesis by Primer Extension
循环次数
循环次数：取决于模板DNA的浓度；
适用于RNA 易于获得的实 验材料，但使用少于0.5 μg或大于2.0 μg的Poly A+ RNA 会降低克隆效率； 在终止第一链合成反应之 后，加入1 μl的NaOH，然 后68℃下保温30 min。 在下一步反应中，全量 （ 11 μl ）加入进行第二 链的合成。
2、合成ds cDNA
LD PCR法扩增cDNA 引物延伸法合成双链cDNA
操作步骤
1.匀浆 单位样品（50-100mg组织、3.5cm培养皿、5-10×106动植物细胞或酵母细胞、1×107细菌）加入 1mlTRIZOL，充分吹打和研磨（首先在2mlEP管中加入少量TRIZOL，将组织样品放入，用小剪刀尽 量剪碎，然后转移到研钵中充分研磨）。收集匀浆液，2-8℃，12000g离心10min。 2.分相（phase separation） 上清转移到新的1.5mlEP管，15-30℃放置5min，加入氯仿（0.2ml/1ml TRIZOL），盖好管盖，剧 烈摇动15秒，15-30℃放置2-3min。2-8℃，12000g离心15min。此时管内液体分为三层：上层，中 层和下层。RNA存在于无色上层水相（其体积大约为所用TRIZOL体积的60%，且其表面有一层脂 肪），中层为蛋白，红色下层为酚-氯仿相。 3.RNA沉淀 将上层水相转移到一个新的1.5ml离心管中（该步骤至关重要，尽量避免接触蛋白相和脂肪），加 入异丙醇（0.5ml/1ml TRIZOL）使RNA沉淀下来。15-30℃放置10min，2-8℃，12000g离心10min （离心前不可见，后成胶状沉淀）。提前将异丙醇4℃预冷，或混匀后-20℃放置60min提取效果更 好。 4.洗涤RNA 除去上层液体，加入75%乙醇（至少1ml乙醇/1ml TRIZOL）混匀，2-8℃，7500g离心5min （12000g离心后RNA不易溶解）。若RNA沉淀量多，可重复洗一次。 5.RNA重溶 弃去上层液体，将EP管在超净工作台通风片刻，凉干RNA（空气或真空干燥5-10min，不要真空离 心干燥。不能太干，否则影响溶解）。用适当体积的RNase-free水重新溶解所得RNA（所用体积要 根据RNA量确定）。取少量RNA用DEPC水稀释50倍测得率，取5ul跑电泳，其他-80℃保存。