BAC文库构建
基因组文库构建
SI 酶 降 解 发 夹 结 构 末 端 转 移 酶 dGTP 末 端 转 移 酶 加 寡 聚 C CCC CCC GGG GGG 连 接
转 化 E .c o li 扩 增 以 质 粒 为 载 体 构 建 cD N A 文 库
四.大容量克隆载体
基因组作图中使用的高容量人工染色体克隆载体的比较。
载体 YAC( 酵母人工染色体 ) 系统 酵母着丝粒 , 复制起始 点和端粒 克隆容量 200kb ～2Mbp 评价 嵌合 发生 率高 ( 在 基因 组 中不相连的连续片段) ； 不稳定 (自发缺失 )； 很难与酵母染色体分离； 稳定，但在细菌外难以维 持
TTTTTT
TTTTTT AAAAAA
通 过 以 下 途 径 将 cDNA 插 入 载 体 a. 平 端 克 隆 b. 加 接 头 c. 进 一 步 进 行 同 聚：裸露的噬菌体重组DNA转化宿主细胞或 包装后转染宿主细胞。 载体筛选：在细菌菌苔中形成噬菌斑。 重组筛选： 插入载体—通过可见标记的插入失活(cI基 因的打断阻止溶源性，产生的噬菌体更清澈； 现代的载体携带lacZ基因，以兰-白筛选)。
(a) 随 机 六 碱 基 NNNNNN (c)发 夹 引 物
AAAAAAA mRNA (b)寡 聚 (dT)引 物 第 一 条 cDNA 的 合 成 An An Tn (d)同 聚 物 加 尾 反 应
第 二 条 cDNA 的 合 成 TTTTTT GGGGGG CCCCCC 加接头 1 TTTTTT GGGGGG AAAAAA CCCCCC 切除发夹 TTTTTT AAAAAA 加接头 2 TTTTTT AAAAAA 经酶切进行定向克隆 cDNA 克 隆
PAC(P1 人工染色体 ) BAC( 细菌人工染色体 ) MACs( 哺乳类人工染色 体)
7.DNA 文库的构建
cDNA 第二条链的合成在 cDNA 的构建中 非常重要， 非常重要，有：自身引导法，置换合成法，引 自身引导法，置换合成法， 导合成法，引物－ 导合成法，引物－衔接头合成法可以后可以通过表型筛选法、杂交筛 选和 PCR 筛选、免疫筛选法筛选目标基因。 筛程序包括：
1、提取研究对象基因组 DNA ，制备合适大 小的 DNA 片段，或提取组织或器官的 mRNA 片段， 并反转录成 cDNA ； 2、DNA 片段或 cDNA 与经特殊处理的载体 连接形成重组 DNA ； 3、重组 DNA 转化宿主细胞或体外包装后侵 染受体菌； 染受体菌； 4、阳性重组菌落或噬菌斑的选择。 阳性重组菌落或噬菌斑有不同， 构建。 连接产物不用电转化的方法转化宿主，而是采 连接产物不用电转化的方法转化宿主， 用包装蛋白进行包装并侵染宿主。 用对简单， 其需要很多特殊的处理以及必要的仪器设备， 其需要很多特殊的处理以及必因组覆盖倍数的计算方法一般包括两个过程 1.计算法，基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度× 1.计算法，基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度×克 计算法 隆数/ 隆数/基因组 DNA 的长度（一般是约数）； 的长度（一般是约数）； 2.结合基因组覆盖度的检测来进行的。 2.结合基因组覆盖度的检测来进行的。基因组覆盖覆盖倍数又等于 该基因位点的覆盖倍数，因此， 所有探针筛到的阳性克隆的总个数/ 所有探针筛到的阳性克隆的总个数/使用的总探针数的比 值。代表性和随机性 二、代表性和随机性
代表性是指中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可 片段寻找最适的比 例。 在电转化和包装侵染过程中， 在电转化和包装侵染过程中，首先选择转化 效率高的感受态细胞或行脱盐处理也可以明显地提高 其效率。 其效率。 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不 对于电转化而言， 同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同。 的转化效率也有所不同。
北师大bac培养方案
北师大BAC培养方案目标北师大BAC培养方案旨在为学生提供全面的教育，培养他们的学术能力、实践能力和综合素质，使他们具备扎实的学科基础知识、创新思维和社会责任感。
通过多元化的教育和实践活动，帮助学生发展个人潜能，为未来的职业发展做好准备。
实施步骤第一阶段：课程设置与改革1.评估现有课程体系：对现有的课程体系进行评估，确定其中存在的不足之处，并提出改革建议。
2.设计新的课程体系：根据评估结果和教育目标，设计新的课程体系。
该体系应包括核心课程、选修课程和实践环节。
3.引入跨学科课程：为了培养学生的综合素质和跨学科能力，引入一些跨学科课程，如人文科学与社会科学交叉研究、艺术与科技融合等。
4.提供个性化选修：根据学生的兴趣和特长，提供个性化选修课程，让学生能够自主选择适合自己发展方向的课程。
第二阶段：教学方法改革1.推行小班教学：将大班授课改为小班教学，以便教师更好地关注每个学生的学习情况，并提供更多的互动和讨论机会。
2.引入问题驱动的学习：通过引入问题驱动的学习方法，激发学生的思考和独立解决问题的能力。
教师可以提出一系列实际问题，并引导学生进行研究和讨论。
3.鼓励合作学习：鼓励学生之间的合作学习，通过小组项目和团队作业，培养他们的团队合作精神和沟通能力。
4.提供实践机会：为了将理论知识与实践结合起来，提供实践机会给学生。
例如，组织社区服务活动、实习机会以及参与科研项目等。
第三阶段：评估与反馈1.设立评估机制：建立一个完善的评估体系，对该培养方案进行定期评估。
包括学生的学习成果评估、教师的教学质量评估以及整体方案的实施效果评估。
2.收集反馈意见：定期收集学生和教师对该培养方案的反馈意见，以了解其可行性和效果，并根据反馈意见进行调整和改进。
3.提供个性化辅导：根据评估结果和反馈意见，为学生提供个性化辅导，帮助他们解决学习中遇到的问题并提供发展建议。
预期结果1.学生综合素质提高：通过全面的教育和实践活动，学生将具备扎实的学科基础知识、创新思维和社会责任感。
bac方案
1. 引言BAC（Build, Analyze, and Compare）是一种软件开发方案，旨在帮助开发团队高效地构建、分析和比较软件系统。
本文档将介绍BAC方案的详细内容，包括方案的背景、核心流程和实施步骤。
2. 背景在软件开发过程中，开发团队需要面对如何构建、测试和比较不同版本的软件系统的问题。
传统的开发流程通常存在一些问题，比如缺乏标准的构建过程、无法有效地分析和比较不同版本的软件系统等。
为了解决这些问题，BAC方案应运而生。
3. 核心流程BAC方案的核心流程由三个阶段组成：构建、分析和比较。
下面将对每个阶段进行详细介绍。
3.1 构建阶段构建阶段是BAC方案的首要任务。
在这个阶段，开发团队需要根据软件需求和设计文档，使用合适的开发工具和技术进行代码编写和系统构建。
构建阶段的关键步骤包括：•编写代码：根据需求和设计文档，开发团队需要编写符合规范和可维护性要求的代码。
•系统构建：使用合适的编译工具和构建工具对代码进行编译和构建，生成可执行的软件系统。
3.2 分析阶段分析阶段是BAC方案的核心步骤之一。
在这个阶段，开发团队需要对构建好的软件系统进行分析，以评估系统的性能和质量。
分析阶段的关键步骤包括：•性能测试：通过模拟用户负载和压力测试，评估系统在不同负载条件下的性能表现。
•质量评估：使用静态分析工具和代码检视技术，检查代码的规范性、可读性和可维护性等方面的质量指标。
•可靠性分析：通过测试用例和用例库的使用，评估系统的可靠性和健壮性。
3.3 比较阶段比较阶段是BAC方案的最后一个阶段。
在这个阶段，开发团队需要比较不同版本的软件系统，以评估系统的变化和改进情况。
比较阶段的关键步骤包括：•版本管理：使用版本控制系统来管理和控制不同软件版本的变更和版本历史。
•差异比较：使用差异比较工具对不同版本的代码进行比较，以识别出代码的变化和改进。
•效果评估：比较不同版本的软件系统，并评估系统的性能、质量和可靠性等方面的改进情况。
文库构建及酵母双杂交技术
应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总
RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸
cDNA克隆时，必须考虑到目的基因mRNA在特定的生物体组织 中的含量问题。根据mRNA分子含量的多寡（丰度），可将其划分 为高丰度、中丰度和低丰度三种类型。
第四章
寡聚(dTA)n R6 R6 R6 第一链合成
筛选标志：LEU2
4.6 酵母双杂交的实验过程
报告基因：HIS（合成组氨酸）
4.6.1 把蛋白A插入到BD质粒上（pGBT9） 4.6.2把蛋白B插入到AD质粒上（pGAD424）
4.6.3 两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c）
4. 6.4筛选观察
（1）存活选择 在缺少亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）培 养基上筛选双载体转化子。 双载体转化才能合成亮氨酸和色氨 酸，菌体存活。 TrpLeu-
附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。
PolyAT tract mRNA 成cDNA 可同时在反转录系统中加入Oligo(dT)12-18-mer及随机引 物R6，以保证得到全长cDNA； 应选用活性较高的反转录酶(Reverse transcriptas)； 应选用甲基化dCTP； 应保证所获得双链cDNA的方向性。
•3`-Full RACE法
cDNA 5′ 端的快速扩增法
（5′RACE 法）
(RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends)
bac方案
BAC方案1. 背景BAC（Build, Analyze, and Criticize）是一个软件开发中的全过程管理方法。
在软件项目开发过程中，随着项目规模的增大和团队成员的增加，有效的管理和协作变得尤为重要。
BAC方案旨在提供一种系统化的方法，使团队能够高效地构建、分析和批评软件项目。
2. 构建阶段2.1 确定需求构建软件项目的第一步是明确需求。
在这个阶段，项目团队需要与客户和利益相关者进行充分的沟通，了解他们的期望和需求。
可以采用以下方法来确定需求：•会议和讨论：组织会议或小组讨论，直接与客户和利益相关者交流，并获取相关信息。
•用户故事：编写用户故事，描述用户在某个特定场景下的需求和期望。
•原型设计：使用原型设计工具创建软件界面的草图，以便更好地理解用户需求。
2.2 设计系统架构在确定了需求之后，下一步是设计系统的架构。
系统架构定义了软件项目的整体结构，包括模块、组件和它们之间的关系。
在设计系统架构时，需要考虑以下因素：•扩展性：系统应该能够方便地扩展，以适应未来的需求变化。
•可维护性：设计应该使系统易于维护和修改。
•性能：系统应具备足够的性能，以满足用户的需求。
2.3 实施实施阶段是将设计好的系统架构转化为实际的软件产品的过程。
在这个阶段，开发团队需要编写代码、进行单元测试和集成测试，并持续地进行代码审查和质量控制，以确保开发出高质量、符合需求的软件产品。
3. 分析阶段在构建阶段完成之后，需要进行分析来评估软件项目的质量和性能。
分析阶段的主要目标是发现和解决潜在的问题，以确保软件产品的稳定性和可靠性。
3.1 功能测试功能测试是验证系统是否满足需求的过程。
测试应该覆盖所有的功能和用户故事，并针对不同的使用场景进行测试。
测试结果应该记录并及时修复发现的问题。
3.2 性能测试性能测试是评估系统在不同负载下的性能指标的过程。
测试应该模拟正常和异常负载情况，以确保系统能够稳定地运行并响应用户请求。
3.3 安全性测试安全性测试是评估系统的安全性和防护能力的过程。
BAC文库的构建
BAC文库构建技巧基因组DNA文库构建实验技巧基因组DNA文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。
通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。
一、分离基因组DNA（gDNA）毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。
研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA 分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。
二、处理基因组DNA根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。
不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。
比如，对于黏粒载体（比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM），合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体（比如Epicentre 的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM），平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。
构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。
构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。
需要注意：（1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。
用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。
bac载体工作原理
bac载体工作原理Bac载体是一种广泛应用于基因工程和生物技术领域的工具，它能够有效地将外源基因导入到靶细胞中。
它的工作原理主要包括载体构建、转染和基因表达三个步骤。
一、载体构建载体是一种能够携带外源基因并将其导入到靶细胞中的DNA分子。
在构建bac载体时，首先需要选择合适的载体骨架。
常见的bac载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等。
在选择载体骨架时，需要考虑到载体的稳定性、复制能力和基因插入的效率等因素。
需要将目标基因插入到载体DNA分子中。
这一步骤常常通过限制性内切酶切割和连接酶连接的方法完成。
首先，将载体DNA和目标基因分别进行酶切，生成具有互补末端的DNA片段。
然后，利用连接酶将目标基因与载体连接起来，形成重组DNA分子。
最后，将重组DNA分子转化到宿主细胞中，通过筛选和鉴定，得到含有目标基因的bac载体。
二、转染转染是指将构建好的bac载体导入到靶细胞中的过程。
常见的转染方法包括热激冲击法、电穿孔法和病毒介导转染等。
这些方法都可以有效地将bac载体导入到靶细胞中，实现基因的传递。
在转染过程中，首先需要选择适合的转染方法。
不同的转染方法有不同的优缺点，需要根据实验需求选择合适的方法。
其次，将构建好的bac载体与靶细胞进行共培养或注射，使其发生接触和交互作用。
最后，通过合适的培养条件和筛选方法，筛选出含有目标基因的转染细胞。
三、基因表达基因表达是指在转染细胞中使目标基因得到表达的过程。
在bac载体中，通常会引入启动子和选择性标记基因等元件来调控基因的表达。
启动子可以使基因在特定的时间和空间表达，而选择性标记基因则可以通过筛选方法来选择表达了目标基因的细胞。
在基因表达过程中，首先需要确定适合的培养条件，包括培养基的配方、温度和气氛等。
其次，需要选择适当的检测方法来验证基因的表达情况。
常用的检测方法包括荧光显微镜观察、Western blotting和实时定量PCR等。
最后，可以根据实验需求对基因表达进行进一步的研究和分析。
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(转载)BAC文库构建技巧
(2011-07-21 09:39:20)
基因组DNA文库构建实验技巧
基因组DNA文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。
通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。
一、分离基因组DNA（gDNA）
毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。
研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA
的纯度。
二、处理基因组DNA
根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。
不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。
比如，对于黏粒载体（比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM），合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体（比如Epicentre的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM），平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。
构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA 片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。
构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。
需要注意：
（1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。
用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。
（2）电泳以后，应该避免用紫外光照射目标DNA，紫外光照射DNA 会显著降低克隆效率。
解决方法：把marker所在的部分凝胶切下，在紫外灯下做好记号，
然后以此为参考定位所需的片段。
（3）回收DNA的时候，应该要避免过度离心，以防止DNA被剪切，降低文库质量。
三、载体的选择
目前，常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体（P1人工染色体）、BAC载体（细菌人工染色体）和YAC载体（酵母人工染色体）。
选用何种载体可以参考如下几个因素：
1．目标区域的大小
如果基因组的目标区域很小（小于50kb），那么可以选择黏粒载体甚至是λ噬菌体载体。
利用现有的商品化的黏粒载体、高效率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株，研究者可以方便的构建黏粒载体文库。
如果基因组的目标区域比较大，那么P1、PAC或者BAC就比较合适了。
P1操作比较困难，PAC相对简便。
BAC载体也是很好的选择，研究者可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库，比如EPICENTRE公司的一系列BAC载体及配套试剂盒。
如果目标区域非常大（大于250kb），那么YAC载体就是首选了。
不过，应用YAC载体来构建基因组文库，操作非常繁琐困难，一般由专门的公司来完成。
表1 各种载体的比较
2．筛选文库的难易程度
黏粒载体一般使用传统的滤膜影印杂交来筛选，但是这种方法对于构建区域图谱及叠连群来说既费力又浪费。
大容量载体文库，如P1、PAC、BAC、YAC，以二维阵列保存，既可以用传统的单拷贝的探针杂交法筛选，又可以用PCR进行多克隆的群体筛选。
而且，使用高容量载体构建文库，可以减少染色体步查的步骤。
3.载体拷贝数的考虑：当把大片段DNA片段克隆到高拷贝的载体时，克隆DNA会发生重组，从而影响克隆序列的保真性和稳定性；而单拷贝载体的低产量DNA是高通量分析的瓶颈。
这个矛盾常常困扰着研究者。
而EPICENTRE’s CopyControlTM 克隆系统是对这些困难的最好的解决方案。
CopyControlTM技术整合了单拷贝载体与多拷贝载体的优点。
单拷贝载体能提高插入片段的稳定性，而且拷贝载体能在诱导剂的作用下，即时扩增出高拷贝数的克隆而获得高产量的DNA。
四、将基因组DNA片段连接入载体
使用连接酶把上述大小合适的DNA片段连接入载体。
Epicentre的商业化载体已经经过预处理，可以直接使用，无需内切酶消化及脱磷酸化处理。
连接酶可以选用Epicentre Fast-Link DNA Ligase，连接快、效率高。
连接反应体系以100ul为宜。
注意：BAC载体连接完以后，需要将连接产物做脱盐处理，除去连接反应缓冲液里的盐分。
脱盐可以用Epicentre推荐的Agarose Cone 方法，省时省力，防止DNA被剪切。
五、将重组载体转入宿主细胞
如果使用Epicentre试剂盒构建黏粒文库，需要用Epicentre MaxPlax Lambda Packaging Extracts 来包装上述的连接反应产物，测定包装好的黏粒克隆的滴度，然后转染Epicentre
EPI300-T1?Plating Strain。
挑出重组子，鉴定插入片段的大小。
如果文库的大小和质量都令人满意的话,
就可以铺板进行文库筛选，或者扩增、保存文库。
如果使用Epicentre试剂盒构建BAC文库，应选择电转法，可以选择Epicentre TansforMaxTM EPI300TM Electrocompetent E.coli 作为宿主，将上述连接产物转入细菌，涂板长出克隆后。
获得克隆，研究者需要对BAC克隆的大小进行评估，确定文库大小是否能够满足要求。
Epicentre 文库构建试剂盒中的EPILyse和EPIBlue，快速裂解克隆并电泳，可以方便的鉴定出BAC克隆的大小，从而估计出BAC
文库的大小。
如果文库大小合适，那么这个文库就可以进行后续的操作了。
六、文库克隆数的确定
基因组DNA文库需要包含足够多的克隆，来保证文库的代表性。
一般使用如下的经验公式来确定：
N = ln (1-P ) / ln (1-f ) P是希望得到的覆盖率，f是插入片段
大小与基因组DNA大小的比值，N是所需的克隆数。
举例来说，用BAC载体构建人类基因组文库，人类基因组大小为3 x 109 bp, 插入片段大小为100kb，希望覆盖率99%，那么所需要的BAC 克隆数为
N = ln (1 - 0.99) / ln (1 - [106bp / 3 x 109 bp]) = -4.61 / -3.33 x 10-6 = 138,298
附记：关于基因组学的东西，偶要一点一点的加班加点的学习。