蛋白质工程(1)

蛋白质工程：以蛋白质的结构与功能为基础，利用基因修饰或基因合成而改造现存蛋白质或组建新型蛋白质的现代生物技术，是基因工程的深化和发展。

蛋白质结构：一级结构：蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序。

二级结构：一段连续的肽单位借助氢键排列成具有周期性结构的构象。

三级结构：蛋白质多肽链在各种二级结构的基础上，进一步盘曲折叠形成具有一定规律的三维空间。

四级结构：由两条或两条以上具有独立三级结构的多肽链组成的蛋白质的寡居蛋白，通过肽链间的次级键相互结合形成的空间结构。

蛋白质超二级结构：相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成规则排列的组合体，以同一结构模式出现在不同的蛋白质中，这些组合体称为超二级结构，或结构模体。

结构域：指二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体。

结构域是蛋白质折叠中的一个结构层次，介于超二级结构和三级结构之间，是蛋白质三级结构的基本单位，也是蛋白质功能的基本单位。

蛋白质变性：天然蛋白质分子受到某些物理因素（热、紫外线、高压）或化学因素（有机溶剂、脲、胍、酸、碱）的影响，引起蛋白质天然结构的破坏，导致生物活性的降低或完全丧失。

蛋白质折叠：蛋白质因所含氨基酸残基的亲水性、疏水性、带正电、带负电……等等特性通过残基间的相互作用而折叠成一立体的三级结构。

蛋白质定向进化：在实验室中模仿自然进化的关键步骤-突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效地改造蛋白质，使之适于人类的需要。

蛋白质的分子设计：蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案，确保获得比天然蛋白质性能更加优越的新型蛋白质。

第二遗传密码：氨基酸顺序与蛋白质三维结构之间存在着对应关系，人们称之为第二遗传密码或折叠密码。

蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引入或去除，而使蛋白质一级结构发生改变的过程。

蛋白质组：基因组表达全部蛋白质及其存在方式，或基因组、一个细胞或一种生物表达的所有蛋白质。

蛋白质组学：定量检测蛋白质水平上的基因表达，从而揭示生物学行为，以及基因表达调控的机制的学科。

双向电泳：是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。

蛋白质芯片：也叫蛋白质微阵列，是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。

噬菌体表面展示技术：噬菌体展示技术是将外源基因或一组一定长度的随机寡居核苷酸片段克隆到特定的表达载体内，使其表达产物与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌体表面。

基因工程抗体：利用基因重组技术对编码抗体的基因按不同需求进行加工改造和重新装配，引入适当的受体细胞，由其编码产生出预期的抗体分子。

抗体酶：通过改变抗体与抗原结合的微环境，并在适当的部位引入相应的催化基团，所产生的具有催化活性的抗体。

既有抗体的高度选择性，又有酶的高效催化效率。

单克隆抗体：由一种抗原决定簇激活，并具有相应抗原受体的B细胞产生的针对这一抗原决定簇的抗体。

激光捕获显微切割技术：LCM是直接从冰冻或石蜡包埋肿瘤组织切片中获取细胞。

它是用乙烯醋酸盐聚合体膜覆盖在被选择的细胞上，然后用红外激光熔化膜，这时膜与组织在目标位置牢固结合，当膜被提起时，仅目的细胞留在膜上。

1、什么是蛋白质的分子设计及分子设计的分类和目标？蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案，确保获得比天然蛋白质性能更加优越的新型蛋白质。

主要目的有两个：一是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和指导性信；二是探索蛋白质的折叠机理。

2、蛋白质修饰的反应类型及修饰部位？蛋白质修饰的反应类型：烷基化反应、酰化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应。

修饰部位：巯基的化学修饰、氨基的化学修饰、羧基的化学修饰、二硫键的化学修饰、其他侧链基团的修饰。

3、蛋白质分离纯化的一般步骤？1选择实验材料2实验材料的预处理3蛋白质的提取4蛋白质粗分级5蛋白质细分级6蛋白质的鉴定4、蛋白质细分离技术：亲和层析原理：利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。

只有目标蛋白能与配体专一性结合，之后改变洗脱条件将目标蛋白洗脱下来。

离子交换层析的原理：蛋白质是两性分子，在一定的pH条件下带有电荷，不同的蛋白质所带有电荷的种类和数量不同，因此它们与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。

这样，当蛋白质混合物流经带电凝胶时，电荷吸引作用小的蛋白质先流过，而电荷吸引作用大的蛋白质后流过凝胶，从而把不同的蛋白质分开。

·离子交换柱组成：惰性支持物、带电基团、平衡离子。

凝胶层系（分子筛层析）原理：以多孔性凝胶材料为支持物，根据通过溶液中蛋白质受到的不同阻滞作用而流出的先后顺序，达到分离纯化蛋白的目的。

·凝胶的种类：葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯凝胶、多孔玻璃珠。

蛋白质电泳：两性电解质的蛋白质，由于在一定PH条件下所带电荷不同，在电场中的移动速度不同而被分离开。

·用于分离纯化：聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳。

5、双向电泳的原理？双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同采用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。

6、蛋白质组的组学概念？它的核心研究技术有哪些？蛋白质组学：定量检测蛋白质水平上的基因表达，从而揭示生物学行为（如疾病过程和药物效应），以及基因表达调控的机制的学科。

核心研究技术：蛋白质分离技术：激光捕获显微切割技术、二维凝胶电泳技术，高效液相层析蛋白质分析和鉴定技术：图谱分析技术、生物质谱技术、同位素亲和标签、表面增强激光解吸附电离飞行时间质谱、荧光差异凝胶电泳、多维液相层析-质谱技术。

7、重叠延伸PCR技术的主要原理重叠延伸PCR技术由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起。

8、酵母双杂交技术的原理、应用及缺陷？原理：很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（BD）与转录激活域(AD)，这两个结构域各具功能，互不影响。

转录因子通过BD和AD分别与DNA上特异的序列结合，从而启动相应基因的转录反应。

应用：1 检验一对功能已知蛋白间的相互作用；2 研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域；3 研究蛋白质之间相互作用的传递途径；4 分析新基因的生物学功能。

1、蛋白质设计的基本原则：活性设计：考虑被研究蛋白质的功能，涉及选择化学基团和化学基团的空间取向。

对专一性的设计：设计化学基团与底物专一性结合。

Scaffold：即框架设计，对蛋白质分子的立体设计。

疏水基团与亲水基团需合理分布：不仅使暴露在外的残基具有亲水性、埋藏在内的残基具有疏水性，而要安排少量的疏水残基在表面，少量亲水残基在内部。

因为蛋白质分子的侧链不总是完全的亲水或完全的疏水。

最优的氨基酸侧链几何排布：侧链构象在折叠状态是一种能量最低的构象。

在构建蛋白质模型时满足所有合适的几何要求，并满足蛋白质折叠的几何限制。

2、蛋白质设计的基本程序（1）收集相关蛋白质的结构信息：收集待研究蛋白质一级结构、立体结构、功能结构域及与之相关的同源蛋白质等相关数据，为蛋白质分子设计提供依据和蓝本。

（2）建立所研究蛋白质的结构模型：测定蛋白质的三维结构。

（3）结构模型的生物信息分析：分析确定其三维结构的特点、功能活性区域及分布、结构中存在的二硫键数目和位置，为选择设计目标提供依据。

（4）选择设计目标：确定所要建造的三级结构，找出对所要求的性质有重要影响的位点或区域。

（5）序列设计：要充分考虑氨基酸残基形成特定二级结构的倾向性。

（6）预测结果：选择好氨基酸残基后，通过理论预测方法预测出所的多肽的二级结构和三级结构，初步检验设计的正确程度，检验目标模型和预期目标的吻合程度，并在此基础上加以调整和更正，使得目标模型达到预期的目标。

（7）获得新蛋白质：通过基因工程手段，认为合成或改造基因，实现蛋白质的改造，然后进行基因表达，并分离纯化获得新蛋白质分子，为进行新蛋白质功能的检验提供材料。

（8）新蛋白质的检验：是否存在蛋白质多聚体状态；二级结构与预期的是否吻合；是否具有三级结构；新蛋白质是否具有功能活性。

（9）完成新蛋白质设计：通过实验手段验证设计的蛋白质分子是否符合要求，并对设计的蛋白质分子进行结构与功能的评价，在根据设计出的结果，进行多轮反复设计、修改、试验，直至达到预期的设计目标。

3、基因融合的原理与为什么要发展基因融合？原理：将第一个蛋白基因的终止密码子删除，在街上带有终止密码子的第二个蛋白或多肽的基因，实现两个基因的融合表达。

发展基因融合：①通过与一特异性蛋白质或其特异的结构域形成融合蛋白，可使表达产物得到有效的回收、纯。

②通过与具有不同功能的蛋白质融合，产生新的多功能蛋白；③与报告分子，如β-半乳糖苷酶(LatZ)、β-葡萄糖苷酸酶(GUS)、分泌型胎盘磷酸酯酶(SSEAP)、萤火虫荧光素酶(LUC)、绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白，应用于蛋白定位及转基因动物；④外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解，有时可以通过产生融合蛋白避免目的产物被快速降解，从而稳定表达产物的产率。

特别是表达一些小肽基因时，这是一个策略；⑤通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，如与硫氧化还原蛋白形成融合蛋白，改变在细胞内的溶解性，防止包涵体的产生；⑥通过与特定肽段进行融合表达，可以将表达的外源蛋白质定向定位在宿主的不同区域；⑦通过同特定蛋白先形成融合蛋白，然后再通过体外切割除去融合部分，是获得蛋白的可靠可重复方法。

4、根据蛋白质理化性质所采用的不同分离方法：①蛋白质的分子大小：透析、超过滤、分子筛层析、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等就是依据蛋白质分子大小进行分离纯化蛋白质的；②蛋白质的带电特性：，等电点沉淀、离子交换层析、等电聚焦电泳等都是以此为依据来分离纯化蛋白质；③蛋白质的溶解特性：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级分离等均依据此原理④蛋白质的变性与复性：尿素变性复性⑤蛋白质的结晶：结晶再结晶法⑥蛋白质分子表面的特性：吸附层析⑦蛋白质的分子形状：亲和层析⑧蛋白质的紫外吸收：蛋白质中的芳香性氨基酸，主要是苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸，它们的芳香侧链在紫外区域(200～300nm)具有较的紫外吸收，据此可以测定蛋白质含量⑨蛋白质的颜色反应：具有特殊侧链的氨基酸残基与一些化学试剂反应呈现特定的颜色，如精氨酸胍基的坂口反应、酪氨酸酚羟基的米伦反应等。