基因组DNA 文库的构建演示教学
cDNA和基因组文库DNA的构建
结构 环状
线状 环状
E.coli E.coli E.coli 酵母细胞
环状 环状 环状 线性染色体
哺乳动物细胞 动物细胞
环状 环状
动物细胞和细 菌
环状
插入片段 很小,<8kb
9-24kb <10kb
35-45kb 约300kb 100-800kb
1002000kb >1000kb
举例 pUC18/19 ,某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体；cDNA是指含有所有重组cDNA的克隆群体.
基因组：来源于基因组DNA,反映基因组的全部信息,用 于基因组物理图谱的构建,基因组序列分析,基因在染色体上的定位, 基因组中DNA (互补DNA）
第二条DNA链
1：反转录酶催化合成cDNA第一链
• 1 . 1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成： poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl 1mol/L KCl 3.5μl 250 mmol/L MgCl2 2μl dNTP溶液（含4种dNTP,每种5mmol/L） 10μl 0.1 mol/L DTT 2μl RNase抑制剂（选用） 25单位 加H2O至 48μl 1 . 2.当所有反应组在0℃混合后,取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内. 在这个小规模反应管中加入0.1μl α-32P dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）.
4：接头或衔接子的连接
cDNA末端的削平 4.1.cDNA样品于68℃加热5 min. 4.2.将cDNA溶液冷却至37℃并加入下列试剂： 5×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 10μl dNTP溶液,每种5 mmol/L 5μl 加H2O至 50μl 4.3.加入1~2单位T4噬菌体DNA聚合酶（500单位/ml）,37℃温育 15min. 4.4.加入1μl 0.5mol/L ED . 5.在所有四小份样品（来自步骤2和步骤4）加入 100 ng质粒DNA或500 ng的λ噬菌体DNA.这些未甲基化 的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率. 3 . 6.所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37℃ 温育1h. 3 . 7.于68℃加热15min,用酚：氯仿抽提大体积反应液 一次,再用氯仿抽提一次. 3 . 8.在大体积反应液中加入0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠 （pH5.2）和2倍体积的乙醇,混匀后贮存于-20℃直至获 得小样反应结果.
7.DNA 文库的构建
cDNA 第二条链的合成在 cDNA 的构建中 非常重要， 非常重要，有：自身引导法，置换合成法，引 自身引导法，置换合成法， 导合成法，引物－ 导合成法，引物－衔接头合成法可以后可以通过表型筛选法、杂交筛 选和 PCR 筛选、免疫筛选法筛选目标基因。 筛程序包括：
1、提取研究对象基因组 DNA ，制备合适大 小的 DNA 片段，或提取组织或器官的 mRNA 片段， 并反转录成 cDNA ； 2、DNA 片段或 cDNA 与经特殊处理的载体 连接形成重组 DNA ； 3、重组 DNA 转化宿主细胞或体外包装后侵 染受体菌； 染受体菌； 4、阳性重组菌落或噬菌斑的选择。 阳性重组菌落或噬菌斑有不同， 构建。 连接产物不用电转化的方法转化宿主，而是采 连接产物不用电转化的方法转化宿主， 用包装蛋白进行包装并侵染宿主。 用对简单， 其需要很多特殊的处理以及必要的仪器设备， 其需要很多特殊的处理以及必因组覆盖倍数的计算方法一般包括两个过程 1.计算法，基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度× 1.计算法，基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度×克 计算法 隆数/ 隆数/基因组 DNA 的长度（一般是约数）； 的长度（一般是约数）； 2.结合基因组覆盖度的检测来进行的。 2.结合基因组覆盖度的检测来进行的。基因组覆盖覆盖倍数又等于 该基因位点的覆盖倍数，因此， 所有探针筛到的阳性克隆的总个数/ 所有探针筛到的阳性克隆的总个数/使用的总探针数的比 值。代表性和随机性 二、代表性和随机性
代表性是指中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可 片段寻找最适的比 例。 在电转化和包装侵染过程中， 在电转化和包装侵染过程中，首先选择转化 效率高的感受态细胞或行脱盐处理也可以明显地提高 其效率。 其效率。 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不 对于电转化而言， 同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同。 的转化效率也有所不同。
基因组DNA文库构建实验技巧
基因组DNA文库构建实验技巧基因组DNA文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。
通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。
一、分离基因组DNA（gDNA）毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。
研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。
二、处理基因组DNA根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。
不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。
比如，对于黏粒载体（比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM），合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体（比如Epicentre的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM），平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。
构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。
构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。
需要注意：（1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。
用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA 来做marker，既方便又准确。
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选
(3) 引导合成法
Okayama-Berg方法
（4）引物-衔接头合成法
4、双链 cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入 大肠杆菌中繁殖的分子克隆
1.同聚100dA/dT, 20dG/dC) • 同聚尾结合的质粒： cDNA杂合分子转化 E.coli的效率随宿主不 同而不同。
该法聪明地利用了反转录过程中用接头锚定的方法， 与传统法相比，全长cDNA的比例得到大幅提高
2. G
1. 抑制性扣除杂交 suppression subtractive hybridization, SSH
含目的基因的cDNA：供体 tester 不含目的基因的cDNA：驱动 driver
• RsaI消化tester和driver • 将tester一分为二，分别加上接头1和接头2R • 第一轮杂交中，用过量的driver cDNA分别与带两种 接头的tester cDNA杂交 • 第二轮杂交中，将第一轮杂交的两个体系混合，再 加入过量的driver cDNA • 补平第二轮杂交产物的末端，进行两轮PCR扩增 • 巢式引物进行第二轮PCR扩增，富集差异表达基因 • T/A克length cDN因： • cDNA第二链合成工程中聚合酶的外切酶活性； • mRNA降解； • 反转录酶合成特性，从转录复合体上anism at 5' end of RNA • 指导合成高分子量蛋白质的能力 无细胞翻译体系（源于网织红细胞） 哺乳动物总mRNA可编码 10～100kDa蛋白
宏基因组文库构建
载体的选择：
可装载的外源DNA
Plasmid
<10kb
λ Phage Cosmid BAC YAC
0-23kb ~45kb ~ 100kb ~ 300kb-1.2Mb
粘粒克隆所需的克隆子数是λ phage的一半， 如λ 需700000时，cosmid需350000个
如无特殊需要(如单个λ phage不能包容靶基因片段 或要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克 隆时)一般不采用cosmid，因其在构建和贮存 比λ phage困难得多
1976年L.Clark,p)/基因组DNA大小的比值
哺乳动物 3×109kb 若p=99% 平均克隆片段20kb
• 分解基因: 苯环化合物, 分解酶
• 功能活性：杀虫，酶 • 启动子/复制子
Vector
Amp ori
MCS
Tet gene without promoter
将目标DAN切割成小片段, 插入MCS 在Tet 平板上筛选抗性菌落, 可得到promoter
其他标记: gfp, Kan
eria in pure culture is typically the first step in investigating bacterial processes.
standard culturing techniques account for 1% or less of the bacterial diversity in most environmenta phylogenetic diversity of uncultured microorganisms is only the first step.
assign ecological roles to them.
第八章 DNA文库的构建
S1 核酸酶将连接处（仅该位点处为单链结构）切断 形成平端结构可以进行连接。
获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失
自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失
G 5‘ppp’5 G
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp NaOH 煮沸 5’
TTTTTTTTTTTTTTp
很多特殊的处理以及必要的仪器设备，尤其是构建插入片段较大的如 PAC 、 BAC 和 YAC 文
库，其成功的关键都体现载体的制备
② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取 ③ 高质量大相对分子质量 DNA 的部分酶切与脉 冲电泳分级分离（PFGE size selection）
2. mRNA 的丰度
高丰度 mRNA （abundant mRNA） 约有几十种, 5000拷贝/cell 珠蛋白 免疫球蛋白（immune globulin） 卵清蛋 白（egg albumin）
在特定细胞中占50-90%
中等丰度mRNA 1000-2000, 200-300拷贝/cell
实践表明，提取的基因组 DNA 分子量越大，所得 找最适的比例
在电转化和包装侵染过程中：
最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价 高且质量稳定的包装蛋白 研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显 地提高其效率 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同 插入片段的 DNA 的全部或部分基因的集合， 某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体 在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择 机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体）所有 阳性菌落（或噬菌
遗留在 5'-末端的一段很小的 mRNA 也被大肠杆 菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 5'--3' 核酸外切酶和 RNA 酶 H 降解，暴露出与第一链 cDNA 对应的 3'-端 部分序列。同时，大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 3'--5' 核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链 cDNA 的 3'-端部分消化掉，形成平端或差不多 的平端。这种方法合成的 cDNA 在 5'-端存在几 个核苷酸缺失，但 complementary DNA , cDNA）。 cDNA 是由生物的 某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体 外反转录后形成的双链 cDNA胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该 生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很 大差异。
基因组文库、cDNA文库的构建和筛选
物理剪切—利用振荡、超声等物理方法剪 切可以非常随机地进一步将长片段切割成 小片段，片段末端通常都是平末端
限制性酶解—位点非随机分布。常用的酶 是Sau3A，该酶产生的酶切黏性末端与 BamHI酶解载体产生的末端相同
基因组DNA片段的限制性内切酶酶解
• 使用限制性内切酶酶解基因组DNA可产生非 随机片段，为了获得15－25kb的或更大的基 因组DNA片段（适用于λ噬菌体或黏粒载体 的片段），需要进行部分酶解，即通过合理 使用限制性内切酶（种类和用量），调节酶 切片段的大小
• 也可用反转录酶或Klenow酶延伸引物来合 成第二链。
•
cDNA末端的处理
• 由于大片段的平末端连接效率非常低，因 此为了避免用平末端体（EMBL3等）
• EMBL3 ：载体大小为 43kb ，其左臂、右臂和 填充片段的大小分别为 20kb、 9kb 和 14kb 。 从提高克隆效率角度来看，它们克隆 DNA 片段
的大小为 9-23kb 。在填充片段中带有 red 和 gam 基因，当外源片段替换填充片段后，重组 体将变成 red-gam- ，同时载体上含有 chiC 位
mRNA的提取
• 全长mRNA具有 一个polyA的3’ 末端，可以被用 于mRNA的分离；
• 可以用寡聚纤维 素柱，选择性地 吸附mRNA
• 纯化
• 用结合有寡聚（dT ）的磁珠加到细胞裂解 液，在用强磁铁吸出磁珠并洗出mRNA。
检测mRNA
• 翻译，检测翻译产物： 用无细胞翻译系统（如麦胚抽提液 或兔网织红细胞裂解液）来检测 mRNA的完整性，也可用凝胶电泳 直接检测，用杂交法分离 mRNA。
示差筛)
• 扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cD)得以实现的。
基因组DNA测序文库构建
基因组DNA测序文库构建1.对收到的DNA样品进行检测，取2-3ul样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含RNA或蛋白）的DNA样品需要柱纯化后重新检测。
对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。
对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无目的条带则无细菌基因组污染，若出现目的条带则存在污染，需要去除后建库。
2.用Qubit检测DNA样品浓度。
3.吸取部分DNA样品，用TE或Elution Buffer稀释，终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间，体积为130ul。
用Covaris破碎，破碎时请根据需要片段大小，按标准操作流程操作。
4.样品足够多的情况下，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。
5.对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul异丙醇）浓缩回收，加入50-100ulTE或Elution Buffer洗脱。
回收产物用Qubit测值。
6.修平和磷酸化100ul体系DNA 1ug5 X T4 polymerase buffer 20ulBSA (5mg/ml) 2ulATP (100mm) 1uldNTP（10mm）10ulT4 DNA Polymerase (5U/ul) 1ulKlenow（10U/ul）1ulT4 PNK (10U/ ul) 1.5ul22°C反应20min，柱式法纯化,50-100ul TE洗脱。
纯化后Qubit测值。
7.加‘A’100ul体系DNA 0.5-2.5ug10 X klenow buffer 10uldATP(10mm) 1-3ulKlenow(exon-)（5U/ul）1-3ul37°反应20min，柱式法纯化，50-100ul TE洗脱。
纯化后Qubit测值。
8.连接头200ul体系10 X T4 DNA ligase buffer 20ulPEG4000 30ulATP(100mm) 2ulDNA X接头 YT4 DNA ligase 1.5-2ul加水至 200ulDNA与接头的摩尔比约在1:3至1:10之间。