植物凝集素提取工艺
绿豆凝集素提取工艺研究_乃日斯克(1)
行了梯度洗脱和间歇式洗脱。
关键词： 绿豆； 凝集素； 酶保护剂
植物血凝素的提取
植物血凝素也称为植物凝集素（PHA），可自制也可购自商品。
自制的方法常用生理盐水提取法。
（A）干品制备法（1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。
恒温箱内24-48小时；（2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml，再置4℃冰箱内24小时。
每8-12小时摇荡一次。
（也可一次性加100ml生理盐水）；（3）无菌条件下移入10-50ml离心管内，3000-4000rpm30分钟。
在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用；（4）效价：外周血染色体制备每100ml培养基加PHA约2ml。
注：若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。
（B）鲜品制备法：（1）选择完整无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精浸泡10分钟；（2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口；（3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动数次，次日3000rpm30分钟，在无菌情况下分装上清液于10ml小瓶内，置冰箱冷冻层备用。
（4）效价：正式使用前先用一定量作效价测定，按效价使用。
青豌豆的提取：取青豌豆100克，加含0.15M氯化钠的0.01M pH7.0磷酸缓冲液200ml浸泡过夜，经膨胀后用组织捣碎机捣碎，倒入布袋中压榨出水提液，在沉渣中再力0入磷酸缓冲液100ml搅拌，浸泡1时，压榨出水提液，合并水提液，量出总体积。
加0.01％叠氮钠防腐。
2．蛋白质沉淀：边搅边加入固体硫酸铵达80％饱和（每升溶液加硫酸铵561克）冷藏过夜。
吸取上清液，沉淀再用二层滤纸抽气过滤至干，即得粗制青豌豆素蛋白沉淀物硫酸铵糊。
置冰箱保存。
3．亲和层析分离(1)装柱：取直径为1.0 cm，长度为25 cm的层析柱，按（实验十五）操作，自顶部缓缓加入稀薄的Sephadex G25悬液，待凝胶上升至距顶柱约3-5 cm即可，用1M NaCl溶液平衡10分钟。
植物凝集素(PHA)的提取及血凝效果研究
确立 了凝集 素 的血型专一 性 和它 们的糖结 合血 专
一
体 组成 ， 每个 单体 的分子量 为 ２ ～３ Ｄ， 一个 ５ ０Ｋ 有 结合糖 位 点 ＿ Ｊ 凝 集 素 不 仅 具 有 凝 集 诸 如血 ｌ 。 细胞 、 巴细胞 、 子细 胞等 作 用 ， 且 参与 了生 淋 精 而
占蛋 白质 总含 量 的 １ ％左右 ． 由 ２个 或 ４个 单 ０ 它
具 有 较 大 应 用 价 值 ． 油 麻 藤 种 子 中的 凝 集 素 如 （ Ｌ 即 是 一 种 人 Ａ 型 血 专 一 性 的凝 集 素 ＿ 。 Ｍｓ ） ４ 】 Ｐ 利马 豆凝集 素 ） Ａ 型血专 一 ， Ｌ 欧洲 百 Ｉ Ａ（ 对 （
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安徽 技术 师范学院学报， ０２ １ （ ）２ －２ ２ ０ ， ６ １ ：３ ５
ｊ ｕｎ ｌ ｆＡｎ ｕ ｅｈ ｉ ｌ ａ ｈ ｒ ｏｌｇ ｏ ｒ ａ ｏ ｈ ｉ ｃ ｎｃ Ｔ ａ Ｔｅｃ ｅｓＣ ｌ ｅ ｅ
植物凝集素 （ Ｈ 的提取及血凝效果研 究 Ｐ Ａ）
１ ． 试剂 ： ８ ％Ｎａ Ｉ 液 （ １ ３ ０．５ Ｃ溶 生理盐 水 ）
生物 体 内细 胞癌变 、 受精 、 化 及分 子识 别等 生命 分
过程 极其 有 用的工具 ， 同时 作 为一种试 剂 ， 凝集 素
不仅 在ｌ 医学检 验 上 有 着 重要 地 位 ， 且 是抗 临床 雨 肿 瘤药物 （ 干扰 素 、 如 白细 胞 介 素一 ） 产 所需 ２等 生 的促 有丝 分 裂原 Ｌ ７， ３ １国外 近 来还 报道 某 些 凝集 － 素对爱 滋病 毒也 有 抑 制 作 用 ・ 。凝 集 素可 能具
从小雪豆中提取植物血球凝集素(PHA)的实验
ｔ ｃｅ ｒ ｍ ｉ ｍａｌｂ ａ ，ｓｍｉ ｈ ＨＡ ｆ ｍ ｉＨｕ ｏ ａ ｙ，ｃ ｎ ｓｉ ｌ ｔ ｍｐ ｏ ｙ ｅ ｔ ｎ ｆ ｒ ｉｇ ｔ ｙ ｈ ｂ ａ ｔ ｏ — ｒ ｔｄ ｆｏ ｗｈ ｔ ｓ ｌ ｅ ａ ｅ ｎ ｉ ｌ ｔ ｔ ｅ Ｐ ｒ ｒ ａ ｏ ｏ Ｙ ａ ｃ ｍｐ ｎ ａ ｔ ｍｕ ａｅ ｌ ｙ ｈ ｃ ｔ ｒ ｓ ｍ ｎ ｏｌ ｍｐ ｏ ｌ ．Ｃ ｎ ａ ｏ ｓ
加入 自行提取的小雪豆 Ｐ Ａ（ Ｈ 实验组 ） 和上海伊华产 Ｐ Ａ（ Ｈ 对 照组 ） 溶液 ２ ，０ ７ ，０ ５５ ，５ １０和 １０ １ ５ ￣。用 ５ ｌ ｍ 一次性塑料空针抽
不 同植物来源和批号 的 Ｐ Ａ， Ｈ 刺激淋 巴细胞发生核分裂 的效
价也各不相 同， 通过 预实验 以确 定最 佳浓度 。通过 实验 ， 需
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・
４ ２・
中国优生 与遗传杂志 ２ ０ ０ ８年第 １ 卷第 ４期 ６
从 小 雪 豆 中提 取 植 物 血 球 凝 集 素 【 Ｈ 的 实 验 Ｐ Ａ）
贺 再 清 ，刘 燕 鸣 （ 工 业 四 一 六 医院 病 理 科 ，成 都 核 ６０ ５ ） １０ １
Ａ ｓｒｃ ：Ｏ ｊｃｖ ： ｒ ｔ ｅｔ ｃ Ｐ ｒ ｓ ａ ｈｔ ｂａｓｗ ｉ ｏｄｉ ｍ ｒｅ． Ｍｅ ｏｓ ｉｅｐｗ ｅ ｆ ｍａ ｈｔ ｂ ｔ ｔ ｂｅｔｅ Ｔｙ ｏ ｘ ａｔ ＨＡｆ ｍ ｍ ｌ ｉ ｅｎ ｈｃ ｉ ｓｌ ａｋｔ ａ ｉ ｒ ｏ ｌ ｗ ｅ ｈｓ ｎ ｔ ｄ ：Ｆｎ ｏ ｄｒ ｌｗ ｉ ｈ ｏｓ ｌ ｅ
ｃ ｒ ｍｏ ｏ ｕｌｉａｉ ｎ， ｃ ｍｐ ｒ ｄ ｗｉｈ ｔ ｅ ＰＨＡ ｒ ｍ ｕ ｏ ａ ｙ ｃ ｅ ｋ ｎ ｔ ｖ ｌ ａｉ ｎ ａ ｔｇ ｎ Ｒｅ ｕ ｔ ：Ｔ ｅ Ｐ ｈ ｏ ｓ ｍｅ ｃ ｔｖ ｔｏ ｏ ａ ｅ ｔ ｈ ｆｏ ＹｉＨ ａ ｃ ｍｐ ｎ ｈ ｃ ｉ ｇ ｉ ｅ ａ ｕ ｔ ｓ ｍｉ ｅ ． ｓ ｏ ｏ ｓｌ ｓ ｈ ＨＡ ｘ ｅ—
玉竹,黄精凝集素提取纯化
玉竹黄精凝集素的分离纯化凝集素介绍：凝集素是在自然界广泛存在的可以凝集细胞和使糖复合物或多糖复合物沉淀的非免疫来源的蛋白质或糖蛋白,在植物、动物和微生物体中发挥着多种重要的生物学功能。
凝集素已经被应用到细胞间的相互作用,配基和受体的识别,血型的鉴定,淋巴细胞的分布,健康和病理条件下的组织化学研究,肿瘤细胞的识别,细胞的黏附和定位,生物膜信号的传导,增强肌体免疫防御,生物大分子的运输和某种程度上的免疫识别过程。
单子叶甘露糖结合凝集素作为一类研究的比较多的凝集素已在多种植物中被发现,如郁金香、芦荟、风信子等。
而且单子叶甘露糖结合凝集素已经在不同领域引起了越来越多的关注,并且大部分是其抗病毒活性和抗虫特性的生物化学研究和开发。
尤其是近来在免疫缺陷病毒方面的研究,使得单子叶甘露糖结合凝集素的研究意义更加突出。
玉竹凝集素的提取纯化：实验原理：百合科植物玉竹( Polygonat um odorat um ( Mill. ) Druce) 的根状茎经生理盐水浸取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sepharose 柱离子交换层析和Sephacryl S-200 凝胶过滤，即可得到玉竹凝集素的纯品。
实验材料：玉竹;丙烯酰胺(acrylamide) ;氯化铯(Caesium chloride);碘化钾;所用溶液均以双蒸水配制.取玉竹根状茎经高速组织捣碎机粉碎,经3 倍体积生理盐水(0. 9 %NaCl) 浸取、过滤、离心(4°C ,4500r/ min ,30min) 后,向上清液中加入30 %～80 %硫酸铵进行蛋白质分级沉淀,离心收集沉淀并用水充分透析除去硫酸铵得玉竹凝集素粗品。
所得凝集素粗品经pH 4. 6 ,0. 02mol/ L NaAc2HAc 缓冲液平衡透析后,用于CM-Sepharose (2. 6 ×28cm) 柱, 经相同缓冲溶液洗涤后,用0～1mol/ L NaCl 的NaAc-HAc 溶液进行离子线性梯度洗脱,经紫外和凝血活性检测后,收集活性部分,冷冻干燥。
双水相萃取法提取紫花油豆中凝集素
科技文苑双水相萃取法提取紫花油豆中凝集素□鲍宗源布振钱郝晓妤吕晓萌孙靖莹东北农业大学理学院摘要：本文建立了一种从紫花油豆中快速高效分离凝集素的方法，采用PEG-盐双水相体系进行分离，以上相蛋白得 率和纯化倍数作为评价指标，分别考察了（NH4)2S04质量分数、PEG600质量分数和体系p H值三种显著单因素，同时用 SDS-PAGE电泳对其进行检测，探究凝集素在PEG600/(NH4)2S04双水相体系中的分配规律。
结果表明：双水相体系分离 凝集素的最优条件为（体系共5mL) :3mL25%(w/w)的（NH4)2S04溶液、lm L90%(w/w)的PEG600溶液、lm L的粗蛋白提取液、调p H值为7.5,此时上相蛋白得率为42.32%,纯化倍数为3.08。
关键词：紫花油豆；凝集素；双水相萃取由于能够特异性结合单糖、多糖和 糖蛋白，植物凝集素在医学、材料科学 和农学方面览¥了巨大的作用和价值[1]。
紫花油豆（菜豆）是我国东北地区分布 的一种地方性物种。
其中蛋白质含量达 20%以上。
这些蛋白质其合理的氨基 酸组成和较高的凝集素含量，使其具有 较高的营养价值和生物学价值。
作为传统的蛋白质分离方法，硫 酸铵沉淀法也用于提取凝集素。
此方 法的缺点是它耗时长且产量低™。
亲 和层析法大大提高了凝集素的产量，但其工业化成本高且难以扩大生产[3]。
因此，建立一种快速、经济高效的凝 集素提取方法，以提高选择性和产量，降低成本尤为重要。
目前，双水相提取技术也被尝试用 于分离纯化凝集素。
2010年，Nasd_ mento141研究了Canova&^m«7fe/w is凝 集素（ConBr)在PEG600/磷酸盐体系以及PEG600/柠檬酸钠体系中的分 配。
Soares® 研究了在PEG8000/ 柠 檬酸盐体系中，从Canavaft_am«ybmis 种子的粗提取物中提取和纯化ConcanavalinA(ConA)〇Nascimento161采用PEG8000/柠檬酸钠体系从种子中提取凝集素。
植物凝集素（PHA）的提取及血凝效果研究
植物凝集素（PHA）的提取及血凝效果研究安徽技术师范学院,2002,16(1):23--25 journalofAnhuiTechnicalTeachersCollege植物凝集素(PHA)的提取及血凝效果研究于敏王志德董志芳(安徽大学生命科学院,安徽合肥230039)摘要:凝集素是一类具有糖专一性,可促使细胞凝集的蛋白质或糖蛋白,本文通过提取8种豆科植物种子中的凝集素.分别与人的四种血型红细胞悬液发生凝集反应(A 型,B型,O型,AB型),通过血凝反应的强弱程度来验证不同凝集素的血型专一性,并进一步测定其相对含量.关键词:植物凝集素;血凝;提取中图分类号:0.946.1文献标识码:A文章编号:1007—3302(2002)01—0023—03凝集素是一种非免疫源性的蛋白质或糖蛋白,在动物,植物及微生物(如细菌,病毒)中广泛存在,几乎见于各种生活的有机体,并不限于特殊的器官和组织.豆科植物的凝集素在成熟种子中占蛋白质总含量的10%左右.它由2个或4个单体组成,每个单体的分子量为25～30KD,有一个结合糖位点_lJ.凝集素不仅具有凝集诸如血细胞,淋巴细胞,精子细胞等作用,而且参与了生物体内的一些重要生理和药理过程,因此是研究生物体内细胞癌变,受精,分化及分子识别等生命过程极其有用的工具,同时作为一种试剂,凝集素不仅在l临床医学检验上有着重要地位,雨且是抗肿瘤药物(如干扰素,白细胞介素一2等)生产所需的促有丝分裂原L3-71,国外近来还报道某些凝集素对爱滋病毒也有抑制作用?.凝集素可能具有的多种生理生化作用.吸引了生物学科研工作者对其进行探讨.某些凝集素与ABO血型物质直接相关.少数凝集素具有血型专一性,即凝集素在凝集红细胞的反应中,其血凝反应与供血动物的种类和血型有密切关系.对这类自然界存在极少的血型专一性凝集素的性质,结构和功能的研究,不仅具有重要理论意义,雨且对l临床及法医学上血型鉴定收稿日期:2001—12—26具有较大应用价值.如油麻藤种子中的凝集素(MsL)即是一种人A型血专一性的凝集素_4】. PIA(利马豆凝集素)对A型血专一,L(欧洲百脉根凝集素)对.型血专一.Watkin和Morgan确立了凝集素的血型专一性和它们的糖结合血专一性的关系【.1材料和方法1.1材料1.11豆科(Leguminosae)植物之八种种子(I{暂于超市):赤豆.豇豆,花菜豆,多花菜豆,白云豆,黑菜豆,白菜,黄豆.1.1.2新鲜人血(A,B,AB,O四种血型)采于合肥市血防站)11.3试剂:0.85%NaCI溶液(生理盐水)11.4仪器:高速组织捣碎机DS一1(上海标本模型厂);冷冻离心机(上海医用分析仪器厂);光学显微镜XSP一16A(中国江南仪器厂);生物显微镜BHS(日本OLYMPUS公司);7230分光光度计(上海分析仪器厂).1.2方法12.1PHA的提取分别取8种豆子各15g,用生理盐水洗净后加100ml生理盐水吸涨24hr 后,将吸涨的豆子放入组织捣碎机中捣碎5rain, 置4℃冰箱中过夜抽提.将抽提物用四层纱布过滤,滤液5000r/min冷冻离心20min,上清液置24安徽技术师范学院2002每烧杯中4℃保存备用.1.22血凝反应测试(1)2%红细胞悬液的制备:取四种血型的新鲜人血各1Oml,加抗凝剂(柠檬酸钠)1g.用085%的生理盐反复洗涤5次,每次20oOr/rain离心5min,去上清,按红细胞压积用生理盐水配成2%的红细胞悬液.(2)平板反应:用滴管吸取豆类PHA提取液和红细胞悬液各一滴滴于载玻片上,充分混匀,静置1O min,在低倍镜下观察血凝现象,并以085%的生理盐水作对照试验.12.3PHA相对含量测定(1)体积相同试管洗净烘干称重后加入PHA提取液5ml,并以0 85%的生理盐水作对照试验.(2)各管分别同时加入2%的红细胞悬液1ml,摇匀,静置,15min之内观察血凝情况.(3)在某种豆子血凝团最先完全沉淀的同时,取出各管的上液.使其在同一刻度.此时再取2ml于7230分光光度计在620nm时测定光密度值(O13).(4)取出各管的悬浮液后,试管内仅存细胞沉淀团,此时烘干称重.1.2.4凝集程度的判别与记录液体澄清透明血细胞全部凝集于管底或平板底,轻摇可见大的凝块.为高度凝集(卅);液体稍混浊,液体中有明显的凝集物.凝集块较小,为中度凝集(+);液体混浊,仔细观察可看到液体中有很小的凝集块,为轻度凝集(+);液体与对照组相似,血细胞分布较均匀,为不凝集(一).2结果与讨论2.1结果2.1.1血凝反应测试豆类PHA提取液和红细胞悬液各一滴滴于载玻片上,观察结果如表1.表l提取液与四种血型血细胞摄集反应情况注:"一"不凝集+轻度凝集"抖"中度凝集"卅斗高度凝集由表1可以看出除豇豆和红豆的提取液外.其余六种豆子的提取液均可以使四种血型都发生凝集反应,且均未表现出血型专一性.只是发生反应的程度有所不同,其中自云豆效果最强,其中的PHA含量最高.2.12PHA相对含量的测定表2PPIA与血细胞稀释液作用后上清液OD值殛血红细胞凝集沉淀鞫干I 由表2可以看出,在同一条件下,加白云豆提取豫的试管吸收值最小,而红细胞沉淀最多,再次证明,白云豆中PHA含量是最高的.由于四种血型红细胞表面糖链的差异,各种豆子PHA一级结构的细微差异致使四种血型与八种豆子PHA的血凝反应有较太差异.但单从某种血型对八种豆子PHA的血凝反应来看,其结果与表1基本符合.四种血型的红细胞沉淀干重与O.D值呈负相关性,即某种提取液与红细胞悬液反应后的O.16卷第1期于敏等植物凝集索(PHA)的提取及血凝效果研究25 D值大,刚红细胞沉淀干重刚小;反之,().D值小,则沉淀重大.基本上达到了预期效果,但由于各种PHA液中均含杂质,且杂质的量不同,各种PHA液透光能力有一定差异,对()D值测量有一定影响,致使有一些豆类的反差不强.22讨论凝集素能和含有其结合位点互补的糖基的任何细胞结台.由于所有细胞和许多亚细胞结构都能与之结合,细胞凝集是细胞表面的糖分子结合,在细胞表面形面许多相互产叉的"桥"的结果影响凝集反应的因素除了PHA自身性质和细胞表面结构外,外界条件如PH值,离子强度及温度等有较大的影响,本实验用0.85%NaCI配制细胞悬液和提取PHA,从而确保PHA的血凝活性.随着科技的发展,预计将来有更多种类的植物凝集素被发现和提纯.更多的能识别新的特异性糖基的植物凝集素的发现将会使植物凝集素的应用更为广泛.从而为生物学,医学基础研究和临床诊断治疗提供新的手段和新的技术.[参考文献][]王遇群豆类植物凝集索及其对根瘤菌的识别作用[J]植物学通报.2000.17(2):127—132[2]孙册主编凝集索[M]北京.科学出版杜.1984[3]扬远和植物凝集紊的主要生物学作用及应用[J].生物学杂志,1994,(2):I一3[4]曾仲奎油麻腺种子凝集索的纯化及性质研究[J]生物化学杂志.1996,12(3),336—340[5]丁亮豆科植物凝集索对血细胞的凝集反应研究[J].中国细胞生物学第七届学术大会论文选集,1999lI.[6]Isab[eKinneyTcrriradeMirardas∞tos,et.ActivationofT&Bceilsbyacrudeextractofartoc~rpusin.- tegrifoliaismediatedbyaleetindistinctfromjaea[inJImm—noMetlho,1991.140197[7]江红.孙册.轼体动物凝集紊[J】生命的化学,1996,16(5):2B一31[8]FavcroJna1EurJlrranttno[,1993.23:179一l85 AbstrationofPhytohemagglutininandStudyofitsHemagglutininEffectYUMin,WANGZhi-de,DCINGZhi.一fang(SchoolofLiireScience,AnhuiUIrniversity,He{ei230039)Abstract:Phytohemagglufinin(PHA)isakindofproteinorglycoproteinItisabletoagglutini nthe erythrocytesofhumanbloodgroupAbstractPHAfromeightkindsofbeansandhavethemrea ctwiththeerythrocytesoffourhumanbloodgroup(A,.B,AB.O).Thispaperistoillustratebloodgroups pecialPHA anddetermineitscontentaceordingtohemegglutinativeleve1KeyWords:Phytohemagglutinin(PHA);Hemagglutination;Abstration。
大豆凝集素提取工艺研究
９ １ ２ ３ Ａ（ 上海恒 科学仪器有 限公 司） ； 透析袋 （
Ｂ／ ｍｉ ｎ
Ｃ／
３ ０
４
Ｄ
美 国 Ｕｎ ｉ ｎ ａ Ｃ ａ ｒ ｂ ｉ ｄ 公司） ．
１ ． ３ 实 验 方 法
５ ０
６ ０ ７ ０
Ｓ Ｂ Ａ 的提取
将 大豆 粉碎 均 匀后 ， 按 一定 的
化钠 ０ ． ４ ２ ｇ ， 蒸馏 水 ｉ ０ ０ ｍＬ ， 调 ｐ Ｈ 值至 ７ ． ２ ． 过 滤， 高压灭菌 １ ０ ｍｉ ｎ ， 置 ４℃冰箱保存 备用． 第二步 ， 制 备 红 细 胞 悬 浮 液． 取 新 鲜 Ｏ 型 人 血５ ｍＬ， 转 移至盛 有 ２ ０ ｍＬ Ａｌ ｓ ｅ ｖ ｅ ｒ ｓ 液瓶 中 ， 小
大豆凝 集素提取 工 艺单 因素试 验 选 取超 声
型） ， 采 于绥 化市 第一 医院 ．
试剂 凝集 素 标准 品 ， Ｓ ｉ ｇ ｎ ａ公 司生 产 ； 自配
Ａｌ ｓ ｅ ｖ ｅ ｒ ｓ液 ， 红 细胞悬 浮液 ； 试剂 均 为分析 纯．
１ ． ２ 仪 器 与 设 备
时间、 超声 功 率 、 硫 酸铵饱和度、 ｐ Ｈ 值 四个 因 素 进行 单 因素试 验． 按 表 １条 件 试 验 ，Ａ 代 表 超 声 功率， Ｂ代 表 超 声 时 间 ， Ｃ代 表 硫 酸 铵 饱 和 度 ， Ｄ 代表 Ｐ Ｈ值 （ 以下 同） ．
心混匀 后置 ４℃ 冰箱保 存备 用． 第三步， 血凝 效 果 测定 ． 取 用 Ａｌ ｓ ｅ ｖ ｅ ｒ ｓ液保 存 的新 鲜 Ｏ 型血 ５ ｍＬ， 加入 ０ ． ８ ５ 氯化 钠 溶 液
８ ｍＬ， 缓慢 混匀 ， １ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ离 心 ５ ｍｉ ｎ ， 弃去 上
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植物血凝素也称为植物凝集素（PHA），可自制也可购自商品。
自制的方法常用生理盐水提取法。
（A）干品制备法（1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。
恒温箱内24-48小时；（2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml，再置4℃冰箱内24小时。
每8-12小时摇荡一次。
（也可一次
（3）无菌条件下移入10-50ml离心管内，3000-4000rpm30性加100ml生理盐水）；
分钟。
在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用；（4）效价：外周血染色体制备每100ml培养基加PHA约2ml。
注：若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。
（B）鲜品制备法：（1）选择完整无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精浸泡10分钟；（2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口；（3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动数次，次日3000rpm30分钟，在无菌情况下分装上清液于10ml小瓶内，置冰箱冷冻层备用。
（4）效价：正式使用前先用一定量作效价测定，按效价使用。
青豌豆的．提取：取青豌豆100克，加含0.15M氯化钠的0.01M pH7.0磷酸缓冲液200ml浸泡过夜，经膨胀后用组织捣碎机捣碎，倒入布袋中压榨出水提液，在沉渣中再力0入磷酸缓冲液100ml搅拌，浸泡1时，压榨出水提液，合并水提液，量出总体积。
加0.01％叠氮钠防腐。
2．蛋白质沉淀：边搅边加入固体硫酸铵达80％饱和（每升溶液加硫酸铵561克）冷藏过夜。
吸取上清液，沉淀再用二层滤纸抽气过滤至干，即得粗制青豌豆素蛋白沉淀物硫酸铵糊。
置冰箱保存。
3．亲和层析分离
(1)装柱：取直径为1.0 cm，长度为25 cm的层析柱，按（实验十五）操作，自顶部缓缓加入稀薄的Sephadex G25悬液，待凝胶上升至距顶柱约3-5 cm即可，用1M NaCl溶液平衡10分钟。
（2）加样并收集：称硫酸铵糊0.3克溶于 3 ml IM氯化钠中，离心3000rPm10分钟，取上层悬液上柱，用1M NaCl洗脱收集每管 3.5 ml，在280 nrn紫外光上比色检测，直至吸光值下降到接近零为止。
此洗脱峰为不与葡萄糖亲和的杂蛋白峰。
改用含0.2M葡萄糖的1M NaCl进行洗脱。
收集每管 3.5 ml，也在280nrn处检测、直至吸光值下降至接近零为止。
此洗脱峰为青豌豆素峰，再用1M NaCl 洗脱，再生柱，约需10分钟。
4．青豌豆素生物活性测定。
取新鲜兔血l ml于抗凝管中，离心去除血浆，血球用生理盐水洗涤离心1000rpm ／5min三次，直至洗液无血色为止，加生理盐水稀释20倍制成兔红细胞悬液，
置冰箱中备用。
取点滴板一块在三孔中分别滴入对照生理盐水、280 nrn吸收峰的吸光值相同的杂蛋白和青豌豆蛋白各2滴（用生理盐水将二种蛋白质稀释到吸光值相同），再分别滴入兔红细胞悬液1滴。
置37℃保温10分钟，取出后分别用玻棒在孔中轻轻搅动，比较三者红细胞的凝集情况。
再将杂蛋白和青豌豆素溶液进一步用生理盐水稀释成1：5、l：25、l：125、1：625……再用上述方法检查比较它们对兔红细胞的凝集作用，求出它们最大生物活性的稀释倍数。
兔红细胞的凝集作用也可用显微镜下进行观察、比较。
注意事项：
不同蛋白质凝集活性的比较需在以相同280 nrn吸光值的蛋白质量作对比，故必需稀释。