DNA文库的构建精
合集下载
怎样构建基因组文库
E 与载体相连
2
1
甲基化酶 人工接头I REI
人 工 接 头 II
REII 与载体相连 3 重 组 cDNA
ds-DNA合 成
与 SalI匹 配 接头相连
NotI酶 切
cDNA的定向插入
载体
1)SalI/NotI 2)T4 DNA
ligase
NotI primer/adaptor SalI adaptor
P o ly A 3 1
51
GGG
M o d ifie d o lig o (d T ) P rim e r
F irst-stra n d sy n th e sis c o u p le d w ith (d C ) ta ilin g b y R T
51
GGG CCC
p o ly A
T e m p la te sw itc h in g a n d e x te n sio n b y R T
1) 当反转录酶合成到mRNA模板5’端后,它会在第一 链的3’端加上几个C; 2) 合成的寡核苷酸G与C配对； 3）反转录酶以新合成的cDNA为模板，继续合成第 二条cDNA链； 4）LD PCR—Long Distance PCR
S M A R T M eth o d
P o ly A + R N A
2. Okayama–Berg改进法
该法集中了常规方法和 Okayama–Berg法的优点,第 一条cDNA链合成用常规法， 但在3’-端加尾后，其余步 骤与Okayama–Berg法相同
UC19
1)Pst I 2)TdT+dGTP
GGGG GGGG
Sma I
CCCC
GGGG
2
1
甲基化酶 人工接头I REI
人 工 接 头 II
REII 与载体相连 3 重 组 cDNA
ds-DNA合 成
与 SalI匹 配 接头相连
NotI酶 切
cDNA的定向插入
载体
1)SalI/NotI 2)T4 DNA
ligase
NotI primer/adaptor SalI adaptor
P o ly A 3 1
51
GGG
M o d ifie d o lig o (d T ) P rim e r
F irst-stra n d sy n th e sis c o u p le d w ith (d C ) ta ilin g b y R T
51
GGG CCC
p o ly A
T e m p la te sw itc h in g a n d e x te n sio n b y R T
1) 当反转录酶合成到mRNA模板5’端后,它会在第一 链的3’端加上几个C; 2) 合成的寡核苷酸G与C配对； 3）反转录酶以新合成的cDNA为模板，继续合成第 二条cDNA链； 4）LD PCR—Long Distance PCR
S M A R T M eth o d
P o ly A + R N A
2. Okayama–Berg改进法
该法集中了常规方法和 Okayama–Berg法的优点,第 一条cDNA链合成用常规法， 但在3’-端加尾后，其余步 骤与Okayama–Berg法相同
UC19
1)Pst I 2)TdT+dGTP
GGGG GGGG
Sma I
CCCC
GGGG
12 第十二讲 DNA文库的构建
部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子， 在该重组子群集中包含了其全部特别适合某些病毒 基因组结构克隆对应一种mRNA序列，这样在 目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较 低，因此阳性的杂交信号一般都是有意义的， 由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因序 列。
基因重组
体外包装不同的基因， 但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，有 15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同 的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克 隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得 多。
转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序
列的结构与功能。基因组DNA与cDNA的比较基因组DNA的重组cDNA分子反映来源细胞 中表达信息的完整性。 3.2 重组cDNmRNA； ⑶ cDNA的合成； ⑷ 黏性末端片段与载体的连接； ⑸ 离体包装获得重组噬菌体； ⑹ 检测⑴基因组DNA的分离制备 不同来源的DNA制备方法不同。 一般来说，有液相法和固相法两种。 液相法提取的DNA长度一般在100kb左右， 基本可以满足构建各种小插入片段基因组文 库的要求。
大相对分子质量(high molecular weight,HMW) 基因组DNA的提取方法
基因组DNA
限制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因组3.2 基因组信息的可重建性 通过建立叠连群(conti一般来说，DNA片段长，完整基因组文 库所含的克隆数越少。反之，越多。 基因组越大，应包含的克隆数越多， 反之，越少。
4.2 cDNA第一链的合成 ① oligo(dT)引导的DNA合成法 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的 特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的 oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一 链。
基因重组
体外包装不同的基因， 但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，有 15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同 的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克 隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得 多。
转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序
列的结构与功能。基因组DNA与cDNA的比较基因组DNA的重组cDNA分子反映来源细胞 中表达信息的完整性。 3.2 重组cDNmRNA； ⑶ cDNA的合成； ⑷ 黏性末端片段与载体的连接； ⑸ 离体包装获得重组噬菌体； ⑹ 检测⑴基因组DNA的分离制备 不同来源的DNA制备方法不同。 一般来说，有液相法和固相法两种。 液相法提取的DNA长度一般在100kb左右， 基本可以满足构建各种小插入片段基因组文 库的要求。
大相对分子质量(high molecular weight,HMW) 基因组DNA的提取方法
基因组DNA
限制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因组3.2 基因组信息的可重建性 通过建立叠连群(conti一般来说，DNA片段长，完整基因组文 库所含的克隆数越少。反之，越多。 基因组越大，应包含的克隆数越多， 反之，越少。
4.2 cDNA第一链的合成 ① oligo(dT)引导的DNA合成法 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的 特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的 oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一 链。
DNA文库的构建和目的基因的筛选
第八章 DNA文库的构建和目的基因的筛选第一节 概述基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。
通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因。
因目的基因片段需插入载体，导入宿主细胞内复制，所以对宿主细胞DNA而言，又称它为外源性基因。
目的基因主要是编码蛋白质(酶)的结构基因，诸如抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因以及工业用酶相关基因等。
随着生物长期的进化，生物界积累了大量对人类有用的基因。
它是大自然恩赐于人类的宝贵资源，等待人们去开发利用。
目的基因用途很广，主要有以下几个方面：①研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。
②与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。
③研究生物种系进化与相关同源性。
④应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。
⑤在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。
⑥建立基因疗法院，选用某种正常基因,引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。
根据研究对象的研究目的不同，目的基因可来自原核细胞或真核细胞。
原核生物基因组较简单，较易获得目的基因。
哺乳动物真核细胞基因组庞大复杂，可根据不同的要求选择适宜方法，从中获得目的基因。
要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小的所感兴趣的目的基因，是基因工程中的第一个难题。
欲想获得某个目的基因，必须对其有所了解，然后根据目的基因的性质制定分离的方案。
目的基因的制备是基因工程研究和应用的关键内容之一。
根据实验需要，待分离的目的基因可能是一个完整的有功能的基因，除了编码区，还包含转录启动区和终止区序列，或者是一个完全的操纵子或基因簇，也可能是只具有编码序列的基因区，甚至是只含启动子或终止子等部件的DNA片段。
DNA文库的构建和目的基因的筛选
指某一生物体全部或部分基因的集 合，像一个没有目录的“基因图书馆”。某个生物 像一个没有目录的“基因图书馆” 的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重 或 的基因组 片段与适当的载体在体外重 组后，转化宿主细胞， 组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选 后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或 后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌
按照外源DNA片段的来源来分：基因组、 片段的来源来分：基因组、 按照外电泳
色 体 文 库 构 建
红色Ura+,Try+转化子菌落（四）基因组的筛选利用同源探针克隆基因
三、cDNA的构建 的构建构建cDNA应满足的条的筛选（一）构建cDNA应满足的条件 构建 应满足的条件
的代表性 重组cDNA的序列完整性 的序制备 的制备 细胞总 及mRNA的分离 的分离 cDNA第一链的合 第一链的合 成 双链cDNA链的合 链的合 双链 成 与载体的连接 噬菌体颗粒的大于研究基因的平均长度 含有相邻DNA片段的独立克隆间 片段的独立克隆间 含有相邻 克隆片段易于从载体上完整卸下最好不带任何载体序列 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。ຫໍສະໝຸດ （二）基因组的构建过程
基因组DNA的分离制备 的分离制备 基因组 基因组DNA的片段化 基因组 的片段化 载体制备 重组连接 噬菌体离体包装 重组噬菌体感 X
B
Ori
X
ARS1
pYAC4
酵 母
TRP1 CEN4 Sup4 S E
Sm
按照外源DNA片段的来源来分：基因组、 片段的来源来分：基因组、 按照外电泳
色 体 文 库 构 建
红色Ura+,Try+转化子菌落（四）基因组的筛选利用同源探针克隆基因
三、cDNA的构建 的构建构建cDNA应满足的条的筛选（一）构建cDNA应满足的条件 构建 应满足的条件
的代表性 重组cDNA的序列完整性 的序制备 的制备 细胞总 及mRNA的分离 的分离 cDNA第一链的合 第一链的合 成 双链cDNA链的合 链的合 双链 成 与载体的连接 噬菌体颗粒的大于研究基因的平均长度 含有相邻DNA片段的独立克隆间 片段的独立克隆间 含有相邻 克隆片段易于从载体上完整卸下最好不带任何载体序列 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。ຫໍສະໝຸດ （二）基因组的构建过程
基因组DNA的分离制备 的分离制备 基因组 基因组DNA的片段化 基因组 的片段化 载体制备 重组连接 噬菌体离体包装 重组噬菌体感 X
B
Ori
X
ARS1
pYAC4
酵 母
TRP1 CEN4 Sup4 S E
Sm
基因组文库构建
构 建 基 因 组 D N A 和 cD N A 文 库 的 流 程 示 意 图
第一节 DNA克隆片段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化 1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体 连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach) 存在的问题： ①所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段 的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算， 基因库至少含10～30万个重组质粒。从中筛出目的基 因工作量是很大的。 ②目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个 基因分载在 几个重组质粒上，完整筛出更不容易。
H in d I I I C os N otI Z T7 P a rC CM SP6 N otI
r
H in d III 部 分 酶 切
P a rB P a rA
BAC o r iS PFG L re p E H in d I I I C IP
P u lse d -fie ld g e l e le c tro 使其成为一定大小的片段连接到适当载体常为噬菌体上经体外包装转染细菌得到一群含不同dna片全部基因的随酶切使其成为一定大小的片段，连 接到适当载体(常为噬菌体)上，经体外包装 转染细菌，得到一群含不同DNA片段的重组 噬菌体颗粒。此即是基因。这群DNA片 段含盖基因组全部基因。
但应注意： (1) 细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的 mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。 (2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得 其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或DNA。不能用于基因结构和调节的研 究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部 分重叠的cDNA克隆。
真 核 基 因 组 DNA
λ 取 代 型 λ 噬 菌 体 载 体
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选.pp t
由于mRNA在总RNA中所占比例很小，因此从
总RNA中富集mRNA是构建cDNA的一个重 要步骤。通过降低rRNA和tRNA含量，可大大 提高筛选到目的基因的可能性。
二、第一链cDNA的合成 由mRNA到cDNA的过程称为反转录，由反转录 酶催化。
常用的反转录酶有2种：AMV（来自禽成髓细
的各种信息（如表达丰度、蛋白性内切酶或机械力量切割成一定长 度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重 组并转化相应的宿主细胞体外反转录成cDNA，与适当的载体连接后 转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并 能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息 的自Moloey鼠白血 病病毒）。两者都是依赖于RNA的DNA聚合酶， 有5’→3’DNA聚合酶活性。（目前常用的反转 录酶多是通过点突变去掉RNase H活性的MoMLV）
反转录酶合成DNA时需要引物引导。常用的 引物主要有oligo（dT）引物和随机引物。 ① oligo（dT）引物一般包含15-30个脱氧胸 腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的寡 核苷酸片段； ② 随机引物一般包含6-10个盖基因组的倍数。
1975年Clar（1-p）/ln均插入片段的 长度和： 1）采用部分酶切或随机切割的方法来打断染 色体DNA，以保的插入片段大小所得到的平 均值。
插入效率表示有插入片段的克隆在所检测的
克隆中所占的比例，也是通过电泳检测的。
基因组覆盖倍数的估算方法有2种：
①用公式计算，基因组覆盖倍数=平均插入片 段长度×克隆数/基因组DNA的长度（一般是 约数）； ②结合基因组针筛选到的阳性克隆 的总个数除以使用的总探针数。
三、第二链cDNA的合成 cDNA第二链的合成就是将上一步形成的 mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过 程。 cDNA合成的方法： ①自身引导合成法； ②臵换合成法； ③引导合成法； ④引物-衔接头合成法。
总RNA中富集mRNA是构建cDNA的一个重 要步骤。通过降低rRNA和tRNA含量，可大大 提高筛选到目的基因的可能性。
二、第一链cDNA的合成 由mRNA到cDNA的过程称为反转录，由反转录 酶催化。
常用的反转录酶有2种：AMV（来自禽成髓细
的各种信息（如表达丰度、蛋白性内切酶或机械力量切割成一定长 度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重 组并转化相应的宿主细胞体外反转录成cDNA，与适当的载体连接后 转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并 能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息 的自Moloey鼠白血 病病毒）。两者都是依赖于RNA的DNA聚合酶， 有5’→3’DNA聚合酶活性。（目前常用的反转 录酶多是通过点突变去掉RNase H活性的MoMLV）
反转录酶合成DNA时需要引物引导。常用的 引物主要有oligo（dT）引物和随机引物。 ① oligo（dT）引物一般包含15-30个脱氧胸 腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的寡 核苷酸片段； ② 随机引物一般包含6-10个盖基因组的倍数。
1975年Clar（1-p）/ln均插入片段的 长度和： 1）采用部分酶切或随机切割的方法来打断染 色体DNA，以保的插入片段大小所得到的平 均值。
插入效率表示有插入片段的克隆在所检测的
克隆中所占的比例，也是通过电泳检测的。
基因组覆盖倍数的估算方法有2种：
①用公式计算，基因组覆盖倍数=平均插入片 段长度×克隆数/基因组DNA的长度（一般是 约数）； ②结合基因组针筛选到的阳性克隆 的总个数除以使用的总探针数。
三、第二链cDNA的合成 cDNA第二链的合成就是将上一步形成的 mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过 程。 cDNA合成的方法： ①自身引导合成法； ②臵换合成法； ③引导合成法； ④引物-衔接头合成法。
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选
和仅为4.6%，低丰度 的比例高达95.4% 基因组DNA饱和杂交法&基于复性，使筛选差异 表达基因的可能性大大提高 原理：将含目的基因的组织或器官的mRNA群体作为 待测样本（tester），将基因表达谱相似或相近但不 含目的基因的组织或器官的mRNA群体作为对照样本 （driver），使tester和driver的cDNA进行多次杂交， 去掉在二者之间都表达的基因，而保留二者之间差 异表达的基因。
(3) 引导合成法
Okayama-Berg方法
（4）引物-衔接头合成法
4、双链 cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入 大肠杆菌中繁殖的分子克隆
1.同聚100dA/dT, 20dG/dC) • 同聚尾结合的质粒： cDNA杂合分子转化 E.coli的效率随宿主不 同而不同。
该法聪明地利用了反转录过程中用接头锚定的方法， 与传统法相比，全长cDNA的比例得到大幅提高
2. G
1. 抑制性扣除杂交 suppression subtractive hybridization, SSH
含目的基因的cDNA：供体 tester 不含目的基因的cDNA：驱动 driver
• RsaI消化tester和driver • 将tester一分为二，分别加上接头1和接头2R • 第一轮杂交中，用过量的driver cDNA分别与带两种 接头的tester cDNA杂交 • 第二轮杂交中，将第一轮杂交的两个体系混合，再 加入过量的driver cDNA • 补平第二轮杂交产物的末端，进行两轮PCR扩增 • 巢式引物进行第二轮PCR扩增，富集差异表达基因 • T/A克length cDN因： • cDNA第二链合成工程中聚合酶的外切酶活性； • mRNA降解； • 反转录酶合成特性，从转录复合体上anism at 5' end of RNA • 指导合成高分子量蛋白质的能力 无细胞翻译体系（源于网织红细胞） 哺乳动物总mRNA可编码 10～100kDa蛋白
(3) 引导合成法
Okayama-Berg方法
（4）引物-衔接头合成法
4、双链 cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入 大肠杆菌中繁殖的分子克隆
1.同聚100dA/dT, 20dG/dC) • 同聚尾结合的质粒： cDNA杂合分子转化 E.coli的效率随宿主不 同而不同。
该法聪明地利用了反转录过程中用接头锚定的方法， 与传统法相比，全长cDNA的比例得到大幅提高
2. G
1. 抑制性扣除杂交 suppression subtractive hybridization, SSH
含目的基因的cDNA：供体 tester 不含目的基因的cDNA：驱动 driver
• RsaI消化tester和driver • 将tester一分为二，分别加上接头1和接头2R • 第一轮杂交中，用过量的driver cDNA分别与带两种 接头的tester cDNA杂交 • 第二轮杂交中，将第一轮杂交的两个体系混合，再 加入过量的driver cDNA • 补平第二轮杂交产物的末端，进行两轮PCR扩增 • 巢式引物进行第二轮PCR扩增，富集差异表达基因 • T/A克length cDN因： • cDNA第二链合成工程中聚合酶的外切酶活性； • mRNA降解； • 反转录酶合成特性，从转录复合体上anism at 5' end of RNA • 指导合成高分子量蛋白质的能力 无细胞翻译体系（源于网织红细胞） 哺乳动物总mRNA可编码 10～100kDa蛋白
DNA文库的构建
，包含该生物的所有遗传物质： 编码的、不编码的；应该是物种特异性的 组织（某一类细胞）的mRNA反转录成cDNA构建而成， 因此只包含被表达基因的编码序列（还有mRNA上的3‘、；体现了基因的表达调 控。
真核生物mRNA的结构
2、提取RNA基本步骤
总步骤：裂解细胞、沉淀蛋白、去除DNA、质量分析等； 裂解细胞： 强离液剂：胍盐, SDS, N-laurylsarcosine
(sarcosyl), 尿素, 苯酚 ； 破坏质膜，保持细胞核或细 胞器的完整性 ：如Nonidet P-40 (NP-40)，研磨、蛋白 酶K、蜗牛酶(含纤维素酶、甘露聚糖酶、葡糖酸酶和几丁 质酶等，可破坏酵母菌细胞壁)、SDS等处理； 沉淀蛋白：SDS、β -巯基乙醇、氯仿、苯酚、盐酸胍、异 硫氰酸胍等； 沉淀RNA：乙醇、异丙醇、氯化锂等； RNA质量分析； 从总RNA中纯化分离mRNA； RNA的长期保存。
制备基因组DNA的常用试剂
破碎细胞（液氮研磨、匀浆、超声波破碎） 除去蛋白杂质：（蛋白酶K、SDS、 CTAB、苯
酚）； 除去RNA(RNase A) 除去黏多糖(CTAB); 沉淀DNA（乙醇、异丙醇）； 抑制DNase（EDTA，可以螯合Mg++等）； 脱盐（70%乙醇漂洗）。
关键是对付RNase：措施
为了保证mRNA的完整性，必须使用最新鲜的生物材料， 最好是培养的活细胞，或从活体即刻采集的样品进行制备， 或者置于液氮、超低温冰箱保存的样品；
DEPC处理配置溶液用水：用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯 ，一种很强的RNA酶抑制剂）浸泡处理和高压灭菌；
烘烤玻璃器皿：200-300℃烘烤4小时；塑料器皿：在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底清洗，灭菌，即可去除 RNase；
真核生物mRNA的结构
2、提取RNA基本步骤
总步骤：裂解细胞、沉淀蛋白、去除DNA、质量分析等； 裂解细胞： 强离液剂：胍盐, SDS, N-laurylsarcosine
(sarcosyl), 尿素, 苯酚 ； 破坏质膜，保持细胞核或细 胞器的完整性 ：如Nonidet P-40 (NP-40)，研磨、蛋白 酶K、蜗牛酶(含纤维素酶、甘露聚糖酶、葡糖酸酶和几丁 质酶等，可破坏酵母菌细胞壁)、SDS等处理； 沉淀蛋白：SDS、β -巯基乙醇、氯仿、苯酚、盐酸胍、异 硫氰酸胍等； 沉淀RNA：乙醇、异丙醇、氯化锂等； RNA质量分析； 从总RNA中纯化分离mRNA； RNA的长期保存。
制备基因组DNA的常用试剂
破碎细胞（液氮研磨、匀浆、超声波破碎） 除去蛋白杂质：（蛋白酶K、SDS、 CTAB、苯
酚）； 除去RNA(RNase A) 除去黏多糖(CTAB); 沉淀DNA（乙醇、异丙醇）； 抑制DNase（EDTA，可以螯合Mg++等）； 脱盐（70%乙醇漂洗）。
关键是对付RNase：措施
为了保证mRNA的完整性，必须使用最新鲜的生物材料， 最好是培养的活细胞，或从活体即刻采集的样品进行制备， 或者置于液氮、超低温冰箱保存的样品；
DEPC处理配置溶液用水：用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯 ，一种很强的RNA酶抑制剂）浸泡处理和高压灭菌；
烘烤玻璃器皿：200-300℃烘烤4小时；塑料器皿：在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底清洗，灭菌，即可去除 RNase；
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? 2．高质量大分子量基因组 DNA 的提取践表明，提取的 基因组 DNA 分子量越大，所得到到的 28SrRNA条带的亮度约为 18SrRNA条 带亮度的两倍，说明 RNA样品完整，降解不多，如果两条带 的亮度反过来，说明部分 28SrRNA已降解；如无清晰条带， 表明样品己严重降解。
mRNA的富集对低丰度mRNA显得特别重要。
2）第一链 cDNA 合成 由mRNA到cDNA的过程称反转录，由反转录酶催化。 反转录酶：依赖RNA的 DNA聚合酶，需要引物 反转录引物：oligo(dT)引物和随机引物（不能产生 完整的cDNA)
体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择 机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有 菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因。外源DNA片断、载体、宿主
? 构建基因的基本程序：（1）提取研究对象基因组 DNA,制备合适大小的 DNA 片断，或提取组织或器官的 mRNA并反转录成 cDNA，
2）表达量的差异决定构建 cDNA要具有合适的容量。 3)mRNA的丰度 高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总 mRNA的22% 中等丰度mRNA：200-300 个拷贝，占总 mRNA的49% 低丰度mRNA ：1-15个拷贝，占总 m数目，
Clark和Carbon公式：
N=ln（1-p）段的大小和基因组 DNA 大小
的比值
例：哺乳动物基因组：3×109 Kb p：=99%
一般覆盖倍数达到是基因组的 某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合， 一条染色体或更小的区段（如一个 YAC或BAC克隆 等）。
例如：将基因组 DNA用多种限制性 内切酶切割， Southern杂交
显示目标基因在 8.3kb的Spel片段上
则可将Spel酶切的 基因组DNA中或这一时期的特殊组织。
根 叶 花 花药 茎 穗下节cDNA 第一链的合成、c的基因组DNA或cDNA片段取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
并导入宿主中繁殖。
插
1）mRNA的完整性及mRNA的富集
通常是根据28sRNA和18sRNA条带的亮度判断RNA的 完整性，间接判断mRNA的完整性。
（2）DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成 重组DNA，
（3）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体 菌，
（4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。基因组DNA基因cDNA
基因组与cDNA最大的区别在于cDNA具 有时空特异均插入片段大小20kb
f= 20Kb/3×109 Kb
N=ln（1-p）/ln（1-f） =690构建程序包含 5 个部分：
? ① 载体的制备； ? ② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight
DNA, HMW DNA ）的提取； ? ③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（ PFGE size
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱselection）； ? ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ? ⑤ 重组克隆的挑取高；二是去磷酸化好。
? 寻找最适的载体与基因组之间的 比例。 ? 首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价
高且质量稳定的包装蛋白， ? 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入
片段的 DNA合成
氢氧化钠消化杂合双链中的 mRNA 链 第一链 cDNA 的 3'-末端就会形成一个发夹环 合成第二链 cDNA S1 核酸酶消化连接处
自身引导法合成 cDNA第二链
常用方法
mRNA的富集对低丰度mRNA显得特别重要。
2）第一链 cDNA 合成 由mRNA到cDNA的过程称反转录，由反转录酶催化。 反转录酶：依赖RNA的 DNA聚合酶，需要引物 反转录引物：oligo(dT)引物和随机引物（不能产生 完整的cDNA)
体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择 机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有 菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因。外源DNA片断、载体、宿主
? 构建基因的基本程序：（1）提取研究对象基因组 DNA,制备合适大小的 DNA 片断，或提取组织或器官的 mRNA并反转录成 cDNA，
2）表达量的差异决定构建 cDNA要具有合适的容量。 3)mRNA的丰度 高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总 mRNA的22% 中等丰度mRNA：200-300 个拷贝，占总 mRNA的49% 低丰度mRNA ：1-15个拷贝，占总 m数目，
Clark和Carbon公式：
N=ln（1-p）段的大小和基因组 DNA 大小
的比值
例：哺乳动物基因组：3×109 Kb p：=99%
一般覆盖倍数达到是基因组的 某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合， 一条染色体或更小的区段（如一个 YAC或BAC克隆 等）。
例如：将基因组 DNA用多种限制性 内切酶切割， Southern杂交
显示目标基因在 8.3kb的Spel片段上
则可将Spel酶切的 基因组DNA中或这一时期的特殊组织。
根 叶 花 花药 茎 穗下节cDNA 第一链的合成、c的基因组DNA或cDNA片段取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
并导入宿主中繁殖。
插
1）mRNA的完整性及mRNA的富集
通常是根据28sRNA和18sRNA条带的亮度判断RNA的 完整性，间接判断mRNA的完整性。
（2）DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成 重组DNA，
（3）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体 菌，
（4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。基因组DNA基因cDNA
基因组与cDNA最大的区别在于cDNA具 有时空特异均插入片段大小20kb
f= 20Kb/3×109 Kb
N=ln（1-p）/ln（1-f） =690构建程序包含 5 个部分：
? ① 载体的制备； ? ② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight
DNA, HMW DNA ）的提取； ? ③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（ PFGE size
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱselection）； ? ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ? ⑤ 重组克隆的挑取高；二是去磷酸化好。
? 寻找最适的载体与基因组之间的 比例。 ? 首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价
高且质量稳定的包装蛋白， ? 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入
片段的 DNA合成
氢氧化钠消化杂合双链中的 mRNA 链 第一链 cDNA 的 3'-末端就会形成一个发夹环 合成第二链 cDNA S1 核酸酶消化连接处
自身引导法合成 cDNA第二链
常用方法