基因文库的构建
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第三章-基因组文库的构建
三、cDNA克隆载体
Zap cDNA克隆载体来自腺病毒系统，属于 噬 菌粒（phagemid）载体。线状的 Zap cDNA克 隆载体在体内能通过噬菌粒获救(phagemid rescue) 变成环状的表达载体。
(a) 噬菌体连续感染两个不同的E.coli 菌株，在这 两个菌株中一个噬菌体不受“限制”，而另一个 受到“限制”。结果,在kanr 菌落中获救，此菌落 中含有多个拷贝的双链质粒。
巨细胞病毒第三节 cDNA的筛选间接用探针筛选噬菌体cDN相关氨基酸密码子的简 并寡核苷酸探针；
（2）纯化蛋白质的相应抗体探针； （3）针对差异表达基因的扣除
cDNA探针。
探针的特异性可通过以下的策略来解决： ①选基因的特异序列为探针； ②长度不低于17～20nt； ③控制片段但酶的选择和酶切反应条件的选择是取决于克隆载体的类型重组噬菌体细胞基因组噬菌体尼龙膜与放射性探针进行分子杂交用放射自显影定位阳性克隆阳性克隆用限制性酶剪切提取dna用限制性酶剪切用连接酶连接重组体dna细菌感库的构建
用体外包装系统将串联体中单个的基因组DNA分 别包装入不同噬菌体头部，形成不同的重组噬菌 体颗粒。
用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬菌斑。每 一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。
各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
限制性
(a)
酶切位点
Alu散在元件
启动子 外显子探针1 启动子启动子
探针2
探针3
将DNA亚克隆到质粒载体中的通用策略
①根据已知的酶切图谱进行定向克隆
（directed cloning）；
②用常用的限制性酶交错剪切或平切进行
随机亚克隆。
这种策略也称为“鸟枪法（shot-gun）”，即将 完整的基因组或部分基因组的DNA用限制性酶 或机械的方法随是将小片段逐一测序，再拼接 成序列图谱。
怎样构建基因组文库
NA分子导入宿主细胞， 让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子机挑取一些转化子或重组子，提取质 粒DNA，电泳量越高，可大大减轻后续 筛选基因工作量。
i. 两菌株分别培养,分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
sa c B
K anr
p a c lo x P
D N A h ea d fu l
+
+ p a c c le a v a g e
p r o te in
C re
R e c o m b ila tio n
DNA
A m p lific a tio n七. 利用YAC载体构建基因组1. 两臂DNA片段的制备:
第四章基因的建立来自基因文全部遗传信息的重组D因组DNA长度之比
S
C o s o r i A pr S
SalI Cos
S
H
S
S1 Cos
H
BamH I 小片段
Cos
H
35-45kb DNA 片 段
T4 DNA ligase
Cos
H
利
构用
建双
COS
基
因
组质
文粒
S
离体包装
S
库载
感 染 E.coli
体六. 利用P1载体构建基因组构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装
i. 两菌株分别培养,分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
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A m p lific a tio n七. 利用YAC载体构建基因组1. 两臂DNA片段的制备:
第四章基因的建立来自基因文全部遗传信息的重组D因组DNA长度之比
S
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Cos
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建双
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组质
文粒
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库载
感 染 E.coli
体六. 利用P1载体构建基因组构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装
基因文库的构建与使用
省石狮石光华侨联合中学３６２７００）
基因工程中，需要将某种生物的遗传信息贮存在 可以长期保存的稳定的重组体中，通常是将目的基因 用适当的工具酶连接到低等微生物如细菌的质粒、噬 菌体等载体上，克复杂的染色体ＤＮＡ 分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的 基因组中将其活跃的化学能储存在ＡＴＰ
中；暗反应是利用光反应产生的ＡＴＰ和ＮＡＤＰＨ把Ｃ０２ 合成糖类等有机物，同时把ＡＴＰ和ＮＡＤＰＨ中活跃的化 学能转变成稳定的化学能贮存在有机物中。 ２．２细胞呼吸生物体的生命活动都需要消耗能量， 这些能量来自生物体内的糖类、脂质和蛋白质等有机 物的氧化分解。细胞呼吸分为有氧呼吸和无氧呼吸两 种类型。有氧呼吸主要在细胞的线粒体中进行，１ｍｏｌ 葡萄糖彻底氧化分解共释放２８７０ｋｊ的能量，其中有 １１６１ｌ【Ｊ左右的能量储存在ＡＴＰ中，其余的能量都以热 能的形式散失了；无氧呼吸释放的能量比有氧呼吸要 少得多，例如，１ｍｏｌ葡萄糖在分饵成乳酸以后，共释放 出１９６．６５ＩｃＪ的能量，其中有６１．０８ｌ【Ｊ的能量储存在 ＡＴＰ中，其余的能量以热能的形式散失了。
・・・・・・・・・・・・・＋？＋・・・・・・・・・・・・・・・・ｔ・・・・・・・・．Ｈ・◆・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・◆－・・・・・。＋＋・位点及选择标记，还具有控制基因表达的序列（如启动子、ＳＤ序 列、Ａ’ｒＧ、终止子等），可在宿主细胞中表达出克隆片段 的编码产物。表达载体又有融合蛋白表是根据蛋白质序列合成的寡核苷酸探针，也可 蛋白质具有 抗原性及生物活性，所以除核酸探针外，还可以用核酸类探针筛选的 目的基因的分离。◆
直接能源
生物体内的直接能源是ＡＴＰ，ＡＴＰ水
解时释放的能量直接用于各项生命活动。而其他形式 的能源物质中所贮存的能量都必须转移到ＡＴＰ中才 能用于各项生命活动。ＡＴＰ与ＡＤＰ之间的转化实现 能量的释放和储存，植物生成ＡＴＰ的途径有光合作用 和呼吸作用，而动物生成ＡＴＰ的途径只有呼吸作用。 １．２主要能源糖类、脂肪和蛋白质等有机物中都含 有大量的能量，这些有机物氧化分解后释放的能量转 移到ＡＴＰ中，用于各项生命活动。但是，生命活动所 利用的能量约７０％是由糖类提供的。所以，糖类是生 命活动的主要能源物质。 １。３储备能源 在生物体内长期贮存能量的物质是 脂肪。脂肪贮存能源的效率最高，１ ｇ脂肪所贮存的能 量是蛋白质和糖类的２倍多，所以在进化过程中，生物 体选择脂肪作为长期贮存能量的物质。 １．４辅助能源 在生物体内的高能磷酸化合物中除 了ＡＴＰ外，还有磷酸肌酸。但是磷酸肌酸中贮存的能 量并不能直接用于各项生命活动，必须转移到ＡＴＰ中 后才能被生命活动利用。生物体全部基使之成为一定大小的片物组织中分离出纯化的基因组ＤＮＡ，用限 制酶进行部分降解或完全降解，得到各种长度的ＤＮＡ 片段；②ＤＮＡ片段与载体连接。常用噬菌体ＤＮＡ作载 体，它既有较高的克隆效率，又可容纳较大的外源 ＤＮＡ片段。用限制性内切酶切割载体ＤＮＡ，使载体形 成与外源ＤＮＡ相匹配的黏性末端。再用ＤＮＡ连接酶 将ＤＮＡ片段与载体连接起来，成为重组ＤＮＡ；③重组 ＤＮＡ的转化和克隆。将重组ＤＮＡ导入受体菌中，进行 体外包装噬菌体进行侵染，或者转化时质粒ＤＮＡ组ＤＮＡ克隆，因此 利用适当的鉴定和筛选方法，就可以从中找到携带所 需要的目的基因片段的重组克隆体。
基因工程中，需要将某种生物的遗传信息贮存在 可以长期保存的稳定的重组体中，通常是将目的基因 用适当的工具酶连接到低等微生物如细菌的质粒、噬 菌体等载体上，克复杂的染色体ＤＮＡ 分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的 基因组中将其活跃的化学能储存在ＡＴＰ
中；暗反应是利用光反应产生的ＡＴＰ和ＮＡＤＰＨ把Ｃ０２ 合成糖类等有机物，同时把ＡＴＰ和ＮＡＤＰＨ中活跃的化 学能转变成稳定的化学能贮存在有机物中。 ２．２细胞呼吸生物体的生命活动都需要消耗能量， 这些能量来自生物体内的糖类、脂质和蛋白质等有机 物的氧化分解。细胞呼吸分为有氧呼吸和无氧呼吸两 种类型。有氧呼吸主要在细胞的线粒体中进行，１ｍｏｌ 葡萄糖彻底氧化分解共释放２８７０ｋｊ的能量，其中有 １１６１ｌ【Ｊ左右的能量储存在ＡＴＰ中，其余的能量都以热 能的形式散失了；无氧呼吸释放的能量比有氧呼吸要 少得多，例如，１ｍｏｌ葡萄糖在分饵成乳酸以后，共释放 出１９６．６５ＩｃＪ的能量，其中有６１．０８ｌ【Ｊ的能量储存在 ＡＴＰ中，其余的能量以热能的形式散失了。
・・・・・・・・・・・・・＋？＋・・・・・・・・・・・・・・・・ｔ・・・・・・・・．Ｈ・◆・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・◆－・・・・・。＋＋・位点及选择标记，还具有控制基因表达的序列（如启动子、ＳＤ序 列、Ａ’ｒＧ、终止子等），可在宿主细胞中表达出克隆片段 的编码产物。表达载体又有融合蛋白表是根据蛋白质序列合成的寡核苷酸探针，也可 蛋白质具有 抗原性及生物活性，所以除核酸探针外，还可以用核酸类探针筛选的 目的基因的分离。◆
直接能源
生物体内的直接能源是ＡＴＰ，ＡＴＰ水
解时释放的能量直接用于各项生命活动。而其他形式 的能源物质中所贮存的能量都必须转移到ＡＴＰ中才 能用于各项生命活动。ＡＴＰ与ＡＤＰ之间的转化实现 能量的释放和储存，植物生成ＡＴＰ的途径有光合作用 和呼吸作用，而动物生成ＡＴＰ的途径只有呼吸作用。 １．２主要能源糖类、脂肪和蛋白质等有机物中都含 有大量的能量，这些有机物氧化分解后释放的能量转 移到ＡＴＰ中，用于各项生命活动。但是，生命活动所 利用的能量约７０％是由糖类提供的。所以，糖类是生 命活动的主要能源物质。 １。３储备能源 在生物体内长期贮存能量的物质是 脂肪。脂肪贮存能源的效率最高，１ ｇ脂肪所贮存的能 量是蛋白质和糖类的２倍多，所以在进化过程中，生物 体选择脂肪作为长期贮存能量的物质。 １．４辅助能源 在生物体内的高能磷酸化合物中除 了ＡＴＰ外，还有磷酸肌酸。但是磷酸肌酸中贮存的能 量并不能直接用于各项生命活动，必须转移到ＡＴＰ中 后才能被生命活动利用。生物体全部基使之成为一定大小的片物组织中分离出纯化的基因组ＤＮＡ，用限 制酶进行部分降解或完全降解，得到各种长度的ＤＮＡ 片段；②ＤＮＡ片段与载体连接。常用噬菌体ＤＮＡ作载 体，它既有较高的克隆效率，又可容纳较大的外源 ＤＮＡ片段。用限制性内切酶切割载体ＤＮＡ，使载体形 成与外源ＤＮＡ相匹配的黏性末端。再用ＤＮＡ连接酶 将ＤＮＡ片段与载体连接起来，成为重组ＤＮＡ；③重组 ＤＮＡ的转化和克隆。将重组ＤＮＡ导入受体菌中，进行 体外包装噬菌体进行侵染，或者转化时质粒ＤＮＡ组ＤＮＡ克隆，因此 利用适当的鉴定和筛选方法，就可以从中找到携带所 需要的目的基因片段的重组克隆体。
基因文库的构建与使用
基因文库的构建与使用在生物科学领域，基因文库的构建和使用是研究基因功能和生物多样性的重要工具。
基因文库是指包含某种生物全部基因的克隆文库，它可以为我们提供深入了解该生物基因组的信息。
本文将详细介绍基因文库的构建与使用，包括基因文库的基本概念、构建方法、使用方法以及优势和展望。
一、基因文库的基本概念和作用基因文库是包含某种生物全部基因的克隆文库，它为我们提供了该生物基因组的全面信息。
构建基因文库的目的是为了方便研究者们筛选、分析和研究基因的功能以及多样性。
基因文库可以用于寻找基因的新颖功能、发现新的药物靶点以及为基因组编辑和改造提供资源。
二、构建基因文库的方法构建基因文库主要包括以下步骤：1、基因组文库的构建：首先需要获得该生物的基因组，然后将基因组进行分解，形成一系列重叠的DNA片段。
这些片段经过纯化、扩增和克隆到特定的载体中，形成基因组文库。
2、表达文库的构建：为了筛选出具有特定功能的基因，还需要构建表达文库。
表达文库中的基因需要在特定的细胞或组织中表达，以便研究者们能够确定基因的功能。
在构建基因文库时，需要考虑到基因的种类、基因表达水平以及克隆载体的选择等因素。
这些因素都会影响到基因文库的质量和实用性。
三、基因文库的使用方法使用基因文库可以方便地筛选和研究基因的功能。
以下是如何使用基因文库的一般步骤：1、选择相应的基因文库：首先需要选择包含所需基因的文库。
如果研究目标是寻找特定功能的基因，可以选择包含该功能基因的文库。
2、筛选候选基因：根据研究目标，可以在文库中进行筛查，挑选出可能具有所需功能的候选基因。
3、验证基因功能：通过实验验证挑选出的候选基因是否具有所需功能。
这可以通过表达和检测候选基因在细胞或整体生物中的功能来实现。
4、利用基因文库进行基因组编辑：基因文库也可以为基因组编辑提供资源和指导。
通过比对和分析基因文库中的序列，可以确定目标基因的精确位置和剪切位点，从而实现精准的基因组编辑。
基因文库的构建
物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA 种类不同（即基因基因组基因的构建程序载体和受体的选择
出于压缩重组克隆的数量，用于基因组构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体
由于绝大多数真核生物的几种载体的最大装载量如下：
质粒
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
ABC
DEF G
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
A
1
1
1
1
B
1
11
1
C
1
1111D Nhomakorabea1
1
11
1
E
1
1
1
1
F
1
1
11
G
1
1
1
1
01 04 12 06 13 14 02 14 07 19 11 15 05 08 16 0的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排 列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息基因的基本概念 基因的构建程序 基因组重组克隆的排序
基因的基本概念基因库与基因
基因库（gene pool） 特定生物e bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式 存序列为探针，进行第二步走 读，直至线型染色体DNA的端点
染色体走读法（chromosome walking）
亚克隆旁测序列
出于压缩重组克隆的数量，用于基因组构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体
由于绝大多数真核生物的几种载体的最大装载量如下：
质粒
01
02
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ABC
DEF G
11
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1
1
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11
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E
1
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1
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基因的基本概念基因库与基因
基因库（gene pool） 特定生物e bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式 存序列为探针，进行第二步走 读，直至线型染色体DNA的端点
染色体走读法（chromosome walking）
亚克隆旁测序列
基因文库的构建
5. 重组 重组cDNA分子的转移和的建立 分子的转移和的建立选用载体为质粒，可直接转化 载体， 选用载体为质粒，可直接转化E.coli；若为 载体，则 ；若为λ载体 需进行体外包装、感染等。 需进行体外包装、感染等。
ds-DNA合成 与SalI匹配 接头相连 NotI酶切
cDNA的段或条件的某种细胞分 定义：
离到的全部mRNA经反转录成 cDNA后再重 经反转录成 离到的全部 后再重 组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。 组和增殖所性
常来自结构基因， 常来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信 且只代表那些正在表达的基因的遗传信息： 息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：1—5% mRNA，80—85% rRNA，10—n(1―p) ln(1―f)
f为某一特定 为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部 为某一特定 （ ） cDNA (mRN1. 载体 载体DNA片段的制备 片段的制备 2. 多聚（A）RNA的分离与纯化 多聚（ ） 的分离与纯化 3. 双链 双链cDNA 的合成
2. 器官特异性
不同器官或组织的功能不一样， 不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的 表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所 表达就具有器官特异性. 代谢或发育特异性
处于不同代谢阶段（或发育阶段） 处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结 构基因表达亦不相同
4. 不均匀性在同一个cDNA中，不同类型的cDNA分 中，不同类是大不相同的，尽管它们都是由单拷 贝基因转 贝基因均有相同的克隆数相较，这是两种文 库的另一差别。 库的另一差别。
NotI primer/adaptor
载体
1)SalI/NotI 2)T4 DNA ligase
SalI adaptor
文库构建
·着丝粒（centromere ， CEN）：有丝分裂过程中纺 锤丝的结合位点， 使染色体在分裂过程中能正确分配到子 细胞中 。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色 体的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。
·自主复制序列（autonomously replication sequences， ARS） 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制 所必须的信号。
（1）对载体的要求
载体容量越大，所要求的DNA片断数目 越少，所需的重组子越少。
（2）目前常用的载体
载体系列： 容量为 24 kp
cosmid载体： 容量为 50 kb
YAC：
容量为 1 Mb
BAC:
容量为 300 kb3. 基因构建的一般步骤 （1）染色体DNA大片段的制备
断点完全随机，片断长度合适于载体连接。 不能用一般的限制性内切酶消化法。
8. 哺乳动物人工染色体（MAC）
哺乳动物人工染色体（MAC）指从哺乳动物细胞中分 离出复制起始区、端粒以及着丝粒构建而成的克隆载体。 它可以克隆大于1000kb的外源DNA片段。
应用领域
（1）有丝分裂和减数分裂对DNA片段大小的定量分析。 （2）研究哺乳动物细胞中染色体功能。 （3）对复杂的基因做功能分析。 （4）用于体细胞基因治疗
yac载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因色氨酸亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因trp1leu2和his3尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等以及赭石突变抑制基因sup4带有赭石突变ade21的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中时可抑制ade21基因的突变效应形成正常的白色菌落
Active domain
·自主复制序列（autonomously replication sequences， ARS） 一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制 所必须的信号。
（1）对载体的要求
载体容量越大，所要求的DNA片断数目 越少，所需的重组子越少。
（2）目前常用的载体
载体系列： 容量为 24 kp
cosmid载体： 容量为 50 kb
YAC：
容量为 1 Mb
BAC:
容量为 300 kb3. 基因构建的一般步骤 （1）染色体DNA大片段的制备
断点完全随机，片断长度合适于载体连接。 不能用一般的限制性内切酶消化法。
8. 哺乳动物人工染色体（MAC）
哺乳动物人工染色体（MAC）指从哺乳动物细胞中分 离出复制起始区、端粒以及着丝粒构建而成的克隆载体。 它可以克隆大于1000kb的外源DNA片段。
应用领域
（1）有丝分裂和减数分裂对DNA片段大小的定量分析。 （2）研究哺乳动物细胞中染色体功能。 （3）对复杂的基因做功能分析。 （4）用于体细胞基因治疗
yac载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因色氨酸亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因trp1leu2和his3尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等以及赭石突变抑制基因sup4带有赭石突变ade21的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中时可抑制ade21基因的突变效应形成正常的白色菌落
Active domain
基因文库构建的过程、原理及方法
基因⽂库构建的过程、原理及⽅法基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤ RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
为此，必须克服仅⽤ mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作⽤特点所导致的局限性。
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基因的构建程序②基因组DNA的制备
为了最大限度保证度的断裂。制备的
DNA分子规方法制备的染色体 DNA的长度一般在100 kb左右 如果先将细胞固定在低融点凝 构建流程
随机引物引导的 cDNA 合成是采用 6－10 个随机 碱基的寡核苷酸短片段来锚定 mRNA 并作为反转录的 起点。 由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个结合 位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特 长的 mRNA 分子的 5‘端序列。 随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建 cDNA 文 库，一般用于克隆特定 mRNA 的 5' 末端，如 RTPCR 和物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA
种类不同（即基因
① 细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离； ② 第一链 cDNA 合成； ③ 第二链 cDNA 合成； ④ 双链 cDNA 克隆
Total RNA的提取 mRNA的分离 cDNA双链的合成 载体的制备 cDNA双链和载体的连接 转化或转染 快速鉴定 pBlueScript cDNA库扩增
5’
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ T4-DNA ligase AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’
5’ 3’
cDNA第二链的合成
引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
G 5‘ppp’5 G
AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ TdT dCTP AAAAACCCCCCCOH 3’ TTTTTp 5’ NaOH TTTTTp 5’
A A A A
白酶K、RNaseA的缓冲液中浸泡，可获得 >100 kb大小的DNA片段基因的构建程序③基因组DNA的切割
用于基因组构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和 限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：
第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区
第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头
方法一：粘末端连在基因组的构建过程中，最好选择转化效率高的
进口感受态细胞和质量稳定的进口包装蛋白！基因组的构建程序基因的构建程序
基因组构建的技术性问题在基因组的构建过程中，最应引起重视的问题是：
严禁外源DNA片段之间的连接！！！基因组的构建流程 cDNA的构建流程
基因的构建程序基因组的构建流程 ① 载体的选择和制备； ② 高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取； ③ 基因组 DNA 的部分酶切与分级分离； ④ 载体与DNA片段的连接； ⑤ 转化或侵染宿主细胞。基因的构建程序①载体和受体的选择
出于压缩重组克隆的数量，用于基因组构建的载体通常选装载量较大的 l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体 由于绝大多数真核生物的几种载体的最大装载量如下： 质粒 l-DNA 考斯质粒 BAC YAC 15 kb 25 kb 45 kb 300 kb 400 kb
3‘ HO
G 5‘ppp’5 G
3‘ HOCCCCCCC 3‘ HOCCCCCCC
退火
3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG TTTTC 5‘ pGGGGGGG
TTTTTp 5’ AAAAAOH 3’
cDrary） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式 存无需mRNA的纯化，不 仅简化操作，而且避免了低丰度DNA克隆。此法对植物基因功能的研究，如对 某种外界因素作用后或不同发育阶段基因表达变化的研 究尤为适用。
部分酶切法一般选用4 碱基识别序列的限制性内切酶，如：
Sau3A或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级
分离，以杜绝不相干的宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重和插入DNA片段连接过程中有两个重要 参数：λ噬菌臂和潜在插入片段的比例、基因组DNA的浓度和 纯度。大约10pgλ噬菌臂和4μgDNA能产生有效地包装06。 5、包装抽提物的包装效率贮存于液氮中可保持1年多。而在70℃中只能保存几星期，而且包装效率还会降低。由于包装 抽提物的质量是一个关键性因素，商业性包装抽提物，例如 Gigapack（Stratagene），都已有商售。这种包装提取物质量 高，且在体外包装λ噬菌体DNA和插入片 一、 RNA 的分离 mRNA 的完整性 mRNA 的丰度 （丰度高用质粒，丰度 低 二、cDNA 第一链的合成 反转录酶：AMV （来自禽成髓细胞瘤病毒）和 MMLV （来自 Moloey 鼠白血病病毒） 引物： Oligo（dT）和随机引物
OH
5’
3’
Klenow
dNTPs TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
S1 TTTTTTTTTTTTTT AAAAAAAAAAAAAA
cDNA第二链的合成
置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺 失 5‘ppp’5 G G
RNaseH AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp DNApol dNTPs AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ 5’
四、双链 cDNA 连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖
同聚物加尾法、人工接头法基因组和cDNA的比较基因组
信息供体 载体 连接前 连接 筛选 DNA 噬菌体，黏粒，人工染色体 部分酶切，分级分离 粘端成cDNA双链 同聚物加尾，库：表达载体（自身引导法 置换合成法 引导合成法
cDNA第二链的合成
自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺 失
G 5‘ppp’5 G
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’
TTTTTTTTTTTTTTp NaOH 煮沸 5’
TTTTTTTTTTTTTTp
双链cDNA的克隆
双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：
平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组 分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 加装人工接头构建流程
Oligo（dT）引导的 cDNA 合成是指 Oligo（dT）引 物与 mRNA 3' 末端的 poly（A）配对，引导反转录酶以 mRNA 为模板合成第一链 cDNA 。 NA 末端存在较长的 poly（A） 成cDNA双链 同聚物加尾，所含克隆数N之间的关系可用下式表示：
N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )
其中/ 生物基因组的大小 例如，人的单倍体D的构建流程
组织
mRNA
cDNA 载体
DNA
部分酶解 DNA DNA长度分级 可克隆之DNA DNA与载体连接 引入宿主细胞
双链cDNA筛选出所需 要的克隆鉴定的完备性扩增后供长 期储存
基因组和cDNA的比较基因组信息供体 载体 连接前 连接 筛选 DNA 噬菌体，黏粒，人工染色体 部分酶切，分级分离 粘端连接，人工接头 核酸探针
为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：
将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 在的关键。基 因组DNA应当非常纯以适应DNA的酶解，而且基因组DNA也应足够 大（最好超过200kb）以获得两个末端的消化产物。 2、不论是载体DNA还是靶DNA不含外源片段是一个基本条件。污染少 量探针顺序或载体的基因组DNA将引起很大麻烦，这是因为在筛选过 程中它们将被鉴定为所要的克隆。 3、部分消化产品应当是一组覆盖整个基因组的随机片段。识别4个碱基 的限制酶要比识别6个碱基酶能产生更随机的插入片段。部分消化所 产生的片段应能连接到设定的载体上。限制酶和部分消化过程应事先 检查。一些批次的酶质量不够高而导致产生的DNA片段末端不能有效 地连接。如果预期结果没有出现，检查限制酶和DNA浓度及纯度。
为了最大限度保证度的断裂。制备的
DNA分子规方法制备的染色体 DNA的长度一般在100 kb左右 如果先将细胞固定在低融点凝 构建流程
随机引物引导的 cDNA 合成是采用 6－10 个随机 碱基的寡核苷酸短片段来锚定 mRNA 并作为反转录的 起点。 由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个结合 位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特 长的 mRNA 分子的 5‘端序列。 随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建 cDNA 文 库，一般用于克隆特定 mRNA 的 5' 末端，如 RTPCR 和物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA
种类不同（即基因
① 细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离； ② 第一链 cDNA 合成； ③ 第二链 cDNA 合成； ④ 双链 cDNA 克隆
Total RNA的提取 mRNA的分离 cDNA双链的合成 载体的制备 cDNA双链和载体的连接 转化或转染 快速鉴定 pBlueScript cDNA库扩增
5’
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ T4-DNA ligase AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’
5’ 3’
cDNA第二链的合成
引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
G 5‘ppp’5 G
AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ TdT dCTP AAAAACCCCCCCOH 3’ TTTTTp 5’ NaOH TTTTTp 5’
A A A A
白酶K、RNaseA的缓冲液中浸泡，可获得 >100 kb大小的DNA片段基因的构建程序③基因组DNA的切割
用于基因组构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和 限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：
第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区
第二，保证DNA片段大小均一 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头
方法一：粘末端连在基因组的构建过程中，最好选择转化效率高的
进口感受态细胞和质量稳定的进口包装蛋白！基因组的构建程序基因的构建程序
基因组构建的技术性问题在基因组的构建过程中，最应引起重视的问题是：
严禁外源DNA片段之间的连接！！！基因组的构建流程 cDNA的构建流程
基因的构建程序基因组的构建流程 ① 载体的选择和制备； ② 高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取； ③ 基因组 DNA 的部分酶切与分级分离； ④ 载体与DNA片段的连接； ⑤ 转化或侵染宿主细胞。基因的构建程序①载体和受体的选择
出于压缩重组克隆的数量，用于基因组构建的载体通常选装载量较大的 l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体 由于绝大多数真核生物的几种载体的最大装载量如下： 质粒 l-DNA 考斯质粒 BAC YAC 15 kb 25 kb 45 kb 300 kb 400 kb
3‘ HO
G 5‘ppp’5 G
3‘ HOCCCCCCC 3‘ HOCCCCCCC
退火
3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG TTTTC 5‘ pGGGGGGG
TTTTTp 5’ AAAAAOH 3’
cDrary） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式 存无需mRNA的纯化，不 仅简化操作，而且避免了低丰度DNA克隆。此法对植物基因功能的研究，如对 某种外界因素作用后或不同发育阶段基因表达变化的研 究尤为适用。
部分酶切法一般选用4 碱基识别序列的限制性内切酶，如：
Sau3A或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级
分离，以杜绝不相干的宜过大 以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重和插入DNA片段连接过程中有两个重要 参数：λ噬菌臂和潜在插入片段的比例、基因组DNA的浓度和 纯度。大约10pgλ噬菌臂和4μgDNA能产生有效地包装06。 5、包装抽提物的包装效率贮存于液氮中可保持1年多。而在70℃中只能保存几星期，而且包装效率还会降低。由于包装 抽提物的质量是一个关键性因素，商业性包装抽提物，例如 Gigapack（Stratagene），都已有商售。这种包装提取物质量 高，且在体外包装λ噬菌体DNA和插入片 一、 RNA 的分离 mRNA 的完整性 mRNA 的丰度 （丰度高用质粒，丰度 低 二、cDNA 第一链的合成 反转录酶：AMV （来自禽成髓细胞瘤病毒）和 MMLV （来自 Moloey 鼠白血病病毒） 引物： Oligo（dT）和随机引物
OH
5’
3’
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cDNA第二链的合成
置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺 失 5‘ppp’5 G G
RNaseH AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp DNApol dNTPs AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ 5’
四、双链 cDNA 连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖
同聚物加尾法、人工接头法基因组和cDNA的比较基因组
信息供体 载体 连接前 连接 筛选 DNA 噬菌体，黏粒，人工染色体 部分酶切，分级分离 粘端成cDNA双链 同聚物加尾，库：表达载体（自身引导法 置换合成法 引导合成法
cDNA第二链的合成
自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺 失
G 5‘ppp’5 G
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TTTTTTTTTTTTTTp
双链cDNA的克隆
双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：
平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组 分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 加装人工接头构建流程
Oligo（dT）引导的 cDNA 合成是指 Oligo（dT）引 物与 mRNA 3' 末端的 poly（A）配对，引导反转录酶以 mRNA 为模板合成第一链 cDNA 。 NA 末端存在较长的 poly（A） 成cDNA双链 同聚物加尾，所含克隆数N之间的关系可用下式表示：
N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )
其中/ 生物基因组的大小 例如，人的单倍体D的构建流程
组织
mRNA
cDNA 载体
DNA
部分酶解 DNA DNA长度分级 可克隆之DNA DNA与载体连接 引入宿主细胞
双链cDNA筛选出所需 要的克隆鉴定的完备性扩增后供长 期储存
基因组和cDNA的比较基因组信息供体 载体 连接前 连接 筛选 DNA 噬菌体，黏粒，人工染色体 部分酶切，分级分离 粘端连接，人工接头 核酸探针
为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：
将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团 在的关键。基 因组DNA应当非常纯以适应DNA的酶解，而且基因组DNA也应足够 大（最好超过200kb）以获得两个末端的消化产物。 2、不论是载体DNA还是靶DNA不含外源片段是一个基本条件。污染少 量探针顺序或载体的基因组DNA将引起很大麻烦，这是因为在筛选过 程中它们将被鉴定为所要的克隆。 3、部分消化产品应当是一组覆盖整个基因组的随机片段。识别4个碱基 的限制酶要比识别6个碱基酶能产生更随机的插入片段。部分消化所 产生的片段应能连接到设定的载体上。限制酶和部分消化过程应事先 检查。一些批次的酶质量不够高而导致产生的DNA片段末端不能有效 地连接。如果预期结果没有出现，检查限制酶和DNA浓度及纯度。