第三章基因组文库的构建
cDNA和基因组文库DNA的构建
结构 环状
线状 环状
E.coli E.coli E.coli 酵母细胞
环状 环状 环状 线性染色体
哺乳动物细胞 动物细胞
环状 环状
动物细胞和细 菌
环状
插入片段 很小,<8kb
9-24kb <10kb
35-45kb 约300kb 100-800kb
1002000kb >1000kb
举例 pUC18/19 ,某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体；cDNA是指含有所有重组cDNA的克隆群体.
基因组：来源于基因组DNA,反映基因组的全部信息,用 于基因组物理图谱的构建,基因组序列分析,基因在染色体上的定位, 基因组中DNA (互补DNA）
第二条DNA链
1：反转录酶催化合成cDNA第一链
• 1 . 1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成： poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl 1mol/L KCl 3.5μl 250 mmol/L MgCl2 2μl dNTP溶液（含4种dNTP,每种5mmol/L） 10μl 0.1 mol/L DTT 2μl RNase抑制剂（选用） 25单位 加H2O至 48μl 1 . 2.当所有反应组在0℃混合后,取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内. 在这个小规模反应管中加入0.1μl α-32P dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）.
4：接头或衔接子的连接
cDNA末端的削平 4.1.cDNA样品于68℃加热5 min. 4.2.将cDNA溶液冷却至37℃并加入下列试剂： 5×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 10μl dNTP溶液,每种5 mmol/L 5μl 加H2O至 50μl 4.3.加入1~2单位T4噬菌体DNA聚合酶（500单位/ml）,37℃温育 15min. 4.4.加入1μl 0.5mol/L ED . 5.在所有四小份样品（来自步骤2和步骤4）加入 100 ng质粒DNA或500 ng的λ噬菌体DNA.这些未甲基化 的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率. 3 . 6.所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37℃ 温育1h. 3 . 7.于68℃加热15min,用酚：氯仿抽提大体积反应液 一次,再用氯仿抽提一次. 3 . 8.在大体积反应液中加入0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠 （pH5.2）和2倍体积的乙醇,混匀后贮存于-20℃直至获 得小样反应结果.
第三章-基因组文库的构建
三、cDNA克隆载体
Zap cDNA克隆载体来自腺病毒系统，属于 噬 菌粒（phagemid）载体。线状的 Zap cDNA克 隆载体在体内能通过噬菌粒获救(phagemid rescue) 变成环状的表达载体。
(a) 噬菌体连续感染两个不同的E.coli 菌株，在这 两个菌株中一个噬菌体不受“限制”，而另一个 受到“限制”。结果,在kanr 菌落中获救，此菌落 中含有多个拷贝的双链质粒。
巨细胞病毒第三节 cDNA的筛选间接用探针筛选噬菌体cDN相关氨基酸密码子的简 并寡核苷酸探针；
（2）纯化蛋白质的相应抗体探针； （3）针对差异表达基因的扣除
cDNA探针。
探针的特异性可通过以下的策略来解决： ①选基因的特异序列为探针； ②长度不低于17～20nt； ③控制片段但酶的选择和酶切反应条件的选择是取决于克隆载体的类型重组噬菌体细胞基因组噬菌体尼龙膜与放射性探针进行分子杂交用放射自显影定位阳性克隆阳性克隆用限制性酶剪切提取dna用限制性酶剪切用连接酶连接重组体dna细菌感库的构建
用体外包装系统将串联体中单个的基因组DNA分 别包装入不同噬菌体头部，形成不同的重组噬菌 体颗粒。
用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬菌斑。每 一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。
各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
限制性
(a)
酶切位点
Alu散在元件
启动子 外显子探针1 启动子启动子
探针2
探针3
将DNA亚克隆到质粒载体中的通用策略
①根据已知的酶切图谱进行定向克隆
（directed cloning）；
②用常用的限制性酶交错剪切或平切进行
随机亚克隆。
这种策略也称为“鸟枪法（shot-gun）”，即将 完整的基因组或部分基因组的DNA用限制性酶 或机械的方法随是将小片段逐一测序，再拼接 成序列图谱。
第三章 cDNA文库和基因组文库
片段
• 缺点： 酶切可能切断cDNA
对策：
利用切点稀少的限制酶
甲基化
• 接头（adapter）
是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，
另一头为平末端的特殊的寡核苷酸片段。
• 可能问题：
接头自身连接
• 解决方法：
接头分子一端磷酸化
具异常的5’-OH粘性末端结构的Bam稀少的限制酶
②dG：dC段可能影响转录和测序
back
同聚物加尾法克隆双链cDNA
通过依次加入、连接 合成的DNA衔接物 进行cDNA克隆
用衔接物分子连接平末端的DNA片段
• 衔接物（linker）
指用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成，具
有一个或数个限制酶识别为点的5% 15000种
• 步骤： ①新鲜材料 ②提取RNA（mRNA） ③第一条cDNA链的合成
反转录酶④第二条cFra bibliotekNA链的合成⑤双链cDNA同载体的连接
置换合成/引物-衔接头法
λgt10/ λgt11
利用oligo（dT）引物和反转录酶合成cDNA第一链
自身引导法合成双链cDNA
双链cDNA的置换合成
引物-衔接头法合成双链cDNA
• 双链cDNA的置换合成缺点：
缺少对应于mRNA5’端的几个核苷酸
• 引物-衔接头法优点： ①利于获得全长cDNA ②利于和载体连接 缺点： ①酶切可能切断cDNA
• 部分酶解片段越大，所需重组体数目越少 • 载体：λ噬菌体 细抑制自身连接 ②基因组DNA不互补，稍短的片段极不可能连接成 带有原基因组上非相邻DNA区段的结构
第3章 基因工程-【必背知识】高二生物章节知识清单(人教版选择性必修3)(教师版)
新人教版生物学选择性必修3《生物技术与工程》知识梳理第三章基因工程第一节重组DNA技术的基本工具基因工程：指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。
从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。
一、分子手术刀—限制性内切核酸酶1.全称和简称全称：_限制性内切核酸酶_简称：__限制酶_2.来源：主要是从_原核生物__中分离纯化出来的3.作用：①能够识别_双链_DNA分子的某种_特定核苷酸序列。
①使_每一条_链中_特定部位_的_磷酸二酯键__断开。
4.作用部位：_磷酸二酯键__5.识别序列：大多数限制酶的识别序列由_6_个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由_4_个、_8_个或__其他数量_的核苷酸组成。
6.切割结果：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式__黏性末端_和__平末端__。
(1)EcoR①限制酶切割EcoR①识别序列为GAATTCEcoR①切割部位为GA之间的磷酸二酯键(2)Sma①限制酶切割Sma①识别序列为CCCGGGSma①切割部位为CG之间的磷酸二酯键二、分子缝合针—DNA连接酶1.功能：将__两个DNA片段连接起来_，恢复被限制酶切开的_磷酸二酯键__。
2.种类E·coli DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只缝合黏性末端缝合黏性末端平末端作用恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键3．比较与名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端三、分子运输车——载体1.作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
基因组文库构建的基本过程
基因组文库构建的基本过程构建基因组文库，听起来是不是有点高大上？其实啊，这个过程就像是做一碗丰富的杂烩，里面有各种各样的成分，味道可好了。
今天就让我们轻松愉快地聊聊这个过程，从头到尾都不复杂，保证让你听完后恍若领悟了宇宙的奥秘！1. 基因组的准备首先，咱们得有“食材”，也就是目标基因组。
想象一下，像个侦探一样，你得先找到你要研究的生物，这可能是一只可爱的青蛙，或者一株神秘的植物。
然后，从这些生物体中提取DNA，这一步就像是把青蛙放在水里，慢慢观察它的变化。
提取DNA的过程其实也没那么神秘，简单来说，就是用一些化学试剂把细胞里的DNA分离出来。
就像剥蒜一样，简单又有效。
接下来，得把提取的DNA切割成小片段。
这就好比在厨房里把食材切成小块，方便后面的烹饪。
这个切割的过程，通常用一些特殊的酶，听上去高端，但实际上就是让DNA变得易于处理。
你可能会想，这么多小块到底怎么存起来呢？别急，接下来就要介绍基因组文库的“容器”了。
2. 构建文库2.1 载体的选择在我们的基因组文库中，载体就像是一个个小小的运输箱，专门用来存放那些切割好的DNA片段。
这里面有各种各样的选择，最常见的就是质粒，这种小圆圈状的DNA 能在细胞中独立复制，真是个省心的好伙伴！当然，也有其他的载体选择，比如病毒载体，听起来就有点神秘，实际上它们也只是利用病毒的特性来运送我们的DNA而已。
2.2 转化过程有了载体后，咱们就可以把这些小DNA片段装进去，进行转化了。
转化就像是给每个小箱子上锁，把它们装上货车，准备运输到指定地点。
通常我们会把这些装有DNA的载体放入细胞中，等待它们“安家落户”。
这一步可有讲究了，要控制好温度和环境，让细胞在“舒适”的状态下接纳这些新朋友。
3. 筛选与鉴定3.1 筛选一旦我们的载体和DNA片段都进了细胞，接下来就是筛选这些“小箱子”了。
这一步可以想象成是在参加一个聚会，大家都是陌生人，但你只想和那些有趣的、能引起你兴趣的人交朋友。
第三章基因工程目的基因的获取分离
用氢氧化钠消化杂合双链 中的 mRNA 链
解离的第一链 cDNA 的 3‘末端就会形成一个发夹环 （发夹环的产生是第一链 cDNA 合成时的特性，原因 至今未知，据推测可能是 由帽子的特殊结构相关）
引导 DNA 聚合酶复制出第 二链，此时形成的双链之 间是连接在一起的
再利用 S1 核酸酶将连接处 （仅该位点处为单链结构） 切断形成平通过几种限制性内切酶切
割，所产生的基因组DNA片段与载体重组并克 隆，由此产N=ln（1DNA片段的出现概率。 f：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。
第一：细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；
mRNA
总RNA
tRNA 第二：第一链 cDNA 合成；
rRNA 第三：第二链 cDNA 合成；
2 合成cDNA第一条链 第四：双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
（1）随机引物引导法
并导入宿主中繁殖。
（2）oligo（dT）引导法
（1）随机引物引导法 5´
链 cDNA 为模板合成一段段互补的序列。同时，大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 3'--5'
cDNA 片段。这些 cDNA 片段进而核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链 cDNA 的
在 DNA 连接酶的作用下连接成一 3'-端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。这
条链，即 cDNA 的第二链
种方法合成的 cDNA 在 5'-端存在几个核苷酸缺失， 但一般不影响编码区的完整。
查阅资料自学！
如何找回两膜或硝酸 纤维素滤膜之后，就可以同特异性
的核酸探针进行菌落或噬菌班杂交，
A 应用核酸探针分离克隆的目的基因 以便筛选出具有目的基因的阳性克 隆。这个过程叫做克隆基因的分离
基因组文库的构建过程
基因组文库的构建过程1. 基因组文库到底是什么？说到基因组文库，很多人可能会一脸懵，觉得这跟他们平常的生活完全扯不上关系，其实这就是科学家们用来储存基因信息的一种方式。
简单点说，就是把所有的基因像书一样整理好，方便后人查阅、研究和利用。
好比我们会把一本厚厚的食谱分门别类，想吃什么菜随时翻出来，这就是基因组文库的妙处。
在它的庇护下，科研人员就能随时拿出各种基因的“身份证”，让小小的基因发挥出超大能量。
2. 构建基因组文库的步骤2.1 提取DNA首先，咱们得从细胞中提取出DNA，这可是整件事情的开端。
就像从果子里挤出果汁，如果不先把果子准备好，你再想喝到果汁，简直是白日做梦。
提取DNA的过程看似简单，但可得小心谨慎，免得“失之毫厘，谬以千里”。
科学家们用各种化学试剂，像是一场小型的化学派对，最终把DNA提取出来，然后像捡到宝一样，小心呵护着。
2.2 进行切割提取完DNA后，接下来就是切割了！没错，听起来有点儿暴力，但这其实是为了让DNA变得更小，方便我们后面进行分析。
科学家们用一种特别的酶，就像料理大厨用刀切菜一样精准，可以把DNA切割成许多小片段。
每一片都是独特的，有点像拼图的每一块，只等着我们组合拼接。
2.3 建库接下来说到建库，小伙伴们要聚焦了！这一步可是整件事的重头戏。
科学家们会把这些切割好的DNA片段拷贝到一种载体中，类似把拼图放进一个大盒子里，当然这个“盒子”可是经过特殊设计，能确保我们的DNA安全无虞。
这个过程就叫做克隆，听起来是不是有点科幻感？别担心，脑子里别想太多电影情节，这可是正儿八经的科学探索。
3. 筛选和验证3.1 筛选目标片段库建完后，接下来就进入了筛选阶段。
就像我们去超市挑水果，总得挑一些看起来新鲜的，基因组文库也是如此。
一些基因有可能因为各种原因不太好，科学家们会通过培养和筛选，把一些很有潜力的基因片段挑出来。
这其中的细致和耐心，简直堪比工匠精神，得一丝不苟。
3.2 验证质量最后一步是验证，就像做一道菜，你不能光有调料，还得保证味道正宗。
文库构建及酵母双杂交技术
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1 基因组文库的构建基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。
理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。
1. 1构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。
1.1.2目前常用的载体： 载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb）1.2 基因文库构建的一般步骤1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。
不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。
1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。
噬菌体载体构建基因组文库第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。
2.1高质量mRNA的制备应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。
将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。
PolyAT tract mRNA 的分离纯化过程第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2.2反转录成cDNA可同时在反转录系统中加入Oligo(dT)12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；应选用活性较高的反转录酶(Reverse transcriptas)；应选用甲基化dCTP；应保证所获得双链cDNA 的方向性。
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体外包装
重组λ噬菌体载体的体外包装有两种不同的策略。一是利 用与编码包装蛋白的基因的突变体。野生型噬菌体的的包
装需要E、D、A等基因的产物，这些基因中的任何一个发
生突变噬菌体都不能顺利包装，从而在宿主的细胞中积累 了大量的前头部蛋白。BHB2688和 BHB2690两种菌株正是这
两种突变菌株，前者是E的突变体，后者是D 基因的突变体。
细胞 基因组 用限制性 酶剪切
用连接酶 连接
λ噬菌体 提取DNA 用限交
膜
重组噬菌体
重组体DNA
细菌 感染
裂解
释放噬菌体菌苔 噬菌体克隆噬菌斑中的 噬菌体克隆用放射自显影 定位阳性克隆 膜
阳性克隆 感染新鲜 的宿主重 组cDNA的集合，通常是在细菌或酵母中。 这些克隆代表从某个特定物种或器官的所 有mRNA制备得到的cDNA。
序列污染； 2.尽可能用“ 电话克隆”。
第一节 DNA克隆片段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化
1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部分离,直接和载 体连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach)
存在的问题：
① 所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段 的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算，
λ噬菌体感染这两种菌株时均不能产生噬菌体颗粒，但将 这两种裂解液合并在一起，由于基因的互补作用，可以产 生成熟的噬菌体颗粒。利用这个原理可以进行体外包装。
另一种思路是利用包装信号的突变体。λ噬菌体的 包装是通过头部蛋白上的A蛋白识别cos区，对由滚 环复制产生的串联体DNA加以剪切，正好将一个基 因组的DNA切下，包装成噬菌体颗粒。如制备cos位 点的突变体，使噬菌体可以合成完整的外壳蛋白， 但却不能包装，而重组质粒上装有正常的cos区， 从而能被包装成噬菌体颗粒。这两种策略都是 λ噬菌体突变体的溶原菌，来制备包装抽提物。
单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考虑到载
体容量，如噬菌体插入片段不超过25kb,为此可 选用识别4bp的限制酶(切割平均长度为256bp) , 识别6bp的限制酶切割平均长度4096 bp.
双酶切产生的DNA片段平均大小不超过 1kb,但如采用双酶部分消化，产物的分 子量可达10～30 kDa,它们存在着随机序 列重叠，用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可 将这些片段群体按大小分开，可得到的 分子量大小约为20kDa的随机D和，通常是建立在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个特 定物种或器官的所有mRNA制备得到的cDNA。它是以细 胞中的mRNA为模板，用反转录酶合成的双链DNA。
组织
mRNA cDNA
甲基化，加接头 的双链 DNA
DNA
部分或完全 消化的 DNA
(b) 噬菌斑的模式被转移到尼龙膜上，而噬 菌体的蛋白被溶解，和重组体DNA分开， DNA吸附到膜上。再将此膜与带有放射 性同位素标记的探针进行分子杂交，可 以杂交的便是目的基因。带有此DNA的 克隆可通过放射自显影而显现出来。这 样阳性克隆可从培养基中分离出来，再 转接到新鲜的宿主菌中，使目的因得到 扩增。
二. DNA片断大小的分部分离：
如已知含目的基因克隆片段的大小范围， 可在克隆前用蔗糖梯度离心或琼脂糖凝 胶电泳将DNA群体按大小分部分离。
三.目的基因克隆片段的富集。
ln(1 I / G)
N:该序列隆(cDNA clone) ：将 cDNA片段装在载体上转化细菌,组中分离单拷贝的基因；的关键： 如何产生足够数量的重组DNA 建库应注意： 1.保证载体DNA和靶DNA均不被外源DNA
载体
( 选择一种)
大小分级
可供克隆的 DNA 片段
连接 DNA 片段和载体
重组载体 DNA 导入 E.coli (体外包装或转化)
基因库的鉴定与央的片段， 再用相同的限制性酶剪切外源基因组DNA，将 约15kb的酶切片段随机地和λ噬菌体载体的两 臂连接，形成线性的重组的串联体。用体外包 装系统将串联体中单个的基因组DNA分别包装 入不同噬菌体头部，形成不同的重组噬菌体颗 粒。用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬 菌斑。每一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一 个克隆。各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
基因库至少含10～30万个重组质粒。从中筛出目的基 因工作量是很大的。
② 目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个 基因分载在 几个重组质粒上，筛出完整基因更不容 易。
2.随机片段化：
超声波：可产生300bp的短片段。
高速搅拌：1500转/分×30分 8kb的分子群体。
可切 平均长度
3.双酶消化