基因文库的构建与使用
第三章-基因组文库的构建
三、cDNA克隆载体
Zap cDNA克隆载体来自腺病毒系统，属于 噬 菌粒（phagemid）载体。线状的 Zap cDNA克 隆载体在体内能通过噬菌粒获救(phagemid rescue) 变成环状的表达载体。
(a) 噬菌体连续感染两个不同的E.coli 菌株，在这 两个菌株中一个噬菌体不受“限制”，而另一个 受到“限制”。结果,在kanr 菌落中获救，此菌落 中含有多个拷贝的双链质粒。
巨细胞病毒第三节 cDNA的筛选间接用探针筛选噬菌体cDN相关氨基酸密码子的简 并寡核苷酸探针；
（2）纯化蛋白质的相应抗体探针； （3）针对差异表达基因的扣除
cDNA探针。
探针的特异性可通过以下的策略来解决： ①选基因的特异序列为探针； ②长度不低于17～20nt； ③控制片段但酶的选择和酶切反应条件的选择是取决于克隆载体的类型重组噬菌体细胞基因组噬菌体尼龙膜与放射性探针进行分子杂交用放射自显影定位阳性克隆阳性克隆用限制性酶剪切提取dna用限制性酶剪切用连接酶连接重组体dna细菌感库的构建
用体外包装系统将串联体中单个的基因组DNA分 别包装入不同噬菌体头部，形成不同的重组噬菌 体颗粒。
用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬菌斑。每 一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。
各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
限制性
(a)
酶切位点
Alu散在元件
启动子 外显子探针1 启动子启动子
探针2
探针3
将DNA亚克隆到质粒载体中的通用策略
①根据已知的酶切图谱进行定向克隆
（directed cloning）；
②用常用的限制性酶交错剪切或平切进行
随机亚克隆。
这种策略也称为“鸟枪法（shot-gun）”，即将 完整的基因组或部分基因组的DNA用限制性酶 或机械的方法随是将小片段逐一测序，再拼接 成序列图谱。
cdna基因文库构建的基本路线
cdna基因文库构建的基本路线以cdna基因文库构建的基本路线为标题的文章概述CDNA基因文库是基因组学研究中的一个重要工具，可以用于克隆和表达特定基因。
本文将介绍构建cdna基因文库的基本路线，包括RNA提取、逆转录、cDNA合成、文库构建和筛选等步骤。
第一步：RNA提取构建cdna基因文库的第一步是从所研究的生物样品中提取总RNA。
这可以通过使用商业化的RNA提取试剂盒或经典的酚-氯仿法等方法来实现。
在提取RNA的过程中，需要注意样品的保存和处理，以确保所提取的RNA完整无损。
第二步：逆转录逆转录是将RNA转化为相应的cDNA的过程。
逆转录反应通常使用逆转录酶（Reverse Transcriptase）进行，该酶能够将RNA模板上的信息转录成DNA。
在逆转录反应中，需要加入随机引物、dNTPs和逆转录酶，以及适当的缓冲液。
逆转录反应的温度和时间也需要根据具体的逆转录酶和反应体系进行优化。
第三步：cDNA合成在逆转录反应完成后，需要对产生的cDNA进行纯化。
一种常用的方法是通过酶切和连接反应，将cDNA连接到载体上，形成重组DNA，再通过转化等方法将其导入到大肠杆菌等宿主中。
在cDNA 合成的过程中，需要注意对cDNA的纯化和测序质量的控制，以确保所获得的cDNA具有高质量和完整性。
第四步：文库构建文库构建是指将cDNA插入到合适的载体中，形成cdna基因文库。
常用的载体包括质粒和噬菌体等。
在文库构建的过程中，需要对cDNA和载体进行受限酶切，然后使用DNA连接酶将其连接起来。
连接后的DNA需要进行转化，将其导入到适当的宿主细胞中，形成文库。
不同的文库构建方法有所差异，可以根据实验需求选择合适的方法。
第五步：筛选构建cdna基因文库后，需要对文库进行筛选，以寻找感兴趣的基因。
常用的筛选方法包括杂交筛选、PCR筛选和基于功能的筛选等。
根据所研究的基因或表达产物的特性，可以选择合适的筛选方法。
筛选后的阳性克隆可以进一步进行测序和鉴定，以确认所克隆的基因的准确性和完整性。
基因组文库的构建过程
基因组文库的构建过程1. 基因组文库到底是什么？说到基因组文库，很多人可能会一脸懵，觉得这跟他们平常的生活完全扯不上关系，其实这就是科学家们用来储存基因信息的一种方式。
简单点说，就是把所有的基因像书一样整理好，方便后人查阅、研究和利用。
好比我们会把一本厚厚的食谱分门别类，想吃什么菜随时翻出来，这就是基因组文库的妙处。
在它的庇护下，科研人员就能随时拿出各种基因的“身份证”，让小小的基因发挥出超大能量。
2. 构建基因组文库的步骤2.1 提取DNA首先，咱们得从细胞中提取出DNA，这可是整件事情的开端。
就像从果子里挤出果汁，如果不先把果子准备好，你再想喝到果汁，简直是白日做梦。
提取DNA的过程看似简单，但可得小心谨慎，免得“失之毫厘，谬以千里”。
科学家们用各种化学试剂，像是一场小型的化学派对，最终把DNA提取出来，然后像捡到宝一样，小心呵护着。
2.2 进行切割提取完DNA后，接下来就是切割了！没错，听起来有点儿暴力，但这其实是为了让DNA变得更小，方便我们后面进行分析。
科学家们用一种特别的酶，就像料理大厨用刀切菜一样精准，可以把DNA切割成许多小片段。
每一片都是独特的，有点像拼图的每一块，只等着我们组合拼接。
2.3 建库接下来说到建库，小伙伴们要聚焦了！这一步可是整件事的重头戏。
科学家们会把这些切割好的DNA片段拷贝到一种载体中，类似把拼图放进一个大盒子里，当然这个“盒子”可是经过特殊设计，能确保我们的DNA安全无虞。
这个过程就叫做克隆，听起来是不是有点科幻感？别担心，脑子里别想太多电影情节，这可是正儿八经的科学探索。
3. 筛选和验证3.1 筛选目标片段库建完后，接下来就进入了筛选阶段。
就像我们去超市挑水果，总得挑一些看起来新鲜的，基因组文库也是如此。
一些基因有可能因为各种原因不太好，科学家们会通过培养和筛选，把一些很有潜力的基因片段挑出来。
这其中的细致和耐心，简直堪比工匠精神，得一丝不苟。
3.2 验证质量最后一步是验证，就像做一道菜，你不能光有调料，还得保证味道正宗。
cdna基因文库构建的基本路线
cdna基因文库构建的基本路线CDNA基因文库构建是一种常用的分子生物学技术，用于研究基因表达和功能的调查。
本文将介绍CDNA基因文库构建的基本路线，包括材料准备、RNA提取、反转录、合成cDNA、构建文库和筛选等步骤。
一、材料准备进行CDNA基因文库构建之前，需要准备一些实验材料和试剂。
主要包括：1. 细胞或组织样品：可以是人类、动物或植物的细胞或组织样品。
2. 细胞破碎液：用于细胞破碎和RNA保护，常用的有三种类型：TRIzol、RNeasy Mini Kit和RNAiso Plus。
3. 反转录试剂盒：包括反转录酶、随机引物、dNTPs等。
4. 克隆载体：用于构建基因文库的载体，常用的有质粒载体和噬菌体载体。
5. 细菌培养基和抗生素：用于细菌的培养和筛选。
二、RNA提取RNA提取是构建CDNA基因文库的第一步，目的是从细胞或组织样品中提取总RNA。
常用的提取方法有酚/氯仿法、硅胶膜法和磁珠法等。
提取的RNA应具有较高的纯度和完整性，以保证后续的反转录和文库构建质量。
三、反转录反转录是将提取的RNA转录成cDNA的过程。
在这一步中，需要将RNA模板与反转录酶、随机引物、dNTPs等反转录试剂一起反应，合成cDNA。
反转录的条件包括温度、时间和反应体系等，需要根据试剂盒的说明进行操作。
四、合成cDNA合成cDNA是将反转录得到的第一链cDNA转录成双链cDNA的过程。
一般采用PCR扩增的方法，在反应中加入适量的引物和dNTPs，进行多轮扩增，最终得到足够量的双链cDNA。
合成cDNA的条件包括PCR扩增的循环数、温度和时间等。
五、构建文库构建基因文库是将合成的cDNA插入到克隆载体中的过程。
常用的构建方法有限制性内切酶法、T/A克隆法和引物扩增法等。
在构建文库的过程中，需要将双链cDNA与克隆载体进行连接，形成重组DNA。
连接后的重组DNA可以通过转化到适当的宿主细胞中，得到大量的重组质粒。
六、筛选构建完基因文库后，需要进行筛选以获得感兴趣的基因。
怎样构建基因组文库
i. 两菌株分别培养,分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
sa c B
K anr
p a c lo x P
D N A h ea d fu l
+
+ p a c c le a v a g e
p r o te in
C re
R e c o m b ila tio n
DNA
A m p lific a tio n七. 利用YAC载体构建基因组1. 两臂DNA片段的制备:
第四章基因的建立来自基因文全部遗传信息的重组D因组DNA长度之比
S
C o s o r i A pr S
SalI Cos
S
H
S
S1 Cos
H
BamH I 小片段
Cos
H
35-45kb DNA 片 段
T4 DNA ligase
Cos
H
利
构用
建双
COS
基
因
组质
文粒
S
离体包装
S
库载
感 染 E.coli
体六. 利用P1载体构建基因组构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装
基因工程中为什么要建立基因文库
基因工程中为什么要建立基因文库？基因文库是如何建立的？基因文库是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。
目的：当我们要对某一基因结构和功能进行研究时，首先要获得此基因，最简便的方法就是直接从基因文库中获取。
构建过程：将纯化的细胞基因组DNA用限制性内切酶消化，获得一定大小的DNA片段，将这些片段克隆到载体中，从而获得含有不同DNA片段的噬菌体，这就是基因组文库。
打个比方让你建图书馆，你就得把所有书分门别类放，以便于找。
这么多书你一个人又搞不定，所以你得找一群人，一个人负责一部分，各自干各自的，然后最后一汇总就行了。
基因组文库和cDNA文库一.基因组文库用限制性内切酶切割整个基因组DNA，把所得的大量基因组DNA片段与载体连接，然后转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。
由此而得的克隆中每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段。
这样的一套克隆便称作基因组克隆，而这些克隆中的一套基因组DNA片段则叫做基因组文库(genomic library)。
二.cNDA 文库的构建及应用cDNA基因文库(cDNA library)是指以 mRNA为模板，在反转录酶及其他一系列酶的催化作用下所获得的双链cDNA，经与适当载体连接并转化到寄主细胞内进行扩增，由此而构成包含着相应基因编码序列的一群克隆。
与基因组DNA克隆不同，用作cDNA克隆的真核mRNA，其间隔序列早已在拼接过程中被删除，而由这种成熟mRNA 为模板转变而来的DNA基因，自然也不含有非编码序列。
cDNA克隆除以 mRNA为起始材料这一优点外，其构建比较简易可行，而且由于每一个cDNA克隆都只含有一种mRNA序列，这样在选择中出现假阳性的概率也就较低。
随着分子克隆研究在理论和技术上的进步，cDNA 基因文库的构建不仅是分离基因的重要手段，也是当前真核分子生物学研究的强有力工具。
首先，在基因工程的操作中，以cDNA为探针可从基因组文库中分离出相应的特异基因；其次，cDNA序列只与基因中的编码序列有关，有助于对真核生物mRNA结构和功能的认识；再者，cDNA 克隆还可以有效地分析真核基因的结构和功能。
基因文库的构建与使用
基因工程中，需要将某种生物的遗传信息贮存在 可以长期保存的稳定的重组体中，通常是将目的基因 用适当的工具酶连接到低等微生物如细菌的质粒、噬 菌体等载体上，克复杂的染色体ＤＮＡ 分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的 基因组中将其活跃的化学能储存在ＡＴＰ
中；暗反应是利用光反应产生的ＡＴＰ和ＮＡＤＰＨ把Ｃ０２ 合成糖类等有机物，同时把ＡＴＰ和ＮＡＤＰＨ中活跃的化 学能转变成稳定的化学能贮存在有机物中。 ２．２细胞呼吸生物体的生命活动都需要消耗能量， 这些能量来自生物体内的糖类、脂质和蛋白质等有机 物的氧化分解。细胞呼吸分为有氧呼吸和无氧呼吸两 种类型。有氧呼吸主要在细胞的线粒体中进行，１ｍｏｌ 葡萄糖彻底氧化分解共释放２８７０ｋｊ的能量，其中有 １１６１ｌ【Ｊ左右的能量储存在ＡＴＰ中，其余的能量都以热 能的形式散失了；无氧呼吸释放的能量比有氧呼吸要 少得多，例如，１ｍｏｌ葡萄糖在分饵成乳酸以后，共释放 出１９６．６５ＩｃＪ的能量，其中有６１．０８ｌ【Ｊ的能量储存在 ＡＴＰ中，其余的能量以热能的形式散失了。
・・・・・・・・・・・・・＋？＋・・・・・・・・・・・・・・・・ｔ・・・・・・・・．Ｈ・◆・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・◆－・・・・・。＋＋・位点及选择标记，还具有控制基因表达的序列（如启动子、ＳＤ序 列、Ａ’ｒＧ、终止子等），可在宿主细胞中表达出克隆片段 的编码产物。表达载体又有融合蛋白表是根据蛋白质序列合成的寡核苷酸探针，也可 蛋白质具有 抗原性及生物活性，所以除核酸探针外，还可以用核酸类探针筛选的 目的基因的分离。◆
直接能源
生物体内的直接能源是ＡＴＰ，ＡＴＰ水
解时释放的能量直接用于各项生命活动。而其他形式 的能源物质中所贮存的能量都必须转移到ＡＴＰ中才 能用于各项生命活动。ＡＴＰ与ＡＤＰ之间的转化实现 能量的释放和储存，植物生成ＡＴＰ的途径有光合作用 和呼吸作用，而动物生成ＡＴＰ的途径只有呼吸作用。 １．２主要能源糖类、脂肪和蛋白质等有机物中都含 有大量的能量，这些有机物氧化分解后释放的能量转 移到ＡＴＰ中，用于各项生命活动。但是，生命活动所 利用的能量约７０％是由糖类提供的。所以，糖类是生 命活动的主要能源物质。 １。３储备能源 在生物体内长期贮存能量的物质是 脂肪。脂肪贮存能源的效率最高，１ ｇ脂肪所贮存的能 量是蛋白质和糖类的２倍多，所以在进化过程中，生物 体选择脂肪作为长期贮存能量的物质。 １．４辅助能源 在生物体内的高能磷酸化合物中除 了ＡＴＰ外，还有磷酸肌酸。但是磷酸肌酸中贮存的能 量并不能直接用于各项生命活动，必须转移到ＡＴＰ中 后才能被生命活动利用。生物体全部基使之成为一定大小的片物组织中分离出纯化的基因组ＤＮＡ，用限 制酶进行部分降解或完全降解，得到各种长度的ＤＮＡ 片段；②ＤＮＡ片段与载体连接。常用噬菌体ＤＮＡ作载 体，它既有较高的克隆效率，又可容纳较大的外源 ＤＮＡ片段。用限制性内切酶切割载体ＤＮＡ，使载体形 成与外源ＤＮＡ相匹配的黏性末端。再用ＤＮＡ连接酶 将ＤＮＡ片段与载体连接起来，成为重组ＤＮＡ；③重组 ＤＮＡ的转化和克隆。将重组ＤＮＡ导入受体菌中，进行 体外包装噬菌体进行侵染，或者转化时质粒ＤＮＡ组ＤＮＡ克隆，因此 利用适当的鉴定和筛选方法，就可以从中找到携带所 需要的目的基因片段的重组克隆体。
cdna基因文库名词解释 概述及应用场景
cdna基因文库名词解释概述及应用场景1. 引言1.1 概述CDNA基因文库是指利用互补式DNA（complementary DNA）技术构建而成的一类基因文库，其中包含了特定细胞或组织内所表达的mRNA分子的DNA 复制品。
通过将mRNA转录为cDNA，并将其插入到合适的质粒载体中，科学家们可以获取到特定时期或特定条件下细胞中所表达的全部转录本信息。
CDNA基因文库构建技术是基于反转录酶作用原理而来，通过选取合适的引物和核苷酸，在体外将mRNA逆转录合成相应的cDNA。
这些cDNA分子可进一步克隆到质粒载体中，并在宿主细胞内扩增。
最终形成一个包含大量不同cDNA 片段的基因文库，可供后续研究使用。
1.2 文章结构本文首先会对CDNA基因文库进行详细的名词解释，包括其定义、合成过程及特点以及构建方法与步骤。
接着，将进一步讨论CDNA基因文库在不同领域中的应用场景，尤其是在基因表达研究、蛋白质研究以及新药研发方面的应用。
最后，我们将总结已有的研究成果，并展望CDNA基因文库在未来的发展前景和应用潜力。
1.3 目的本文的目的是为读者提供关于CDNA基因文库的详细解释和应用场景的介绍。
通过阅读本文，读者将更全面地了解CDNA基因文库的概念、构建过程以及其在科学研究中的重要性和广泛应用。
同时，本文也旨在展示CDNA基因文库在基因表达、蛋白质研究以及新药研发等领域所起到的关键作用，为读者理解该技术在科学研究中所扮演的角色提供深入了解。
最后，通过总结已有研究成果并展望未来发展前景，让读者对CDNA基因文库技术有一个更加清晰的认识，并认识到其仍然具有巨大的发展潜力。
2. CDNA基因文库名词解释2.1 CDNA基因文库的定义CDNA基因文库，即亦称为互补脱氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）文库，是一种由转录反应合成的DNA序列集合，其中包含了从细胞中提取的mRNA分子逆转录合成的互补DNA。
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基因工程中，需要将某种生物的遗传信息贮存在 可以长期保存的稳定的重组体中，通常是将目的基因 用适当的工具酶连接到低等微生物如细菌的质粒、噬 菌体等载体上，克复杂的染色体ＤＮＡ 分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的 基因组中将其活跃的化学能储存在ＡＴＰ
中；暗反应是利用光反应产生的ＡＴＰ和ＮＡＤＰＨ把Ｃ０２ 合成糖类等有机物，同时把ＡＴＰ和ＮＡＤＰＨ中活跃的化 学能转变成稳定的化学能贮存在有机物中。 ２．２细胞呼吸生物体的生命活动都需要消耗能量， 这些能量来自生物体内的糖类、脂质和蛋白质等有机 物的氧化分解。细胞呼吸分为有氧呼吸和无氧呼吸两 种类型。有氧呼吸主要在细胞的线粒体中进行，１ｍｏｌ 葡萄糖彻底氧化分解共释放２８７０ｋｊ的能量，其中有 １１６１ｌ【Ｊ左右的能量储存在ＡＴＰ中，其余的能量都以热 能的形式散失了；无氧呼吸释放的能量比有氧呼吸要 少得多，例如，１ｍｏｌ葡萄糖在分饵成乳酸以后，共释放 出１９６．６５ＩｃＪ的能量，其中有６１．０８ｌ【Ｊ的能量储存在 ＡＴＰ中，其余的能量以热能的形式散失了。
１．１
肌酸Ｉ≯Ａ１＇Ｐ＋肌酸，这个反应进行的速度很快，特别
Ｂ擘
是当生物体内储存的ＡＴＰ被大量消耗时，磷酸肌酸中 的高能磷酸键转移到ＡＴＰ中的速度比有机物氧化分 解释放的能量转移到ＡＴＰ的速度要快得多，能及时满 足生理需要，但由磷酸肌酸转化生成的ＡＴＰ的量不能 满足长时间供能，随着磷酸肌酸的消耗，生物体内有机 物（主要是糖类）氧化分解供能系统已逐渐启动，后续 的ＡＴＰ消耗主要由呼吸作用提供，因此，磷酸肌酸被 称为辅助能源。 ２细胞水平的能量变化 生物光合作用和呼吸作用过程中蕴含着细胞水平 的能量变化，两者构成了能量代谢的细胞学基础。绿 色植物叶肉细胞进行光合作用将无机物合成有机物， 同时储存能量；生物细胞呼吸分解有机物，同时释放能 量供给各项生命活动的需要。 ２．１光合作用 光合作用在植物叶肉细胞的叶绿体中 进行，分为光反应和暗反应两个阶段。光反应是把光能
直接能源
生物体内的直接能源是ＡＴＰ，ＡＴＰ水
解时释放的能量直接用于各项生命活动。而其他形式 的能源物质中所贮存的能量都必须转移到ＡＴＰ中才 能用于各项生命活动。ＡＴＰ与ＡＤＰ之间的转化实现 能量的释放和储存，植物生成ＡＴＰ的途径有光合作用 和呼吸作用，而动物生成ＡＴＰ的途径只有呼吸作用。 １．２主要能源糖类、脂肪和蛋白质等有机物中都含 有大量的能量，这些有机物氧化分解后释放的能量转 移到ＡＴＰ中，用于各项生命活动。但是，生命活动所 利用的能量约７０％是由糖类提供的。所以，糖类是生 命活动的主要能源物质。 １。３储备能源 在生物体内长期贮存能量的物质是 脂肪。脂肪贮存能源的效率最高，１ ｇ脂肪所贮存的能 量是蛋白质和糖类的２倍多，所以在进化过程中，生物 体选择脂肪作为长期贮存能量的物质。 １．４辅助能源 在生物体内的高能磷酸化合物中除 了ＡＴＰ外，还有磷酸肌酸。但是磷酸肌酸中贮存的能 量并不能直接用于各项生命活动，必须转移到ＡＴＰ中 后才能被生命活动利用。反应方程式为：ＡＤＰ＋磷酸
ｘ
１／４＝１／８。◆
万方数据
・６６・
高中生物学中有关能量的知各项生命活动都需要能量的参与，能 量是生命活动的动力，物质是能量的载体，物质的合成 和分解伴随着能量的储存和释放。在高中生物学教材 中有多处涉及到能量知识，本文从分子水平、细胞水 平、个体水平、生态系统水平四个层次总结了与能量有 关的问题。 １分子水平的能源物质 生物体内的各种有机物都可作为能源物质，但在 能量代谢过程中所起的作用又有所不同。按作用不同 可分为能源物质、直接能源物质、主要能源物质、储能 物质、高能化合物等。虽然糖类、脂类、蛋白质都可以 作为能源物质，但供能先后顺序却不同，它们在动物体 内供能的先后顺序生物体全部基使之成为一定大小的片物组织中分离出纯化的基因组ＤＮＡ，用限 制酶进行部分降解或完全降解，得到各种长度的ＤＮＡ 片段；②ＤＮＡ片段与载体连接。常用噬菌体ＤＮＡ作载 体，它既有较高的克隆效率，又可容纳较大的外源 ＤＮＡ片段。用限制性内切酶切割载体ＤＮＡ，使载体形 成与外源ＤＮＡ相匹配的黏性末端。再用ＤＮＡ连接酶 将ＤＮＡ片段与载体连接起来，成为重组ＤＮＡ；③重组 ＤＮＡ的转化和克隆。将重组ＤＮＡ导入受体菌中，进行 体外包装噬菌体进行侵染，或者转化时质粒ＤＮＡ组ＤＮＡ克隆，因此 利用适当的鉴定和筛选方法，就可以从中找到携带所 需要的目的基因片段的重组克隆体。
・・・・・・・・・・・・・＋？＋・・・・・・・・・・・・・・・・ｔ・・・・・・・・．Ｈ・◆・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・◆－・・・・・。＋＋・位点及选择标记，还具有控制基因表达的序列（如启动子、ＳＤ序 列、Ａ’ｒＧ、终止子等），可在宿主细胞中表达出克隆片段 的编码产物。表达载体又有融合蛋白表是根据蛋白质序列合成的寡核苷酸探针，也可 蛋白质具有 抗原性及生物活性，所以除核酸探针外，还可以用核酸类探针筛选的 目的基因的分离。◆
１．１
后将这些ｃＤＮＡ装入载体，而构建成的一个含有各种 ｃＤＮＡ克隆的克隆群。这是获得具有编码序列蛋白质 基因的常用手段。ｃＤＮＡ的构建主要步骤有：①高质量 ｍＲＮＡ的制备。真核生物ｍＲＮＡ仅占总ＲＮＡ含量的 ２％一５％。利用亲和层析法分离出ｍＲＮＡ。再对ｍＲ． ＮＡ按大小分级，使ｍＲＮＡ具有适当的长度。接下来对 ｍＲＮＡ的翻译活性进行检验；②反转录生成ｅＤＮＡ。以 有翻译活性的ｍＲＮＡ为模板在反转录酶的作用下进行 反转录，形成ＲＮＡ—ＤＮＡ杂交分子。用核酸酶Ｈ使 ＲＮＡ—ＤＮＡ杂交分子中的ＲＮＡ降解，使之变成单链 ＤＮＡ。以单链ＤＮＡ为模板，在ＤＮＡ聚合酶的作用下 合成另一条互补的ＤＮＡ链，形成双链ＤＮＡ分子，即 ｃＤＮＡ；③ｃＤＮＡ与载体连接。将ｃＤＮＡ的两端加上人工 化学方法合成的人工接头。它是其序列中含有限制酶 识别位点的寡核苷酸片段。用连接酶把接头和双链 ｃＤＮＡ相互连接，再用限制酶切割，使原来的平末端的 ｃＤＮＡ变成黏性末端，插入到已用限制酶处理的载体 中，并用ＤＮＡ连接酶连接起来；④重组ＤＮＡ的转化和 克隆。将ｃＤＮＡ与载体连接成的重组ＤＮＡ导入到受体 菌菌群中储存，每个受体菌都含有一段不同的ｃＤＮＡ。 如果用到的载体为噬菌体时，含有ｃＤＮＡ的重组噬菌 体还需要经过体外蛋白质外壳包装反应，才能成为具 有侵染和复制能力的成熟噬菌体；⑤筛选鉴定ｅＤＮＡ。 当获得了含重组ＤＮＡ的宿主细胞时。即完成了基因的 克隆。利用适当的鉴定和筛选方法，就可以从中找到 携带所因克隆后还 要对克隆的基行必要的检测与分析：如进行序列测定，体外转录及翻 译、功能互补实验等。通过这些实验确定出基因的结 构及功能。到这时才能算分离到了目的基因。所以， 基因的克隆、克目的，选择其中一种。在分离ＲＮＡ病 毒基因，研究功能蛋白序列，分离特定发育阶段或与使用
作者： 作者单位： 刊名： 英文刊名： 年，卷(期)： 王德枝 福建省石狮石光华侨联合中学,362700 生物学教学 BIOLOGY TEACHING 2010,35(12)
本文链接：/Periodical_swxjx201012040的ｍＲＮＡ为模板经反转录变成双链ＤＮＡ（ｃＤＮＡ），然
遗传。有一个蓝眼色觉正常的女子与一个褐眼色觉正 常的男子婚配，生了一个蓝眼色盲的男孩，这对夫妇生 出蓝眼色盲男孩的概率是多少？ 简析：由题意推得双亲基因型分别为：父亲 Ａａ）【ＢＹ与母亲ａａＸＢＸ“，因此蓝眼孩子的概率为１／２， 色盲男孩（全部后代中色盲的男孩）的概率为１／４，故 蓝眼色盲男孩的概率为１／２